单个锥体神经元的高保真光遗传学控制方法在体内

在时间上精确的方式中的神经回路激活或沉默特定的细胞类型的能力是如何理解的神经回路处理不同类型的信息相关的情感和认知的关键。在完好的神经活性的实验控制已聘请loss-/gain-of-function工具（ 例如 ，电刺激，药物调节，损伤），不提供的，用于控制神经元的特定人群，无论是在时间或空间尺度选择性要求。直接应对这些技术挑战，基因可编码感光工具的开发和应用，使​​神经科学家在明确界定的行为事件来控制选择单元格类型的电活动。许多这些光敏蛋白是微生物来源的，具有光门控阳离子通道，channelrhodopsin-2（CHR ^2）1，和光驱动氯泵，halorhodop罪^{（NpHR）2,3，}在广泛使用。

光遗传学的主要优点是在异构的大脑区域的能力，基因靶标特异性细胞群和技术已成功应用于多个模式生物（无脊椎动物到灵长类动物^）4-6。许多光遗传学转基因动物已生成和是市售的^7,8，但是建立转基因系可以是劳动密集型的，成本高昂。在这里，我们描述了协议的的ChR2和NpHR基因下使用重组腺相关病毒（AAV）载体大鼠前度皮质和背下托的CaMKIIα启动病毒介导的递送。内的前脑，CaMKIIα表达是独家谷氨酸锥体神经元^9。 AAV是常用的基础研究，由于其相对容易地生产和缺乏致病性的，以及在强和PERSI已实现了与这些载体支架¹⁰的转基因表达。此外，我们概述的步骤和硬件麻醉头部固定大鼠同时光传输和记录。

1。病毒贮藏和准备

1. 为提供视蛋白基因的啮齿动物的大脑使用无法复制的AAV载体已被批准用于生物安全1级（BSL-1），并要求在美国政府刊物，在生物安全微生物和生物医学实验室，可在概述了适当的保护和处理程序在疾病控制中心网站（ http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/index.htm ）。
2. 为了避免反复冻融，吸管病毒从制造商的小瓶成更小的分装在II级生物安全柜，存放于-80℃冰箱。
3. 此前立体定向注入，让等分在冰上融化，然后简要降速与台式离心机。
4. 慢慢回填一个汉密尔顿玻璃注射器和针头用少量的有机硅或矿物油。确保没有明显的气泡在注射器针筒。将注射器插入一个微量泵直接安装在泵的垂直立体定位臂（ 即立体机械手）。
5. 降低立体定位臂，直到针的尖端接触到病毒的等分试样管的底部。使用控制器的微量泵撤回病毒的所希望的体积（1.5微升的1微升注射）。
6. 所有的材料和表面，它们与病毒接触，应进行净化与消毒，如含氯漂白剂（10％）。

2。手术和病毒注射液

1. 麻醉动物用氯胺酮（大鼠，125毫克/千克，IP） - 甲苯噻嗪（大鼠，10毫克/千克，IP）的鸡尾酒。为了衡量麻醉效果，检查到脚趾捏反射反应，并根据需要给予补充剂量的氯胺酮。使用标准的无菌手术方法，将动物变成立体定位仪（大卫科夫在剂量率仪）。
2. 通过对动物头骨手术小剪刀或手术刀上方的皮肤作正中切口。轻轻分开结缔组织及清洁用小刮刀骨颅骨的顶部。
3. 验证动物的头是水平的，这样的Z坐标为前囟和lambda是相等的。确定立体坐标从一个脑图谱如鼠脑立体坐标 （乔治·旅游Paxinos和查尔斯·沃森，科学出版社，2007）或小鼠大脑中的立体坐标 （基思·北京·富兰克林和乔治·旅游Paxinos，学术出版社的目标脑区，2007）。标记注入的预期部位与手术的笔。
4. 仔细薄颅骨比使用一个手持电钻目标区域并且当钻头到达头骨底部停止。使用一对额外的细镊子，取出以露出硬脑膜变薄的骨头。
5. 定位注射器针头在目标是一，降低针，直到它触及硬脑膜，用这点来计算的z坐标。非常缓慢地降低注射针入脑，直到正确的Z位置为止。在这个协议中，内侧前额叶皮质的前度区域（2.7毫米前到前囟，±0.5毫米横向中线和-2.2毫米从硬脑膜）或背侧下脚（-6.0毫米到前囟，±3.0毫米横向中线和-2.0毫米硬脑膜）是针对一个成年SD雄性大鼠（约275克）中。
6. 注射病毒以0.1微升/分钟的速率。注射完成后，等待10分钟，抽出针头，以避免病毒的倒流到大脑表面之前。
7. 用缝纫机缝合用针连接，以密封在皮肤和应用的抗生素与伤口。
8. 的ChR2和NpHR从AAV载体功能性表达的时间过程将取决于实验设计和病毒滴度变化。在这个实验中， 在体内

