测量生物材料的空间和方向变化光散射

摘要

我们提出一种非破坏性方法，用于采样结构复杂材料中散射光方向的空间变化。通过保持材料完整，我们既保留了宏观尺度的散射行为，同时利用高分辨率成像同步捕捉到微观尺度的方向性贡献。结果可在软件中以生物学相关的位置和尺度进行可视化。

摘要

光与生物体表皮的相互作用发生在多种空间尺度上。例如，在具有虹彩的鸟类中：纳米尺度的结构产生颜色；羽枝和羽小枝的毫米尺度结构主要决定了反射光的方向性模式；而通过重叠、弯曲羽毛所形成的宏观尺度的空间结构，这些方向性效应进一步形成了视觉纹理。毫米尺度和宏观尺度的效应共同决定了在生物体身体的哪些部位、从何种视角以及在何种光照条件下能够观察到虹彩颜色。因此，仅用纳米尺度结构不足以充分解释蜂鸟虹彩喉部发出的高度定向的耀眼色彩，仍存在未解的问题。从某一特定观察点来看，羽毛的哪些毫米尺度结构单元被定向以强烈反射光线？某些物种是否比其他物种提供了更宽广的虹彩观察“窗口”？这些问题以及类似问题也可应用于所有为信号传递、伪装或其他目的而进化出特定表面外观的生物体。

为了研究羽毛散射光的方向性模式及其与鸟类毫米级形态的关系，我们开发了一种通过在不同照明和观测方向下拍摄大量高分辨率照片来测量生物材料散射光的实验方案。由于我们测量的是随方向变化的散射光，因此能够观察到特定羽毛散射光方向分布中的特征；又因为我们的图像能够分辨羽枝和羽小枝，故可明确地将这些方向性特征归因于不同的毫米级结构。保持样本完整可保留自然界中存在的宏观散射行为。本文所述方法提供了一种通用的实验流程，用于在多个结构尺度上分析复杂生物材料的空间和方向依赖性光散射特性。

引言

生物体表皮的颜色和图案在大多数动物类群中均具有重要的生态学和社会学功能。这些表型特征由光与表皮结构的相互作用决定，表皮结构可表现出光学散射，其散射特性在空间上具有变化 空间上 （在体表表面分布）以及 定向地 （随着光照和观察方向的改变）。在羽毛等复杂的生物材料中，光散射的方向受到毫米级重复几何结构取向的影响。这些毫米级结构本身可能嵌有纳米级结构（如黑色素阵列），而这些纳米结构通常继承了毫米级结构的取向。从纳米到宏观尺度，表皮结构在功能上已进化以增强生物体的信号传递能力。为了评估不同尺度形态结构对整体外观的影响，需要具备灵活的工具来测量和分析生物结构的颜色，以在不同放大倍数下分离出特定方向的光散射信号。

我们开发了基于图像的测量工具，用于研究羽毛复杂且多样的毫米级形态结构（羽枝羽轴、远端羽小枝和近端羽小枝）如何扩展仅由纳米级结构所能实现的光学表达范围。在相机拍摄的单幅图像中，我们观察到光在羽毛表面不同位置的反射情况存在差异，即光反射具有空间变化性。当我们改变光源和相机相对于羽毛的方向时，发现反射特性也随之改变，即光反射具有方向变化性¹。基于这些观察，我们设计了一套实验方案，利用球形支架系统^2,3系统性地围绕样本调整光源和相机的位置，从而获取两个维度的表面位置（X 和 Y）、两个维度的光照方向（纬度和经度）以及两个维度的相机观测方向（纬度和经度）（图2）。在软件中，我们以可视化方式探索了散射光在位置、照明方向和观测方向这六个维度上的变化特性。

