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多重恒化器阵列的设计与应用

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DOI：

10.3791/50262

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2013年2月23日

 ,  ,  , 
1Department of Genome Sciences, University of Washington

本文内容

摘要

我们开发并验证了一种小型化微型恒化器阵列，该装置由 readily available 的部件构成，成本低廉。其生理学及实验进化结果与较大体积的恒化器相似。该微型恒化器阵列为传统的恒化器实验、功能基因组学以及化合物筛选应用提供了一个紧凑、经济且易于获取的平台。

摘要

恒化器是一种连续培养系统，其中细胞在严格控制、化学环境恒定的条件下生长，培养密度受特定限制性营养物质的约束。1,2 由于恒化器在稳态下提供恒定的生长速率和环境，因此其数据在定量表型测量中具有高度可重复性。基于这些原因，恒化器已成为通过基因表达分析3-6 及其他稳态平衡条件下培养特性的研究，对生理学进行精细表征的有用工具。7 恒化器中的长期实验能够揭示微生物种群在受控环境中进行适应性进化时所采取的特定进化轨迹。事实上，自恒化器发明以来，其已被广泛用于实验进化研究。8 进化实验中的一个常见结果是，每个生物学重复都会获得一组独特的突变谱型。9-13 这种多样性表明，通过更高通量的进化实验仍有大量未知内容有待发现。

本文介绍了一种相对简单且低成本的微型恒化器阵列（简称ministats）的设计与操作方法，并验证了其在酵母生理学研究及进化实验中的应用。该方法通过单个多通道蠕动泵驱动数十个恒化器运行，培养体系维持在20 ml的工作体积，适用于多种应用场景。我们希望，通过提高通量、降低成本，并提供详细的构建与操作说明，能够进一步推动本设计作为一种通用平台，在科研与工业领域用于大规模菌株、物种、生长参数以及基因或药物文库的功能表征。

引言

微生物生长与进化的动态过程是微生物学、生态学、遗传学和生物技术领域的基础。培养微生物最常见的方法是分批培养，即在营养丰富的液体培养基中以较低密度接种细胞，并使其生长至饱和状态。尽管使用标准实验室设备即可简便操作，但分批培养过程中化学环境不断变化，导致细胞生理状态随之波动。这种异质性的生长环境可能引发次级生长和应激效应，从而掩盖细微的生理差异。通过连续分批传代进行的实验进化可能筛选出复杂的、与生长阶段相关的亚群混合体，使得将适应性变化与特定选择条件关联起来变得困难。由于取样时间不精确以及滞后期等特征的变异所引入的噪声，定量表型的测量也可能具有挑战性。连续培养则提供了一种替代性生长模式，可在化学均一的环境中以确定的生长速率可重复地培养细胞，使其达到生理稳态。由于具备这些优势，实验进化研究以及细胞状态的表征常采用如恒化器等连续培养系统所提供的受控环境。14

人们对这些优势的认识已重新激发了对恒化器培养的兴趣15。自1950年首次提出以来1,2，恒化器系统已发展出多种规模和应用形式，体积范围从升至微升级不等16-19。这些不同的设计，无论是商业化的生物反应器、手工吹制的玻璃装置，还是定制的微流控平台，均遵循共同的基本设计原则。培养腔室持续搅拌并通气（通常通过向其中鼓入空气），以确保微生物始终均匀分散于整个培养腔中。成分明确的新鲜培养基持续加入，其添加速率控制着微生物的生长速率，并影响培养物所处的化学环境。通过溢流口设定培养管中的培养液体积，培养物也以与新鲜培养基流入相同的速率经由溢流口被取出。通过这种方式，培养物可迅速达到生理上的稳态，此时许多生物学参数保持恒定。尽管恒化器具有诸多优势，且文献中已有多种平台的报道，但其广泛应用仍受限于系统构建与操作的困难，以及商业化设备的高昂成本。此外，关于这些装置的制作与使用方法的描述往往不够清晰。

我们提供了一种小型化恒化器阵列的设计方案及使用说明，该装置由 readily available 的部件构成，成本低廉且占用空间小。将本装置与已报道的在较大体积商用生物反应器中培养酵母的数据进行比较时，我们观察到实验参数高度一致，结果具有良好的可重复性。这包括细胞生理状态的一致性，表现为在10–15代内达到稳态平衡，并在平衡状态下获得相似的培养密度。此外，微型恒化器与商用大体积平台之间的基因表达模式也保持一致。三个重复培养之间稀释速率、光密度以及基因表达的可重复性，均体现了本平台的稳健性。我们还发现，在类似的实验进化时间尺度上，微型恒化器中出现的适应性突变与大体积恒化器中出现的突变相同。