3。光传输和在 ChR2的或NpHR表达神经元在体内录音

1. 连接的钨电极（〜1-1.5MΩ，微探针）使用强力胶的玻璃毛细管（Fisher科学）。
2. 使用光纤剥线工具（Thorlabs公司）公开一个多模光纤（直径200微米的核心，Thorlabs公司）和清洁光纤头与乙醇的裸结束。很轻易得分光纤头与一个楔形钻石刀（Thorlabs公司），并小心地除去多余的纤维（ 如用细镊子）。光纤应在比分轻​​松切割。
3. 光纤的FC端连接到一个200毫瓦单个二极管激光（输出端口上的PC连接器www.Lumiphy.com ）与所期望的波长。确保与激光器工作时，合适的保护眼罩戴在任何时候。
4. 测量L阿塞尔强度在光纤的使用光功率计（尖端www.Lumiphy.com ）。 在体内录音，光照强度少则20-100毫瓦/毫米²能可靠地唤起神经元活动的ChR2或NpHR介导的激活或沉默，分别。
5. 插入所述光纤插入毛细管。定位在纤维末端的钨电极的尖端约500微米以上而配合的薄缝合线两次在尖端附近的几个点，使得所述电极和所述纤维是直的。确保电极的尖端和最近的结之间的距离足够长，用于插入到目标区域。
6. 准备动物如步骤2.1和2.2以上。使用初始开颅手术为指导，以使一个新的干净的小窗口，在颅骨的定位optrode（ www.Lumiphy.com ）。使在D小切口市建局使用细针。
7. 通过头骨的窗口和进入大脑小心地将optrode用显微操作（成茂）的转区。然后推进optrode慢慢在10-50微米的步骤，直到一个光响应性细胞的出现。
8. 自定义软件的用户界面（NeuroLux临www.Lumiphy.com ）LabVIEW编写的（美国国家仪器）是用来控制单个二极管激光器和可视化和记录持续的神经活动。记录的信号被捕获与ExAmp-20K（Kation Scientific）的放大器的带通滤波（0.3-8千赫），和National Instruments的模拟到数字板（NI USB-6009）。该NeuroLux专业用户界面允许模拟输入的选择（选择两个通道的神经元和TTL信号）和数字输出。用户可以定义采样率（20千赫），基线期（预光），和后期的光周期。用户可以定义中的TTL激光stimulati上的脉冲宽度，频率和刺激期间（如果频率是20赫兹和刺激期间是500毫秒，10的激光脉冲与定义脉冲宽度交付）。用户也可以选择连续光传输（ 例如 ， 图1）。为重复的记录，用户还可以定义脉冲串的数目和列车之间的间隔。数据可以有或没有记录到磁盘被收购。
9. 以下记录，将动物麻醉，用氯胺酮/赛拉嗪混合物和以验证optrode安置和视蛋白表达心脏灌注生理盐水和多聚甲醛（4％）。

图1描述了用于同时记录神经元的活动，并控制光脉冲参数（ 如脉冲频率，脉冲宽度，刺激期）定制软件（NeuroLux专业版）在LabVIEW环境下开发的（美国国家仪器公司）的屏幕截图。该软件程序发送的命令信号，以产生TTL脉冲在单个二极管激光器控制一个数字采集装置。此外，该软件程序显示和存储记录的神经元的活动，并发表TTL信号。这些信号是通过在确定的采样率（ 例如 ，20千赫）的采集装置数字化。记录的信号被保存为一个二进制文件中的二维双精度数组。

