小鼠气管插管术 通过 使用耳镜进行直接喉镜检查

摘要

我们建立了一种简单、可靠且相对经济的小鼠经气管插管方法，该方法通过使用带有2.0 mm窥视镜的耳镜进行直接喉镜检查实现。该技术无创，可用于慢性实验中的重复测量。我们发现其优于气管造口术或以往报道的非手术技术。

摘要

目前，小鼠（包括野生型和转基因型）是生物医学研究中的主要哺乳动物模型。在需要深度麻醉下进行手术或肺功能测定的全动物实验中，气管插管和机械通气是必要的操作。在这些小鼠中，传统上通过气管切开术进行气道插管以实现机械通气。尽管已有经口插管的报道，但由于技术难度较大或需要高度专业化且昂贵的设备，该方法在多数研究中尚未成功应用。本文报道一种直接喉镜技术，使用配备2.0 mm窥耳镜头的耳镜，并以20 G 静脉导管作为气管内导管。我们已广泛且可靠地应用该技术对小鼠进行插管，并准确评估其肺功能。该技术安全性良好，在经验丰富的操作者手中几乎无动物损耗。此外，该技术还可用于慢性模型中对小鼠进行重复研究。

引言

实验小鼠几乎已取代所有其他物种，成为生物学和病理生物学研究中最主要的哺乳动物模型。实验小鼠是已被明确且广泛证实可用于人类疾病研究的最小哺乳动物物种，在增进人类对生物学和疾病认知方面发挥了不可估量的作用。由于其妊娠周期短、饲养成本显著较低，使得基因敲除小鼠和转基因小鼠的建立与研究已成为生物医学研究中的常规工具。然而，普通实验小鼠的体型（20–25 g）限制了其在生理学或外科手术相关研究中的应用，因此部分研究人员选择使用体型更大的哺乳动物物种。在这些研究中，使用小鼠的一个障碍在于气管插管技术的困难，而该技术是实施深度麻醉下生理学测量或复杂外科手术所必需的。由于操作更为简便且所需技术熟练度较低，气管切开术¹常被用作插管的替代标准方法。然而，气管切开术不适用于慢性实验或需要术后恢复的研究，因此仅限于急性实验。此外，在涉及炎症反应或敏感生理反射的研究中，气管切开术本身可能成为干扰研究结果的混杂因素。

本实验室尝试了其他研究者所描述的大多数技术，但发现这些方法因各种原因均不理想。气管切开术创伤过大，会引起出血和气道炎症，更严重的问题在于该操作难以重复实施。许多相对无创的技术虽仅需适度的设备投入，但可靠性不足。另一些技术则需要昂贵的设备，而在尚未确定设备是否适用于特定实验场景之前，难以证明其投入的合理性。因此，我们致力于开发一种无创技术，该技术仅需适度的专用设备投入，操作快速且可靠，可在慢性动物模型中重复实施，并适用于大量动物。本文即报道这一技术。

方案

1. 动物准备

1. 获取年龄超过 8 周、体重超过 20 g 的小鼠（体型较小的小鼠可由经验丰富的操作者进行插管）。
2. 麻醉
   1. 腹腔注射氯胺酮和赛拉嗪，每种药物剂量均为 20 mg/kg，作为术前麻醉用药（该剂量不足以使小鼠完全麻醉，但有助于在插管后安全转移至机械通气状态）。 然而，应根据小鼠的麻醉反应，在咨询机构兽医后，可能需要调整药物剂量。 
   2. 在诱导室中使用 3.5% 异氟烷/氧气混合气体诱导小鼠麻醉，持续 90–120 秒。
   3. 密切观察呼吸频率，其应逐渐减慢，但不应低于 45 次/分钟。

2. 插管前准备

1. 将小鼠从麻醉诱导室中取出，并牢固地抓住其颈部皮肤。
2. 使用带软垫的精细镊子轻轻将舌头从口中拉出。
3. 用两根手指夹住舌头并施加轻柔力量，以保持舌头的伸展状态。
4. 通过垂直方向的动作，将小鼠沿耳镜的张开器向上提起。
5. 在牢固抓握颈部皮肤的同时，通过目镜观察耳镜，并用舌头和颈部皮肤将小鼠轻轻向上提起。
6. 仔细寻找声带。此时声带应清晰可见。喉口（喉部开口结构）应呈现相对白色。每次呼吸时应可见声带的运动。如果声带无运动或视野不清，可轻微旋转动物并轻柔地过度伸展颈部。
7. 用惯用手持20 G、1英寸 导管，使一段1 cm长的PE10导管从导管尖端伸出，像握笔一样操作，并将其插入张开器的一侧。PE导管起到导丝或探条的作用。
8. 将PE10导管（导丝）经声带之间插入，并沿PE导管推进20 G 导管（气管内插管），直至导管接头处与下门齿水平对齐。随后迅速撤出该导丝。
9. 轻柔地将动物从张开器上取下，并通过将动物连接至机械呼吸机并持续给予2%异氟烷以维持全身麻醉，从而验证导管位置。观察呼出气体（气泡）是否通过PEEP收集装置，以确认气管插管成功。 尽管食管插管也可能产生少量气泡，但其程度远不如气管插管明显且规律。 此外，观察气道压力波形是否存在负向偏转（图1）。 这些现象可证实导管位置正确。 或者，可将少量水注入静脉输液管中，并将其连接至气管导管， 通过观察呼吸过程中液体的来回移动来验证通气效果²。 在食管插管情况下，压力波形将显示显著升高的压力且无负向偏转。 虽然呼气末CO₂ 监测可能有所帮助，但由于潮气量极小（约200 µl），技术上实现非常困难，且所需设备价格昂贵。 上述简单方法已完全足够，且成本低得多。 若无法获得异氟烷麻醉，可使用氯胺酮80–120 mg/kg联合赛拉嗪10–20 mg/kg进行全身麻醉，所有操作均可在此条件下完成。