方案

在整个实验过程中应采用适当的无菌操作技术。

1. 组装微型反应器阵列的部件并进行准备

  1. 订购所有部件。
  2. 清洗玻璃试管，并在试管上标记 20 ml 刻度线。
  3. 制备带有进气口、培养基入口和废液出口的橡胶塞组件，并将其安装在已清洗的玻璃培养管顶部。
  4. 准备加湿 chamber 并摆放所有无需高压灭菌的部件。
  5. 使用足够长度的管路和匹配的连接件，分别制备进气、废液和培养基管路。
  6. 将各类管路（进气、废液和培养基）连接至橡胶塞组件、铝箔包裹的滤器以及培养基快速接头，以准备进行高压灭菌。
  7. 准备一个大容量试剂瓶，用于配制无菌恒化器培养基。
  8. 通过在取样瓶中插入带两个孔的橡胶塞并安装适当接头，制备培养物取样瓶；用铝箔包裹每个滤器，以准备进行高压灭菌。
  9. 将组装好的整套装置整齐地放入一个或多个高压灭菌托盘中，并对所有部件进行高压灭菌。
  10. 配制恒化器培养基，并过滤至已灭菌的大容量试剂瓶中。

2. 实验设置

  1. 向每个补水瓶中加入 700 ml ddH2O。
  2. 将已灭菌的微型生物反应器放入设定好所需温度的加热块中。
  3. 将通气管插入四通道歧管，并打开气泵。
  4. 将流出管路连接至 100 ml 收集瓶。
  5. 移除培养基管路和培养基大瓶末端的铝箔，连接两个快速接头。将每段蠕动泵管依次穿入蠕动泵盒中并卡紧到位。启动培养基泵。
  6. 让反应腔室充满培养基后，关闭培养基泵。
  7. 用 70% 乙醇喷洒橡皮塞组件，并使用注射器接种培养物。如需要，保存一份接种物作为甘油冻存菌种。让培养物生长 30 小时。
  8. 调节流出针的高度，直至在关闭气流的情况下培养体积设定为 20 ml。此过程可能需要在一小时内进行多次调整。完成后重新打开气流。
  9. 打开培养基泵。
  10. 清空流出液取样瓶（其中含有设定工作培养体积期间收集的培养基），并记录时间。
  11. 为获取零时点测量值，将流出管路插入无菌收集管中收集 15 分钟至 2 小时（根据 DNA 分析所需的取样体积而定）。如需要，此时也为每种培养物制备甘油冻存菌种。

3. 每日测量

  1. 与初始时间点（time-zero）测量相同，根据实验需要将样品置于冰上孵育15分钟至2小时，并记录用于DNA分析和冻存样品的取样时间。
  2. 对于RNA样品，可使用注射器和22G 5英寸针头从培养物中快速吸取少量样品，或打开每个ministat装置以收获全部培养物。样品必须迅速采集，通过过滤收集后立即在液氮中速冻。
  3. 测量自上次取样以来每个ministat收集的流出液，以确定稀释速率。如需调整，可通过重新设置泵速或调节单个泵管上的微调装置来校正稀释速率。
  4. 将流出液导管更换至空的收集瓶中。
  5. 定量每毫升细胞数及其他感兴趣的检测指标，并制备甘油冻存菌种。

4. 实验后清理

  1. 将所有导管分别放入不同的托盘中，并用 ddH2O 大量冲洗。使用水族泵干燥导管。
  2. 用 ddH2O 清洗软木塞组件，并使用针头插入器清洁针头，交替吸液和排液以冲洗针头。擦拭针头外部及软木塞，以去除任何残留的培养基。
  3. 用清水和乙醇清洗玻璃导管，并使用三团卷起的Kimwipe纸巾和镊子去除物理污染物。
  4. 使用前再次冲洗并干燥所有部件。

结果

如上所述及（图1A、B）所示，采用微量化恒化器阵列在硫酸盐限制条件下培养单倍体MATa出芽酵母实验室菌株（S288c），培养条件如前所述10。我们测试了该系统在常见恒化培养应用中的有效性，包括生理特性测定和实验进化研究。为验证微量化恒化器的性能，我们重复了此前在经改造用于恒化培养的工业发酵罐中进行的多项实验10,20,21。ATR Sixfors发酵罐的工作体积为300 ml，超过微量化恒化器体积的十倍以上，且在培养通气和搅拌方式上存在显著差异。我们尝试重现这些发酵罐所获得的设备稳定性、稳态生理特征、实验进化结果以及基因表达模式。

由于稀释速率和通气的均匀性是恒化器设计的重要方面，我们在32个微型恒化器经过15代生长后测量了实际的稀释速率。当目标稀释速率为0.17 vol/hr（4-5滴/分钟）时，32个重复样本的平均稀释速率为0.17208，标准差为0.0075。该范围处于我们通常可接受的±0.01 vol/hr目标偏差之内；超出此范围时，已观察到基因表达发生大规模变化。22-23 在4个微型恒化器中，测得的空气流速为307.5 ml/min，标准差为9.57 ml/min。这表明进入反应室的气流稳定，并在4个腔室之间均匀分配，其数值与工业发酵罐中通气条件所描述的值相似。20

