染色质免疫沉淀与超深度高通量测序（ChIP-seq）相结合，可识别并定位特定组织或细胞系中的蛋白质-DNA 相互作用。本文以转录因子 TCF7L2 为例，概述了如何制备高质量的 ChIP 模板用于后续测序。
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摘要
摘要
ChIP-测序（ChIP-seq）方法可直接提供全基因组覆盖，通过结合染色质免疫沉淀（ChIP）与大规模并行测序，可用于鉴定转录因子结合的哺乳动物DNA序列集合 体内“下一代”基因组测序技术相比传统技术，能够在成本效益相当的情况下将测序通量提高1至2个数量级，从而使得ChIP-seq方法可直接实现全基因组覆盖，有效解析哺乳动物蛋白质与DNA的相互作用。
为了成功进行ChIP-seq实验，必须制备高质量的ChIP DNA模板，以获得最佳的测序结果。本描述基于对2型糖尿病发病机制中作用最显著的基因所编码蛋白的研究经验，该基因编码的蛋白为转录因子7样2（transcription factor 7-like 2, TCF7L2）。该因子还被发现与多种癌症相关。
本文概述了如何从结直肠癌细胞系HCT116中制备高质量的ChIP DNA模板，以通过测序构建高分辨率图谱，确定被TCF7L2结合的基因，从而进一步揭示其在复杂性状发病机制中的关键作用。
引言
长期以来，人们一直迫切需要确定特定蛋白质在全基因组范围内结合并调控的基因集合，尤其是转录因子类蛋白质所调控的基因。
Odom 等1 采用染色质免疫沉淀（ChIP）结合启动子微阵列的方法，系统性地鉴定了人类肝脏和胰岛中由预先指定的转录调控因子占据的基因。随后，Johnson 等2 开发了一种基于直接超高通量DNA测序的大规模染色质免疫沉淀检测方法（ChIP-seq），以全面绘制整个哺乳动物基因组范围内的蛋白质-DNA相互作用图谱。作为验证案例，他们绘制了神经元限制性沉默因子（NRSF）在人类基因组中1946个位点的体内结合图谱。该数据对结合位置的分辨率极高（±50 个碱基对），有助于顺式作用元件的分离以及NRSF结合基序的鉴定。这些ChIP-seq数据还具有高灵敏度、高特异性和统计学置信度（P < 10−4），这些特性对于推断新的候选相互作用至关重要。
Robertson 等人3 还使用了ChIP-seq技术，以绘制干扰素-γ（IFN-γ）刺激和未刺激的人类HeLa S3细胞中STAT1靶点的分布图谱 体内通过ChIP-seq分析，利用1510万和1290万条唯一比对的序列读长，并以低于0.001的假发现率估算，研究者分别在刺激和未刺激细胞中鉴定出41,582个和11,004个潜在的STAT1结合区域。在已知含有STAT1干扰素响应结合位点的34个基因座中4-8ChIP-seq 检测到24个（71%）。ChIP-seq 的靶序列在已知 STAT1 结合基序相似的序列中显著富集。与两组现有的 ChIP-PCR 数据集比较表明，ChIP-seq 的敏感性介于70%至92%之间，特异性至少为95%。此外，显然 ChIP-seq 具有较低的分析复杂性，且其敏感性随测序深度增加而提高。
因此，“下一代”基因组测序技术相比传统技术，可在成本效益相当的情况下将可生成的序列数据量提高1到2个数量级9。ChIP-seq 方法因而能够直接提供全基因组覆盖，从而有效分析哺乳动物的蛋白质-DNA 相互作用3。
2006年，转录因子7样2（TCF7L2）基因的变异被发现与某种疾病存在强关联TCF7L2) 基因与2型糖尿病之间的关联被发现10其他研究者已在不同种族群体中独立地重复验证了这一发现，有趣的是，该发现源自首批发表的2型糖尿病全基因组关联研究 自然11,12, 科学13-15 及其他地方16,17，最强的关联确实与 TCF7L2；这目前被认为是2型糖尿病领域迄今为止最重要的遗传学发现18-20此外，TCF7L2 已被证实与癌症风险相关 21,22；事实上，当全基因组关联研究揭示出8q24位点与包括结直肠癌在内的多种癌症相关时，这种关联变得更加明显，该位点的作用被证实是由于一个远端上游的TCF7L2结合元件驱动了转录过程 MYC23,24因此，人们非常关注确定由这一关键转录因子调控的下游基因。