以往关于表皮反射率的研究过于频繁地忽视了方向性的作用—— 例如 漫反射与镜面反射，或各向同性与各向异性反射——对颜色表达的影响。大多数颜色测量方法均固定入射光、物体和观察几何结构，以精确避免方向性效应。例如，为消除颜色测量中的镜面反射，通常将光源垂直于表面照射，并在与法线成45°角的方向记录反射率。那些确实将形态结构与方向依赖性反射关联起来的研究，通常聚焦于纳米尺度及其产生的虹彩效应。^4-8很少有人考虑微米、毫米和宏观尺度几何结构对远场光学特征的贡献^8-11因此，通常采用光探测器来收集感兴趣区域内的反射光，该区域可能包含多个微米级和/或宏观结构，例如羽枝、羽小枝，甚至整个羽毛^6,8,11-17当感兴趣区域小于探测器的分辨率极限或与探测器视场形状不一致时，常规方案要求对样本进行解剖，以分离出特定毫米尺度结构所产生的光散射信号^8,10,13,15.

我们开发了一种更为全面的测量获取与可视化方案，旨在促进对以往许多集中式研究中常被忽略的多种变量进行探索。我们通过在系统设置的光源与观测方向下拍摄大量高动态范围、高分辨率的照片，实现对空间中某一区域及球面各个方向上的光散射进行测量。我们采用高分辨率成像传感器，其配备有由精细像素探测器组成的二维阵列。硬件层面的信号聚合发生在像素级别，其尺度小于我们所测量的毫尺度结构单元。第二阶段则在软件中对单个像素进行聚合，用户可根据需要选择感兴趣区域的形状与大小。因此，单次测量所得的数据集可在软件中被反复分析，以探究材料在多个生物学相关位置与尺度下与光相互作用的不同特性。通过避免解剖操作并实现对整根羽毛的测量，本方案具有保留羽片形态完整性的优势，从而维持其自然结构与功能，即光与内部毫尺度组分结构之间相互作用的真实状态。

生物体结构产生的光散射具有多维性，难以量化。目前尚无单一仪器能够将测得的六维光散射数据归因于多尺度层级结构中的特定形态。但我们在此方向上已迈出重要一步。我们开发了一种综合三种互补方法的工具——利用龙门架系统采样反射率、在软件中探索大规模数据集、以及通过图形可视化数据子集——从而扩展了我们在材料任意位置测量六维光散射的能力，精度可达毫米级尺度。随着包括我们在内的研究方案逐步推广应用，我们预测生物学家将识别出大量在方向和空间上变化的性状，以及发育多尺度下的相应结构适应。利用这些工具，我们正在表征毫米级结构在方向性和空间表达上的信号潜力，并希望揭示其适应性意义。我们探讨一系列问题，例如：从任意给定观察点出发，羽毛的哪些微细结构或宏观区域具有强反射？微细结构的取向如何影响散射光的方向？何种形态条件会产生丝缎般的光泽，而非亮片般的虹彩闪烁？某些物种是否比其他物种产生更宽的虹彩观察“窗口”？这些问题不仅适用于鸟类及其羽毛，也适用于其他任何因信号传递、伪装或其他原因而演化出特定表面外观的生物体。

方案

使用我们的方法测量样品时，实验人员必须确定一组相机和光源方向，对于每组相机与光源方向的组合，相机将以不同的快门速度进行多次曝光。移动相机会增加额外的处理工作，因为它会改变图像中样品的视角，因此我们通常使用较少的相机方向和较多的光源方向。

在以下详细方案中，我们首先描述如何使用多个光源方向和单一相机方向进行测量，以及如何处理和可视化所得数据（方案1）。在主方案中，当单个视角足以观察所研究的现象时，可单独使用该方案，我们始终将相机视角保持与样品垂直（图1中的主流程）。当需要多个相机方向时，所得的倾斜视角图像可以通过图像变换来消除相机移动造成的影响，从而将图像精确地与标准垂直视角对齐。为了计算这些变换，我们执行额外的校准步骤，利用放置在样品周围的标定目标的观测结果，精确确定相机相对于样品的运动。方案2详细说明了该校准过程，并解释了如何选择参数并多次运行方案1，以从多个视角采集数据（图1中的辅助流程）。最后，方案3详细说明了在数据处理过程中，为校正倾斜视角而必须插入到方案1中的额外步骤。