我们先前观察到，在8次酵母硫酸盐限制条件下的进化实验中，高亲和力硫离子转运蛋白SUL1在8/8次实验中均出现重复性扩增10。鉴于在此条件下结果的一致性，我们选择硫酸盐限制条件来测试本系统的能力。恒化培养的一个必要条件是维持稳定的化学环境。限制性营养物质丰度的波动或环境中的其他变化通常会导致特定培养物中细胞数量的改变。我们以光密度作为细胞数量的替代指标（图2A），并在16个重复培养物中评估其可重复性，结果显示经过约15代生长后，平均A600为1.12（约109个细胞），标准偏差为0.057单位，即5.1%。作为对比，从4个在工业发酵罐中培养的重复样本中测得的标准偏差为2.5%。生长室中的细胞混合充分：从流出液通道采集的OD值和细胞计数与直接从培养管取样的结果相当（数据未显示）。这些结果表明，我们的平台具有良好的稳健性，能够在与工业发酵罐相近的容差范围内维持稳定的化学环境。

作为对生理状态更敏感的检测指标，我们比较了在微型生物反应器和工业发酵罐中、硫酸盐限制条件下培养的菌株全基因组稳态基因表达情况。微型生物反应器中的基因表达在三个生物学重复之间表现出高度相似性（图2B我们先前指出，对于来自两个重复Sixfors恒化器的RNA并共杂交至微阵列的结果，99%基因的表达水平差异在1.5倍范围内，因此可将1.5倍作为经验性的显著性阈值。21 三个重复微发酵罐的基因表达经两两比较显示，99%的基因变化范围在1.5至1.7倍之间，与工业发酵罐的结果相当。这三个样本分别杂交至独立的芯片，随后计算两两之间的比值，因此这些数值不仅包含生物学变异，还包含了芯片间的噪声，与已发表的共杂交结果相比，可能高估了重复样本间的变异程度。共有138个基因差异表达。 >在三个迷你生物反应器（ministat）重复实验中，与来自工业发酵罐培养的匹配样本相比，基因表达量变化达1.5倍。在迷你生物反应器中表达下调的基因显著富集于铁代谢相关基因。这一特征可能反映了不同设备配置下金属成分的差异：Sixfors装置包含浸没于培养液中的金属搅拌桨和通气组件，此前使用的培养基瓶也需金属硬件。迷你生物反应器仅使用不锈钢针头，不含其他金属部件。表达上调的基因主要与细胞膜相关，但其生物学意义尚不明确。

最后，我们在这些条件下测试了实验进化。经过250代的硫酸盐限制性生长后，来自4个独立进化的群体中检测的4/4个克隆均显示出SUL1的扩增，该结果通过阵列比较基因组杂交（CGH）检测得到（图2C）。该结果与在较大体积的恒化器中类似时间间隔内的研究发现一致。10

微生物培养示意图，包含培养基储液瓶、蠕动泵、培养室、通气装置和取样设置。
图1. A. 微型恒化器阵列的设计与布局。 B. 培养室的设计。

微生物生长分析：图表（A600 与世代数），基因表达热图，基因组拷贝数。
图 2. A. 实验数据显示，培养物在生长十代内即达到平衡状态（n=16）。B. 在硫酸盐限制条件下处于稳态时采集的三个生物学重复样本 S1-3 的基因表达数据，与在匹配的硫酸盐限制型 Sixfors 恒化器中培养的共同参照样本进行比较。C. 在硫酸盐限制环境下生长 250 代后，从微恒化器中获得的 SUL1 基因扩增情况。通过比较每个进化克隆的基因组 DNA 与祖先菌株的 DNA 进行 CGH 分析21，计算每个扩增区域的平均拷贝数，并标注于各扩增子旁。所有微阵列数据均已存入 GEO 数据库，登录号为 GSE36691。 点击此处查看高清大图。

讨论

在微控培养系统（ministats）中进行恒化器培养时，与所有恒化器实验一样，需要注重细节并具备排除故障的能力。由于连续培养实验中污染问题尤为关键，我们通常在接种时以及长期进化实验的每50代，通过显微镜检查是否存在细菌和真菌污染。迄今为止，在超过300代的96个进化实验中，我们均未观察到污染现象（数据未显示）。为检测微控培养系统之间是否存在交叉污染，以及微生物是否可能通过流出管路定植于培养室，我们运行了16个微控培养系统，其中每隔一个系统按前述方法接种酵母，其余系统则不接种任何培养物。所有培养物的废液被收集至一个共用的废液容器中，该容器每隔一天清空一次。因此，如果污染物可能通过流出管路进入培养系统，则本实验极有可能观察到此类现象。在为期三周、超过100代的培养过程中，采用接种与未接种交替的棋盘式布局，我们未在未接种的微控培养系统培养管中观察到任何生长现象，表明在类似时长的实验中，来自外部的酵母或其他微生物污染几乎不可能发生。