以TCF7L2为例说明该方法学，本文概述了如何制备高质量的ChIP DNA模板。在结直肠癌细胞系HCT116中进行ChIP实验，随后进行测序，旨在构建TCF7L2结合基因的高分辨率图谱，以进一步揭示其在复杂性状发病机制中的关键作用25。
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方案
1. 交联染色质
- 在100×20 mm细胞培养皿中培养细胞。每皿细胞数量可根据细胞类型在100万至1000万个之间调整。每次免疫沉淀约需200万个细胞。
- 在室温下用1%甲醛固定细胞10分钟，期间偶尔轻轻摇动。
- 加入甘氨酸至终浓度为125 mM，以终止交联反应，并在室温下孵育5分钟。
- 用1×磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤细胞两次，倾去PBS，然后加入0.2 ml PBS。
- 使用塑料细胞刮刀将细胞刮下，并转移至微量离心管中。
- 在4 °C下以2,000 rpm离心5分钟，沉淀细胞。
- 吸除上清液。如需制备全细胞裂解液，则用SDS裂解缓冲液（1% SDS、10 mM EDTA、50 mM Tris-HCl pH 8.1）重悬细胞；如需进行核提取，则可将细胞沉淀保存备用。
- 细胞沉淀可于-80 °C保存，或立即进行超声破碎处理。
2. 准备细胞核（如需制备全细胞裂解液，请转至步骤 3.5）
- 每次实验时，在细胞裂解缓冲液（5 mM PIPES pH 8.0，85 mM KCl，0.5% NP-40）中添加1倍浓度的蛋白酶抑制剂。
- 用约等于细胞沉淀体积10倍的细胞裂解缓冲液重悬解冻后的细胞沉淀。
- 用Dounce匀浆器研磨10次，然后在冰上孵育10分钟。
- 在4 °C下以4,000 rpm离心5分钟，弃上清，保留核沉淀。
3. 超声处理*
- 预热 SDS 裂解缓冲液，并向将要使用的缓冲液体积中添加蛋白酶抑制剂。
- 用 SDS 裂解缓冲液重悬核沉淀（每 1,000 万至 1,000 万个细胞约使用 0.5 ml 缓冲液）。
- 冰上孵育 10 分钟。
- 将 0.5 ml 的样品分装至微量离心管中。
- 在冰水浴中使用 Misonix 超声破碎仪进行超声处理，设置振幅为 2，工作 30 秒，间歇 45 秒。为获得理想的片段大小，可先尝试不同循环次数（例如 2、4、8、12、16 或 20 次及以上）以确定最佳循环数。若使用其他品牌的超声破碎仪，条件可能不同，需通过实验优化循环次数以及工作与间歇时间，以确定最佳条件。
- 取每份样品 20 μl 用于检测超声效果及定量分析，其余样品可储存于 -80 °C。
- 向 20 μl 样品中加入 30 μl 0.1X TE 缓冲液进行稀释。
- 加入 1 μl RNase A，在 37 °C 处理 1 小时，随后加入 1 μl Proteinase K，在 62 °C 孵育 2 小时。
- 取 20 μl 样品在 2% 琼脂糖凝胶上电泳。
- 使用 QIAquick PCR 纯化试剂盒对剩余样品进行纯化，然后用 NanoDrop 分光光度计进行定量。
*对于天然染色质免疫沉淀（ChIP），可使用微球菌核酸酶消化法作为替代方法来剪切DNA。
4. 封闭琼脂糖珠*
- 如果磁珠已封闭，请直接进行步骤 5.1。
- 使用 Protein A 或 Protein G 琼脂糖。对于 5 次免疫沉淀（IP），使用 600 μl 的 50% 磁珠悬液（300 μl 磁珠沉淀）。