1. 在入射方向球面上测量沿表面法线方向的散射光（图1中的主程序）

1. 准备并安装待测物体
   1. 准备一块带有½英寸孔径的薄铁金属安装板，孔径周围环绕一圈目标标记（如图2所示）。
   2. 准备待测材料。若测量羽毛，则梳理羽枝，纠正任何未闭合或错位的羽片区域。
   3. 将物体表面（羽毛正面）贴合在安装板背面（与目标环相对的一侧）。
   4. 将感兴趣区域居中对准板上的½英寸孔径。
   5. 将一张带有5/8英寸孔径的磁性膜贴在物体背面（羽毛反面），从而将物体压平紧贴于板上。
   6. 对齐膜上的孔径与板上的孔径，避免表面发生剪切。被圆形孔径边缘固定的展平表面形成一个大致与板表面共面的宏观平面。
2. 配置龙门架系统
   1. 将圆形孔径中心定位在龙门架坐标系的原点。
   2. 在龙门架外臂上安装光源。将光线对准物体并进行窄聚焦，确保在所有光源角度下孔径区域均被均匀照明。
   3. 在龙门架内臂上安装相机。调整相机距离和微距镜头焦距，直至目标环充满传感器宽度。
   4. 校准相机和灯臂的旋转运动（θ,φ）。相对于物体表面法线校准倾角（θ），使得当θ = 0时，相机与光源与表面法线对齐。将相机的方位角（φ）与光源的方位角校准。由于后续可在实验流程中旋转图像，绝对方位角方向并不关键。
3. 配置相机对焦与曝光
   1. 旋转相机，使物体以掠射角被观察。减小f数以最小化景深（DOF），然后将焦平面设在孔径中心。增大f数以增加景深，直到环绕孔径的目标环清晰对焦。可能需要在衍射模糊与景深引起的模糊之间进行权衡。
   2. 将颜色标准板紧贴安装板固定。对于RGB图像，使用Macbeth色卡；对于紫外-可见-近红外（UV-visible-NIR）测量，使用Spectralon标准板。
   3. 以RAW格式拍摄颜色标准板图像。计算各颜色通道乘数以实现图像白平衡。
   4. 确定在最极端观测和照明方向下覆盖场景动态范围的曝光区间。
   5. 对于曝光区间中的每个曝光时间，通过盖上镜头盖曝光传感器获取一幅暗噪声图像。
4. 从稀疏采样的入射方向球面采集测量数据
   1. 将相机轴线置于垂直于表面平面的位置 {θ,φ}={0,0}。
   2. 使光源在球面上一系列均匀分布的位置间逐步移动，采用粗略采样（例如 少于500个点）。
   3. 对于采样中的每个入射光方向：
   4. 针对曝光区间中的每个曝光时间，拍摄一幅RAW图像。
   5. 拍摄一幅由相机自带闪光灯照明的单幅图像，闪光灯与较短曝光时间同步，以抑制龙门架光源的照明影响。
   6. 推进至下一个入射光方向并重复上述步骤。
5. 处理稀疏采样球面的测量数据
   1. 使用dcraw^a的调试（文档）模式禁用其去马赛克功能，将RAW格式转换为灰度、16位、线性、PGM格式：
      1. 每个暗噪声曝光图像。
      2. 每个入射光方向下物体的每次曝光图像。
   2. 将所有在龙门架光源照明下的低动态范围（LDR）灰度曝光图像合成为每个入射光方向对应的单幅高动态范围（HDR）彩色图像。
      1. 从每个LDR曝光图像中减去对应的暗噪声图像。
      2. 对每个LDR曝光图像进行去马赛克处理，得到四分之一尺寸的图像。
      3. 使用步骤1.C.3中计算出的颜色通道乘数对每个LDR曝光图像进行白平衡。
      4. 通过将每个像素位置的所有数值相加，并除以曝光时间之和（排除过曝像素），将去除了暗噪声的LDR曝光图像合并为单幅HDR图像。