尽管微型恒化器的设计旨在以类似于商用恒化器的方式运行，但这种模块化结构可根据用户的需求和预算进行优化。本方案中使用的蠕动泵可实现每小时0.0186体积至3.6体积的流速（数据未显示）。通过采用其他型号的泵，可实现对稀释速率更精确的控制。需要注意的是，在较低稀释速率下运行时，可能需要更换更粗的针头，以达到相同的液滴输送频率。种群规模是设计进化实验时需要重点考虑的因素。本实验采用的标准稀释速率和营养物浓度可维持相对较大的种群数量（约109个细胞），其数量级与已发表的进化研究相当11。通过调整工作体积或限制性营养物浓度，也可维持更大或更小的种群规模。此外，使用具有较高突变率的菌株进行实验，还可获得更高的突变供给量。

现有的微培养装置设计也有改进空间。例如，培养管壁上可能会产生冷凝水，使用较深的水浴、培养箱或恒温房间可显著减少这一现象。尽管在硫酸盐受限的培养条件下出现细胞聚集和管壁生长的情况相对较少——在300代以内的48个进化实验中仅出现5次（数据未显示）——但可选用多种表面活性剂来帮助减少或延缓这一特性。如果细胞聚集影响了培养物的充分混合，可通过减少每个空气泵所连接的分支数量，或增加搅拌装置来加强振荡。此外，还可根据其他设计的方案，加入用于检测溶解气体浓度、pH值或其他参数的额外探头。17

尽管可能存在某些改进，但在使用本方案所述的微恒化装置时，我们将该装置与已报道的大型商用恒化器数据进行比较后发现，实验参数高度一致，结果具有良好的可重复性。这包括细胞生理学特性的可重复性，例如在10至15代内达到稳态平衡（图2A），以及在平衡状态下获得相似的培养密度。基因表达模式在三个微恒化装置的生物学重复之间以及微恒化装置与商用大容量平台之间均保持一致（图2B），仅铁代谢相关基因除外。这些表达差异可能由两种装置中金属含量的不同或培养基成分质量的改进所致。我们的数据表明，微恒化装置将适用于需要稳定环境的生理学或竞争性实验。

为了检验微流控恒化器（ministat）设计是否足以满足实验进化应用的需求，我们在硫酸盐限制条件下对培养物进行了250代的长期进化，并利用比较基因组杂交（CGH）技术检测了 SUL1 位点的扩增情况——这是在大体积恒化器中长期进化的典型特征。10 我们在4个独立进化的实验中，均观察到硫酸盐限制培养基中分离的克隆菌株出现了 SUL1 基因的扩增（图2C）。综合来看，这些数据表明，微流控恒化器是一种稳健的实验平台，可能适用于多种传统的恒化器应用场景。尽管本文展示了其在培养芽殖酵母中的应用，但该系统也应适用于其他生物体，事实上，类似的设计已被用于培养细菌及其他酵母物种。16,17,25 此外，由于培养体积更小，相应减少了培养基的消耗量，微流控恒化器可能成为需要昂贵或非常规试剂（如化学筛选或遗传筛选实验中常见情况）实验的更具吸引力的替代方案。

披露

作者声明不存在利益冲突。

致谢

本视频的制作得到了美国国立卫生研究院下属的国立研究资源中心（资助号：5P41RR011823-17）和普通医学科学研究所（资助号：8 P41 GM103533-17）的资助支持。本研究还获得了美国国家科学基金会（NSF）资助（资助号：1120425）。MJD 是丽塔·艾伦基金会学者。AWM 的部分资助来自美国国立卫生研究院 T32 HG00035 项目。我们感谢 Anna Sunshine 在优化实验方案方面提供的帮助。此外，我们感谢 Sara DiRienzi、Celia Payen 和 Amy Sirr 作为 ministats 工具的早期使用者所给予的支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
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1/2" x 5/8" 硅胶管（超大号）VWR63009-299管路：订购：(50英尺线圈包装)
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尼龙膜滤器，0.45 μm 孔径；直径：25 mmFisherR04SP02500收获：订购：1套（每包100片）（可选）
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47 mm 大型滤器装置FisherXX10 047 30收获：订购：1套（可选）
玻璃滤器支架，25 mm，小型滤器装置VWR26316-692收获：订购：1套（可选）
1L液氮杜瓦瓶VWR63380-052收获：订购：1个（可选）

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