- 洗涤磁珠时，在 4 °C 下以 800 rpm 离心 1 分钟，弃上清液。加入略多于 2 ml 的 ChIP 稀释缓冲液（0.01% SDS、1.2 mM EDTA、167 mM NaCl、1.1% Triton X-100、16.7 mM Tris-HCl pH 8.1），通过缓慢倒置离心管 10 次混匀。再次在 4 °C 下以 800 rpm 离心 1 分钟，弃上清液。重复此洗涤步骤 2 次。
- 在封闭溶液中 4 °C 旋转孵育过夜以封闭磁珠。封闭溶液的配方见表 1。
5. 预清除染色质
- 将超声处理的染色质在冰上解冻。
- 在 4 °C 下以 12,000 rpm 离心 10 分钟，然后立即置于冰上以去除 SDS（白色沉淀）。
- 收集上清液，弃去沉淀，必要时合并样品。
- 根据计算结果取出实验所需的染色质量（每次免疫沉淀使用 1–10 μg 染色质）。
- 用含有蛋白酶抑制剂的 ChIP 稀释缓冲液将染色质稀释 10 倍。
- 每次免疫沉淀加入 100 μl 预封闭的磁珠。
- 在 4 °C 下旋转孵育 1 小时。
6. 免疫沉淀
- 将样品在800 rpm下离心1分钟，然后将上清液转移至新的离心管中。
- 将上清液在800 rpm下离心1分钟，然后转移至另一干净的离心管中。
- 取20 μl上清液作为输入对照，保存于-20 °C。
- 根据实验中要进行的免疫沉淀（IP）数量，将染色质分装至相应份数。
- 每1–10 μg染色质中加入2 μg抗体至各样品中。
- 4 °C条件下旋转孵育过夜。
- 向每个免疫沉淀样品中加入100 μl封闭的磁珠。
- 4 °C条件下旋转孵育1小时。
- 在800 rpm下离心1分钟使磁珠沉淀，并尽可能弃去上清液。
- 用低盐免疫复合物洗涤缓冲液洗涤磁珠一次：每管加入1 ml缓冲液，室温旋转5–8分钟，800 rpm离心1分钟，弃去上清液。随后依次用高盐免疫复合物洗涤缓冲液、LiCl免疫复合物洗涤缓冲液各洗涤一次，并用TE缓冲液洗涤两次，共洗涤5次（表2）。
7. 洗脱
- 将前一日的输入样品解冻，以便与洗脱液一同处理。
- 新鲜配制洗脱缓冲液（表3）。
- 配制足够量的洗脱缓冲液主混合液，用于IP样品和输入对照样品，并额外多准备1-2份样品的量。
- 向每个IP样品中加入100 μl洗脱缓冲液，在室温下旋转孵育15分钟。
- 以800 rpm离心1分钟，将上清液转移至新离心管中。
- 向每管磁珠中再加入100 μl洗脱缓冲液，在室温下旋转孵育15分钟。
- 孵育后涡旋振荡15秒；以5,000 rpm离心1分钟，然后将上清液与第一次洗脱的上清液合并。（确保上清液中无残留磁珠。若不确定，可将上清液再次以5,000 rpm离心1分钟，并将上清液收集至新的离心管中。）
- 向20 μl输入对照样品中加入180 μl洗脱缓冲液。
8. 反向交联
- 向200 μl洗脱液和输入对照中加入8 μl 5 M NaCl。
- 用封口膜密封管子，并在65 °C水浴中孵育过夜。
9. DNA 纯化
- 每个样品加入 1 μl RNase A，37 °C 下处理 1 小时。
- 每个样品中加入 4 μl 0.5 M EDTA 和 8 μl 1 M Tris-HCl，混匀，然后加入 1 μl 蛋白酶 K，45 °C 下孵育 2 小时。
- 使用 QIAquick PCR 纯化试剂盒纯化样品。样品可在 -20 °C 保存，PCR 检测可于后续日期进行。
*或者，免疫沉淀步骤中可使用适用于染色质免疫沉淀的磁珠替代琼脂糖。
10. PCR 检测
- 进行PCR检测时，使用针对已知被目标蛋白结合的区域的引物。同时，使用针对非结合区域的引物作为阴性对照。
- 配制反应所需的试剂。将Input样品按1:100稀释（表3）。
- 运行反应。PCR程序：
步骤 1： 94 °C 3 分钟