      5. 以半精度浮点和无损小波（PIZ）压缩编码方式，将HDR图像存储为EXR格式。
   3. 如果相机方向不是标准方向，或该测量运行属于多相机方向集合的一部分（参见图1中的次级程序及协议2）：
      1. 将每个入射光方向下闪光灯照明的跟踪目标的单幅LDR灰度曝光图像转换为去马赛克、四分之一尺寸、LDR彩色图像，并保存为EXR格式。
      2. 按照协议3，使用闪光灯照明图像对每个HDR光源照明图像进行投影变换，以对齐至标准视角。
   4. 将HDR图像旋转至所需方向——例如，在本例中旋转90°可使羽轴垂直，羽尖向上。
   5. 紧贴圆形孔径裁剪HDR图像。遮蔽孔径外的目标标记和金属板可使文件大小减少最多25%。
   6. 重新排列整组HDR图像中的数据，生成一组文件，每个文件对应图像中的若干像素块，包含按像素组织的所有方向反射率值。这些方向反射率缓存文件的结构设计用于快速访问三维物体二维投影中单个像素位置的所有方向颜色测量值。
6. 可视化跨多尺度层次的空间变化光散射特性
   1. 为浏览测量数据，使用自定义的SimpleBrowser应用程序读取步骤1.E处理后的数据。SimpleBrowser启动后显示一个窗口，其中为羽毛在首个入射光照方向下的图像。
   2. 在羽毛羽片图像上，可选择单个像素或线性/矩形排列的像素组（图3）。继续操作，选择羽片的一个矩形区域用于分析，然后绘制该区域的平均方向性光散射图。一个显示反射率随方向余弦变化的图表窗口将出现在图像窗口旁（图4中的R1）。
   3. 默认情况下，最大亮度方向（在典型羽毛测量中为透射方向）被赋予1的曝光值。以半档（√2倍）为增量增加或减少曝光，以调整反射率色彩图的亮度。
   4. 在亮度、RGB和色度色彩图之间切换（参见图4中的R1、R2和R3）。后续步骤中使用RGB模式。
   5. 为旋转球面，点击球体以启用轨迹球界面。拖动界面实现旋转。返回球体至默认位置以查看反射半球（参见图4中的R2）。将球体从默认位置旋转180°以查看透射半球（参见图4中的T2）。
   6. 为获得数据的另一种视图，选择极坐标图模式，按单位球面上各方向的亮度值缩放其半径。将亮度缩放球体的色彩图从RGB切换为色度（参见图4中的P3、F3、S3、A3）。
   7. 在方向散射图中，当前显示图像的照明方向以红色圆圈标出（图4）。点击其他任意入射照明方向，即可显示羽毛从该方向照明下的图像。
   8. 增加或减少图像曝光，以揭示过曝或欠曝区域。
   9. 为研究跨多尺度层次的反射特性，将图表模式恢复为单位球面，色彩图恢复为RGB。回顾可知，此图表显示的是图像上所选矩形区域的平均方向反射率。
   10. 将选择模式从矩形更改为线性（图3），以便研究矩形区域内单个细尺度结构的方向反射率。
   11. 在新窗口中绘制线性平均反射率，同时保留矩形平均结果作为参考。调整曝光并将色彩图设为RGB。
   12. 在线性平均图中，可见线性区域覆盖的远端羽小枝在水平方向反射光线（图8）。选择线性图中的一个照明方向，即可在左侧图像中显示高反射性的远端羽小枝。
   13. 逐步将线段向羽毛尖端移动，直至到达相邻羽枝分叉出近端羽小枝的区域。在线性平均图中，可见近端羽小枝在垂直方向反射光线（图8）。选择其中一个方向，即可在左侧图像中显示高反射性的近端羽小枝。
   14. 在线性图中，观察在水平和垂直方向反射光线的细尺度结构如何共同作用，产生矩形图中所见的远场信号。