3. 替代技术：喉镜检查结合检耳镜技术通常用于其他目的， 主要 用于将研究物质直接注入肺部。

1. 在此操作中，仅使用异氟烷在诱导室中以3.5%浓度诱导动物麻醉，持续90-120秒。
2. 牢固地抓住动物颅底部位的皮肤，并用精细镊子轻柔地拉出舌头。
3. 轻轻固定舌头，将动物垂直向上提起，直至其无法再被拉高，使其固定在检喉镜（未改装）上。
4. 通常仅用此技术即可观察到声带；必要时可旋转动物并过度伸展颈部，以充分暴露声带。
5. 将装有灌注液的加样枪头推进至声门处，并注入液体。由于检喉镜与下咽部形成密封，未通过声带的残留液体会被小鼠吸入。液体完全分布于肺部之前，小鼠呼吸时会发出湿啰音，可借此确认吸入情况。
6. 或者，将PE10导管连接至含有50 µl液体并带有一段空气栓的0.5 ml注射器上。小心地将PE导管穿过声带推进约0.5 cm，缓慢注入内容物。但此方法偶可造成下呼吸道损伤，且并未显著提高样本递送效率。

结果

采用上述技术进行插管具有可靠且快速的特点。最简便的确认气管插管位置正确的方法是观察呼吸机管路呼气支（通常位于PEEP捕获装置中）浸入液体后呼出气体产生的气泡，以及气道压力波形上的负向偏转（图1）。其中，气道压力波形上的负向偏转是最可靠的判断依据。其他研究者也曾使用连接在呼吸机呼气管路上的静脉输液管中微小液滴的移动来判断²。尽管我们尚未广泛使用该方法，但它应足以验证导管位置。经验丰富的操作者使用该方法首次尝试插管成功率约为90%。对于首次尝试失败的动物，应立即拔出导管，重新使用异氟烷麻醉诱导，然后再次尝试插管。若发生食管插管且动物仍连接呼吸机管路，胃部将逐渐充气膨胀，导致气道峰压升高、低氧血症，若不及时干预，最终可导致动物死亡。若观察到气道峰压升高但无负向吸气努力，则必须立即将动物脱离呼吸机并拔除气管导管。然而，将动物从呼吸机断开并拔除气管导管后，该情况可迅速逆转。在最近300例需要插管的动物实验中，经验丰富的操作者首次尝试插管成功率为80%，第二次尝试后总成功率超过95%。所有动物在第三次尝试内均由经验丰富的操作者完成插管。对小鼠进行插管所需时间包括：术前准备最多5分钟，使用异氟烷...

讨论

在本报告中，我们介绍一种简单、可靠的非创伤性小鼠插管技术，该技术可对同一只动物反复使用。该技术仅需使用普通实验室或医疗设备即可完成，相关设备价格低廉。直接喉镜技术最初由Hastings及其同事⁴报道，可用于多种用途，但主要用于将待测物质准确递送至下呼吸道。与迄今其他研究者所报道的方法相比，我们发现该技术在操作简便性、速度、简易性、可靠性、低成本以及可重复测量方面具有优势。

对小鼠进行插管的技术并非新近出现。最早的一篇报道采用气管透照法，随后使用24 G 导管经口插管⁵。然而，该研究及其他研究^6,7并未提供足够的信息，无法在本实验室中重复该技术。最近，其他研究人员使用这种透照技术取得了更高的成功率^8,9。Brown及其同事首次发表了一项详细研究，报道了将小鼠悬置于45°背板上，通过自制喉镜片直视下透照气管，并使用PE90导管经口插入气管¹⁰。该技术被证明难以重复，因此尚未被广泛采用。另有报道描述使用刚性光学镜或纤维光学设备以提高技术的可靠性。Vergari及其同事<...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
操作用耳镜头	Welch Allyn	21700	$188.98
耳镜手柄	Welch Allyn	71000	$112.20
可重复使用耳镜窥器	Welch Allyn	22002	$3.98
精细镊子	Miltex	18-779	$107.18
用于固定耳镜的小型夹持架
异氟烷挥发器（带真空废气处理的多回路系统）	Summit Medical		$3,000
Flexivent（动物呼吸机）	SCIREQ		$35,000
静脉导管（20 G，1 英寸）	BD	381233	$9.62
聚乙烯管（PE10）（内径 0.011 英寸，外径 0.024 英寸），100 英尺	Intramedic, Clay-Adams	427401	$115.70
氯胺酮 100 mg/ml（10 ml 瓶装）	Butler	23061	$10.00
赛拉嗪（100 ml 瓶装）	Vedco	24105	$20.00
异氟烷（250 ml 瓶装）			$15.00
维库溴铵 10 mg/10 ml	Pfizer	NDC 0069-0094-01	$15.00