步骤 2： 94 °C 20 秒
59 °C 30 秒
72 °C 30 秒
（重复步骤 2 至少 30 个循环）
步骤 3：72 °C 2 分钟
- 在1%琼脂糖凝胶上电泳样品。
- 也可通过实时PCR定量测定富集程度。
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结果
染色质经超声处理并用RNase和蛋白酶处理后，样品在2%琼脂糖凝胶电泳中应呈现DNA片段弥散分布，且大部分DNA集中在目标大小范围内。若测试多个不同的循环次数，随着循环次数增加，片段大小应逐渐减小（图2）。
完成本方案的免疫沉淀步骤后，可通过PCR或实时PCR检测富集效果。进行PCR扩增后，在琼脂糖凝胶上观察结果时，阳性结合区域的Input和ChIP（使用针对目标蛋白的抗体，本例中为TCF7L2）样本泳道应出现条带，而IgG（阴性对照）泳道应无条带或仅有极微弱条带（背景噪音）。对于阴性结合区域，IgG对照和ChIP泳道应无条带或仅有极微弱条带，而Input泳道应可见条带（图3）。
图4展示了通过实时PCR检测的相同样品。与前一张图类似，ChIP样品在阳性结合区域的富集倍数应显著高于IgG对照组。此外，在阴性结合区域应几乎看不到富集，或富集程度极低。
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讨论
现在可以利用ChIP-seq技术对蛋白质-DNA相互作用进行全基因组范围的分析，这一点已在其他转录因子的研究中得到最新证实2,3。成功测序的关键在于获得高质量的染色质免疫沉淀DNA模板。
一旦生成DNA模板并确认其已充分富集，便可将其用于文库制备，以进行后续测序。例如，可采用测序仪供应商Illumina提供的文库制备方案。该文库的片段大小选择可通过凝胶电泳实现，随后切取并纯化大小约为200至700 bp的DNA片段。缩小从凝胶纯化中回收的DNA片段大小并收窄其范围，旨在提高ChIP-seq的定位分辨率。通过富集与目标因子结合的较小DNA片段，预期可提升结合位点的定位精度。更严格的大小选择还有助于提高Illumina测序平台上分子簇（colony）的大小均一性，而这种均一性可增加有效测序读长的数量。此外，较短的DNA输入片段在Illumina平台上可形成更稳定的分子簇，这意味着在给定样本的DNA片段分布中，较短的DNA片段在最终测序结果中的代表性可能高于较长的片段。
用于“下一代”测序分析的生物信息学方...
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
本工作获得了费城儿童医院研究所发展奖的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| QIAquick PCR 纯化试剂盒 | Qiagen | 28104 | |
| EZ-ChIP 试剂盒 | Millipore | 17-371 | |
| GoTaq Hot Start 聚合酶 | Promega | M5001 | |
| Misonix 超声破碎仪 | Qsonica | XL-2000 | |
| NanoDrop 1000 分光光度计 | Thermo-Scientific | ||
| 阳性对照引物序列（TCF7L2-1） 正向引物：5'-TCGCCCTGTCAATAATCTCC-3' 反向引物：5'-GCTCACCTCCTGTATCTTCG-3' 阴性对照引物序列（CTRL-1） 正向引物：5'-ATGTGGTGTGGCTGTGATGGGAAC-3' 反向引物：5'-CGAGCAATCGGTAAATAGGTCTGG-3' |
参考文献
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