2. 在多个相机方向测量散射光（图1中的次要程序）

多相机视角与非均匀方向采样使我们能够研究方向反射率的特定特征。通过增加校准步骤 2.A 和 2.B，协议 1 已被扩展以支持多相机视角。在步骤 2.C 和 2.D 中提出了两个具体示例，如 图 1 中以次级流程 II.A 和 II.B 所图示。在这些情况下，相机方向从其标准方向（垂直于表面）发生改变，意味着物体是从相对于其表面法线倾斜的方向进行拍摄的。由于图像必须映射到同一坐标系中，我们通过参考样本周围经闪光灯拍摄的标定目标，对每张照片进行校正和扭曲变换，以匹配标准方向（图 9）。

1. 校准相机投影与位置：
   这些步骤的目的是计算用于图像变换的相机投影和位置。
   1. 将棋盘格校准板平整地固定在安装板上。
   2. 在标准相机视图下采集一幅图像（即 {θ,φ}={0,0}）以及在以标准视角为中心的120°锥形范围内、从多个不同相机视角拍摄的若干图像。
   3. 将图像载入Bouguet工具箱^b，一个 MATLAB 相机标定工具包。提取每幅图像中的网格角点以重建相机矩阵。导出相机的内参投影矩阵（P）和外参位置矩阵（M）。内参投影矩阵包含焦距和主点信息。外参位置矩阵主要由平移参数组成；其作用是将世界坐标系的原点平移至相机的位置。
   4. 求解将标定目标坐标系转换为机架转台坐标系的变换矩阵（X） 即 Bouguet空间到机械臂空间
   5. 从金属板上取下棋盘格图案。
2. 校准目标位置和投影偏移：
   这些步骤的目的是计算校准平面、目标平面与样品之间的偏移量，并确定目标位置。
   1. 将相机在机架坐标系中旋转，使光轴与表面平面垂直， 即 标准读码框
   2. 用闪光照明拍摄孔径周围目标环的图像。此图像为图像配准的标准图像。
   3. 处理相机原始输出（步骤 1.E.3.a 和 1.E.4 中概述的方案）。
   4. 遮蔽环形目标区域内部和外部的区域，消除可能干扰目标识别的杂散镜面高光，然后在图像中查找目标。
   5. 将相机旋转至掠射角并拍摄一张图像。
   6. 根据步骤 2.A.3 中包含基于 Bouguet 棋盘格图案位置平移的相机外参矩阵 M，计算标准相机位姿（Mc = M * Rc）和掠射角相机位姿（Mg = M * Rg）。
   7. 通过将纸靶环的厚度作为平移偏移量来重新定义 M。通过试错法进行迭代（使用不同的校准平面偏移量重新计算 M），直至在机架空间中，Bouguet 棋盘平面与靶环平面之间的偏移量达到预期值， 即 已解决纸张目标环的厚度问题。通过将斜视角图像中的目标重新投影到标准图像的目标上，验证每次迭代中的偏移量。
   8. 通过反复试验，按照前一步骤的程序重新定义 M，将掠入射角度图像中带孔径的物体重新投影到标准图像中带孔径的物体上，直至靶环平面与带孔径物体平面在机架空间中的偏移量， 即 金属板的厚度问题已经解决。
3. 测量七个非均匀采样反射率半球（次要常规程序 II.A） 图1)
   1. 从垂直于表面的相机视角，检测反射光的方向分布， 即 {θ, φ}={0,0}，如协议1所述。对反射半球进行重采样，以在非镜面方向上更稀疏、镜面方向上更密集地记录相机辐射度。
   2. 在半球范围内均匀分布的另外6个相机方向上，应用相同的标准采样反射率， 即 {θ, φ}={30,0}，{30,90}，{60,0}，{60,45}，{60,90}，{60,135}。根据每次运行对应的观察方向与初始运行的反射角，预测这6次额外运行的镜面反射区域。
   3. 对每个非均匀采样的7个半球，按照上述步骤1.D和1.E中的说明进行测量数据的采集与处理。
   4. 按照上述步骤1.F中的说明，直观浏览羽毛同一区域在7个非均匀采样半球中每个半球的定向反射率。将这7个相机方向的定向反射率图按极坐标系排列，每个图的位置依据其对应的相机方向确定（参见常规流程II.A的可视化结果） 图1；也 图5).
4. 测量精细采样的半圆形路径，以获取颜色随角度变化的详细信息（辅助流程 II.B 在 图1)
   1. 启动 SimpleBrowser 应用程序，并输入带有相机方向的非均匀采样反射半球的处理后测量数据{θ,φ}={0,0}，如步骤2.C.1中所述。在图像中选择一个像素，然后对该像素位置处半球反射率亮度的第90百分位数拟合一个平面。
   2. 构建一个一维采集序列，以精细采样镜面反射平面内的镜面反射率。在上一步定义的平面内，以½°的半角增量生成龙门臂角度。从半角为0°开始，逐步增加半角至90°。在采集序列的每次测量中，保持半向量恒定且等于表面法线，使得每个相机方向均位于镜面反射方向上。
   3. 按照上述步骤1.D和1.E中的说明进行测量并处理数据。
   4. 按照步骤1.F中的说明，对极小区域进行采样，同时目视浏览一维方向反射率例如 3×3 像素）区域，该区域中心为步骤 2.D.1 中用于拟合镜面反射平面的同一像素。确定反射率峰值的方向， 即 阴影法线。以与步骤2.D.2相同的方式构建另外3次采集运行，但将半角矢量设置为阴影法线而非表面法线。对于这3次额外的运行，生成位于包含阴影法线的平面内的机架臂角度，这些角度相对于步骤2.D.1中定义的镜面反射平面分别旋转45°、90°和135°。
   5. 按照上述步骤1.D和1.E中的说明进行测量并处理数据。
   6. 按照步骤 1.F 中的说明，目视浏览一维方向反射率，同时采样一个非常小的区域（例如 以第2.D.1步中用于拟合镜面反射平面的像素为中心，选取一个3×3像素的极小区域。从SimpleBrowser中导出该区域的平均反射辐射度。
   7. 在 MATLAB 中，将其色度作为半角的函数绘制在色度图上（图6）。将其色调、色度和亮度绘制为半角的函数图7).
   8. 在与上述相同的四个平面内，再构建四组一维采集序列，但此次配置光源与相机方向以测量镜面反射的宽度和衰减特性。将光源与相机之间的半角固定为10°。围绕垂直于平面的轴，以1°为步长在半矢量方向上生成转台臂的角度。从半矢量为-80°开始，逐步增加至+80°，其中0°对应着色法线方向。注意，并非所有相机方向均位于镜面反射方向上。
   9. 按照 1.D 和 1.E 步骤以及 2.D.6 的说明，获取、处理并导出测量数据。
   10. 在 MATLAB 中，将其色度作为半向量与着色法线之间夹角的函数，绘制在色度图上。将其色调、色度和亮度作为半向量与着色法线之间夹角的函数进行绘制。