图2显示了自定义optrode由连接到光纤的钨电极。的光纤是用薄的缝合线在3固定在电极点。如果需要的话，超级胶可用于附着它们。然而，避免永久地固定光纤的电极，因为虽然电极可以通过在纤维被重复使用几次，光传输将降低用重复使用，而且应该被切割和清洗或与每一个插入到大脑取代。

图3展示了荧光增强的黄色荧光蛋白的图像的左侧面板，显示实际的ChR2和NpHR表达。这些照片显示了在大鼠背下托代表NpHR表达（ 图3A）和前度皮质的ChR2表达（ 图3B）。病毒表达被限制主要是为了背下托和前度皮质（ 如一些荧光在齿状回观测到（ 图3A，左））。也观察到电极（薄轨道，箭头）和光纤（粗跟踪，箭头）的曲目。

图5示出了鼠前度锥体神经元的重复的ChR2刺激的结果。蓝色的光脉冲（10毫秒）交付在20赫兹，持续5秒（100个脉冲总数）。光诱发尖峰电压的痕迹2小时录音会议（61次重复总）期间多次获得每2分钟。使用这种重复刺激协议即使当，ChR2的诱导稳定和健壮扣球响应于所述光传送。

图6和图7显示NpHR引起的光抑制和大鼠subicular神经元活动的ChR2的驱动光敏化的结果。既然是这样的前度皮质，NpHR和ChR2的能介导的光诱导时间锁定的抑制和活化的视蛋白转导subicular神经元具有高再现性。

图1。截图同时进行光传输和电生理记录的NeuroLux Pro软件界面 。图为跟踪显示大鼠前度锥体细胞的响应10秒的连续532 nm的光传输的自发活动NpHR诱导的沉默。 点击这里查看大图 。

图2。定制optrode高功率形象 。的光纤被插入到连接到钨电极，并使用缝合线固定到电极的玻璃毛细管。的中心到中心的距离本月与EEN电极尖端与纤维末端大约为500微米。

图3。病毒表达和optrode位置 。 （左）的照片显示在背下托代表NpHR表达式（A）和前度皮层（B）的ChR2表达。 （右）示意图，它表示每个照片的拍摄位置。在每张照片的箭头和箭头表示的钨电极的位置和光纤，分别为。 SUB:下托，DG:齿状回，PL:前度皮质点击这里查看大图 。

图4， 在体内从的ChR2或NpHR转导的大鼠prelimb电生理记录IC皮层。 （ 一 ）ChR2的触发动作电位响应蓝色（473 nm）的光脉冲（10毫秒，蓝条）的20赫兹交付示例跟踪。 （二）光栅图，显示在六个代表神经元的ChR2引起的尖峰。每单位活性被绘制为一个点。 （ 三）自发活动期间连续绿光（532 nm）的光照射（10秒，绿巴）NpHR诱导抑制的例子痕迹。 （四）光栅图，显示在六个代表神经元NpHR诱导的沉默。每个单元活动被绘制成一个点。 点击这里查看大图 。

图5。 在体内大鼠前度锥体神经元的重复20赫兹的ChR2驱动的扣球 。 （A）电压的光诱发扣球的痕迹在时间点0，30，60，90购入，录音开始后120分钟。 （二）光栅图，显示所有的61次重复的光诱导活化的（2分钟试验间隔，120分钟总）。每个单元活动被绘制成一个点。 点击这里查看大图 。

图6。 在体内从NpHR转导的大鼠背下托电生理记录 。 （ 一 ）范例跟踪显示，表达NpHR背下托的10秒连续532 nm的光照（绿色条）消除自发活动。两个记录的单位从上面的跟踪（B）的平均波形。振幅的阈值被用于识别两种不同的神经元。 （三）光栅图，显示5重复S这些单位NpHR诱导沉默。每单位活性被绘制为一个点。

图7。 在体内大鼠背subicular神经元重复20赫兹CR2驱动的扣球 。 （A）电压的光诱发的时间点0，30，扣球收购的痕迹60，90，录音开始后120分钟。插图:该小区的典型爆发活动。 （二）光栅图，显示所有的61次重复的光诱导活化的（2分钟试验间隔，120分钟总）。每个单元活动被绘制成一个点。 点击这里查看大图 。

作者宣称，他们有没有竞争的财务权益。