3. 投影变换

将每张HDR图像投影变换至标准视图或与表面平面垂直的视图方向。当测量运行属于多相机方向集合的一部分时，通过步骤1.E.3.b访问本方案，例如协议2中概述的示例，并在图1中以图形方式表示为次级例程。

1. 读取一幅由非镜面反射方向照明的基准图像。（在掠射角的镜面反射方向上，纸张白色表面与黑色油墨之间的对比度降低，可能导致目标检测失败。比较图9中图像A和B的清晰度。）
2. 确定基准图像中每个目标中心的坐标。
3. 加载由相机闪光灯照明的目标图像，对应给定的灯-相机方向对（图9中的B）。
4. 使用步骤2.B.7中计算的机械臂相机矩阵M，将目标图像粗略变换至基准相机坐标系。
5. 在变换后的目标图像中确定每个目标中心的坐标（图9中的C）。
6. 通过查找图像中目标与参考目标之间的最小距离，将变换后图像中的每个目标与其在基准图像中的对应目标匹配。
7. 剔除因掠射角下景深（DOF）导致的模糊目标（图9中的D）。
8. 求解一个二维投影变换，将基准坐标系中的图像目标映射到同一坐标系中的基准图像目标。
9. 通过带孔径物体所在平面（步骤2.B.8中的矩阵M），而非目标所在平面（步骤2.B.7中的矩阵M），将拟合变形后的目标从基准图像坐标系逆变换回原始图像坐标系。
10. 保存用于将目标图像中带孔径物体映射到基准目标图像中对应物体的目标坐标对。
11. 加载由光源照明的高动态范围（HDR）图像（图9中的A）。
12. 根据保存的目标坐标对推断空间投影变换，将HDR图像变换至基准坐标系（图9中的E）。
13. 返回主实验流程。

^a Dcraw 是由 David Coffin 开发的一款开源计算机程序，用于转换相机专有的 RAW 格式图像（即 未处理的CCD数据）转换为标准图像格式。参见 http://www.cybercom.net/~dcoffin/dcraw/.

^b Bouguet Toolbox 是由 Jean-Yves Bouguet 开发的用于 MATLAB 的相机标定工具箱。详见 http://www.vision.caltech.edu/bouguetj/calib_doc。

结果

本方案的主要测量（图1中的常规程序I）将相机方向固定为垂直于表面，仅移动光源。由于光散射遵循互易性原理，因此无论是固定相机并移动光源遍历半球面，还是相反操作，结果均相同。当固定相机或光源其中之一时，完整的四维方向集合将被欠采样。与主要测量不同，若同时将光源和相机从表面法线方向移开，并在多个方向上进行测量，则可观察到更全面的散射行为特征。理想情况下，我们可以从多个相机方向进行测量，测量方向数量甚至可与入射光方向数量相当，从而获得对称的数据集。然而在实际操作中，这需要进行过多的曝光测量。根据我们的经验，在假设系统关于表面法线具有180°旋转对称性的前提下，仅需移动相机数次即可获得关于不同观测位置的充分信息。在次级测量阶段，我们从分布在半球面上且与天顶角偏差不超过60°的7个观测方向获取了测量数据^18,19（图1中的常规程序II.A）。

在本文的图示中，我们展示了从紫辉椋鸟（Lamprotornis purpureus）羽毛上测得的代表性数据，该羽毛的反射特性具有虹彩、光泽和各向异性（图5）。在7个不同的观察方向上，反射光均来自半球面上数百个入射光照方向。这些方向形成一条与羽毛主轴垂直的窄带（见图4中的羽毛图像）。当垂直于羽毛表面观察时，虹彩的颜色变化较为细微（在正入射时呈蓝绿色，在掠入射时呈绿蓝色），如图5中{0°,0°}的RGB图所示。随着观察角度趋近于掠射角，观察方向与掠入射方向之间的夹角达到最大，从而产生更显著的颜色变化（在入射与观察方向夹角为0°时呈蓝绿色，在240°时呈洋红色），如图5中{60°,0°}的RGB图所示。

当我们将运动限制在单一维度时，可以以更精细的角度分辨率对光源和相机进行步进。图6展示了L. purpureus羽毛反射率色度随入射光方向与观测方向之间夹角的变化情况，其中入射光与观测方向位于包含镜面反射带的平面内，该平面垂直于远端小羽枝的纵轴。当虹彩颜色在色度空间中划过弧线时，色调从蓝绿色逐渐转变为紫色。

在不同（X，Y）坐标的表皮区域对应于不同毫米级结构的位置，可以观察到定向反射率的空间变化。L. purpureus 在大部分区域仅可见一种结构——远端羽小枝；相比之下，在 C. cupreus 中，数据清晰地区分出三种毫米级结构——羽枝、远端羽小枝和近端羽小枝；我们可以观察到羽毛的反射率相对于每种结构的纵轴具有方向性（图8）。

图1. 该示意图展示了两种安装方法、球形龙门架坐标系、采样获取类型及其相应的结果。 点击此处查看大图。

图 2. 一根展平的羽毛透过金属板上的一个孔径可见，金属板周围环绕着一圈靶标。 可调节球形悬臂以在多个入射光和观测方向上测量羽毛的光散射。L=光源臂（纬度方向）。C=相机臂（纬度方向）。B=相机底座（经度方向）。T=转台（经度方向）。F=羽毛。

图3. 平均定向散射可从羽片的点、线或矩形区域计算得出。

图4. 方向性散射绘图函数示例（R*=反射率，T*=透射率，P*=顶部，F*=前部，S*=侧面，A*=任意方向）及配色方案（*1=亮度，*2=RGB，*3=色度）。 点击此处查看大图。

图 5. 从（仰角，方位角）坐标对：{0°,0°}、{30°,0°}、{30°,90°}、{60°,0°}、{60°,45°}、{60°,90°} 和 {60°,135°} 观察到的半球反射率在方向余弦空间中的亮度（上图）和 RGB 颜色（下图）。 反射率数据取自紫辉椋鸟（L. purpureus）羽毛侧翼羽片上 25×25 像素矩形区域的平均值。红色箭头表示相机观测方向。 点击此处查看高清大图。

图6. 反射率色度随入射光与观察方向之间半角的变化：CIE 1976 均匀色度标度（USC），含放大区域。 点击此处查看大图。

图 7. 反射率作为入射光与观察方向之间夹角的函数，在羽小枝远端纵轴方向上（红色）和平行于该轴方向（阴影）的分布：（A）主波长，（B）色度百分比，（C）亮度百分比。 图 A 中的颜色阴影表示反射光的 RGB 颜色。负波长值代表非光谱紫色三角区内的颜色。点击此处查看高清大图。

图8. C. cupreus（非洲翡翠杜鹃）相邻羽枝间远端羽小枝与近端羽小枝的平均定向反射率。

图9. (A) 由龙门灯照明的未校正图像，(B) 由相机闪光灯照明的未校正图像，(C) 在仿射变换后、闪光灯照明图像上的滤波目标候选区域，(D) 景深范围内清晰度可接受的目标，(E) 经校正的灯光照明图像，(F) 羽毛尖端向上旋转、裁剪并掩膜处理后的图像。 点击此处查看高清大图。

讨论

尽管许多色素色和结构色的性能与功能已被广泛认知，但许多表皮结构的形态极为复杂，导致其结构细节和功能仍不清楚²⁰。表皮已演化出在生物体表面空间上变化的特化结构，能够将光线选择性地定向反射至观察者。由于颜色随入射角和观察角度的变化而发生偏移，定向性主要在虹彩现象的研究中受到关注，而对生物表皮虹彩特性的研究主要获得了1D及部分2D的测量数据^8,12,17。然而，无论是虹彩还是非虹彩表皮，通用的6D测量在表皮研究中尚未成为常规手段^21-23，而目前关于生物体颜色表型的文献也因缺乏本方法所能提供的这类定向颜色数据而受到限制。

羽毛是一种特别丰富的皮肤衍生物，由羽枝的毫米级结构排列组成，包括羽枝、远端小羽枝和近端小羽枝。由于这些结构单元尺寸微小且排列复杂，难以分辨各个单元的光散射性能。我们的实验方案成功地将毫米级结构从宏观几何形态的影响中分离出来。通过表征毫米级结构的方向性表达对羽毛远场信号的功能性影响，我们得以深入探究其适应性意义。

我们在光谱、空间和角度分辨率之间面临实际的权衡。在研究中，我们选择了高空间分辨率、中等角度分辨率和低光谱分辨率。其他组合也可使用，但某些组合（例如 所有高设置都会导致无法实际操作的过长测量时间。必须将注意力集中在对所研究的特定现象具有重要意义的区域。在选择使用带有拜耳滤光片马赛克的RGB相机时，我们设计的方案旨在匹配人类视觉系统。该RGB相机可以被替换，且我们的方案也可相应调整，以测量任何生物体的相对颜色刺激。 例如 在紫外光谱范围内需要具备灵敏度，以测量鸟类的四色性颜色^24,25光谱成像相机将提供最通用的解决方案²⁵.

我们以三级飞羽演示了本实验方案，因为这些羽毛颜色鲜艳且易于紧贴参考板压平。然而，金属板的孔径仅能暴露羽毛表面的一小部分。如果我们能在测量羽毛反射率的同时，同步获取其表面的三维形貌²⁵，便可避免对羽毛进行机械压平，从而在其自然、未压平的状态下完成整个羽毛的测量。

用于可视化数据的交互式、专业化、集成化工具，为探索和解读大量数据的科研人员提供了显著优势。集成度和交互性越高，数据中的关联就越容易被发现。在我们的软件中，用户可交互式地绘制表面位置函数的平均方向散射图（图4）。未来对本软件的进一步开发可集成其他绘图功能（图6、图7），以拓展交互体验。