一种用于活体中高保真光遗传学控制单个锥体神经元的方法 in vivo

摘要

神经科学领域近期发展出了一种结合遗传学与光学技术的工具，称为“光遗传学”，该技术能够以前所未有的空间和时间分辨率调控神经环路的活动。本文提供了一种整合光遗传学 体内 利用光遗传学操控前额叶皮层和下托中基因定义的锥体神经元亚群并进行记录。

摘要

光遗传学方法已成为阐明多种物种中与各种行为相关的神经环路活动的有力工具。源于微生物的光遗传学工具包含光敏感的膜蛋白，可在与行为相关的时间尺度上，对特定基因型定义的细胞类型实现神经活动的激活（例如，通道视紫红质-2，ChR2）或抑制（例如，盐视紫红质，NpHR）。我们首先展示了一种简单的方法，通过腺相关病毒介导将ChR2和NpHR转基因递送至大鼠的背侧下托区和前额叶皮层的前边缘区域。由于ChR2和NpHR具有基因靶向性，我们描述了如何利用该技术以高时间精度调控嵌于异质组织中特定神经元群体（即，锥体神经元）的电活动。本文介绍了相关硬件、定制软件用户界面以及实验流程，可在麻醉状态下的活体in vivo制备中，实现对转导的锥体神经元同步进行光刺激和电生理记录。这些光响应工具为明确不同类型细胞在信息处理和行为中的因果性作用提供了可能。

引言

以精确的时间控制方式激活或沉默神经环路中特定细胞类型的能力，对于理解神经环路如何处理情绪与认知相关的信息至关重要。以往对完整神经活动的实验操控依赖于功能缺失/获得工具（例如，电刺激、药物调节、损毁），但这些方法在时间或空间尺度上均无法实现对特定神经元群体的精准调控。为直接应对这些技术挑战，可遗传编码的光敏感工具的开发与应用使神经科学家能够在明确定义的行为事件期间控制特定细胞类型的电活动。这些光敏感蛋白大多来源于微生物，其中应用广泛的是光门控阳离子通道——通道视紫红质-2（ChR2）¹，以及光驱动氯离子泵——盐视紫红质（NpHR）^2,3。

光遗传学的一个主要优势是能够在异质性脑区中对特定细胞群体进行基因靶向，该技术已成功应用于多种模式生物（从无脊椎动物到非人灵长类动物）^4-6。目前已开发出多种光遗传学转基因动物，并可商业化获取^7,8，但建立转基因品系往往耗时耗力且成本高昂。本文介绍一种利用重组腺相关病毒（AAV）载体，在大鼠前边缘皮层和背侧下托中通过CaMKIIα启动子驱动ChR2和NpHR基因表达的病毒介导递送方案。在前脑中，CaMKIIα的表达特异性地局限于谷氨酸能锥体神经元⁹。AAV因其生产相对简便、无致病性以及能够实现强而持久的外源基因表达，已被广泛用于基础研究¹⁰。此外，我们还概述了在麻醉固定头部的大鼠中同步进行光递送与电生理记录的操作步骤及相关硬件配置。

方案

1. 病毒的保存与制备

1. 使用复制缺陷型AAV载体将视蛋白基因递送至啮齿类动物大脑的操作属于生物安全等级1（BSL-1）范畴，需遵循美国政府出版物《微生物学与生物医学实验室生物安全》中规定的适当防护和操作程序，该文件可在疾病控制中心网站获取（http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/index.htm）。
2. 为避免反复冻融，应在II级生物安全柜中将病毒从厂家原装瓶中分装至较小体积的工作 aliquot，并储存于-80 °C冰箱中。
3. 在立体定位注射前，将一份aliquot置于冰上解冻，随后使用台式离心机短暂离心沉降。
4. 缓慢用少量硅油或矿物油回填Hamilton玻璃注射器及针头，确保注射器筒内无可见气泡。将注射器插入微注射泵，并将泵直接连接至垂直立体定位臂（i.e. 立体定位操纵器）。
5. 降低立体定位臂，使针尖接触病毒aliquot管底部。使用微注射泵控制器吸取所需体积的病毒（1 μl注射量对应1.5 μl吸取量）。
6. 所有与病毒接触的材料和表面均应使用消毒剂（如10%含氯漂白剂）进行去污染处理。

2. 手术与病毒注射

1. 用氯胺酮（大鼠；125 mg/kg，腹腔注射）- 塞拉嗪（大鼠；10 mg/kg，腹腔注射）混合物麻醉动物。通过脚趾夹捏测试反射反应，以评估麻醉效果，必要时追加氯胺酮剂量。采用标准无菌外科技术，将动物固定于立体定位仪（David Kopf Instruments）中。
2. 使用小型手术剪刀或手术刀在动物颅骨顶部的皮肤上做正中切口。轻轻分离结缔组织，并用小型骨刮匙清洁颅骨顶部。
3. 验证动物头部是否水平，使前囟（bregma）和后囟（lambda）的 z 坐标相等。根据脑图谱确定目标脑区的立体定位坐标，例如 大鼠脑立体定位坐标 （George Paxinos 和 Charles Watson，学术出版社，2007）或 小鼠脑立体定位坐标 （Keith B.J. Franklin 和 George Paxinos，Academic Press，2007）。用外科记号笔标记预定注射位点。
4. 使用手持钻在目标区域上方小心地磨薄颅骨，当钻头到达颅骨底部时停止。用超细镊子去除磨薄的骨质，以暴露硬脑膜。
5. 将注射器针头置于目标区域上方，缓慢下放针头直至接触硬脑膜，并以此点确定 z 坐标。随后极缓慢地将注射针插入脑组织，直至达到预定的 z 位置。本方案中，以成年雄性 Sprague Dawley 大鼠（约 275 g）为实验对象，靶向部位为内侧前额叶皮层的前边缘区（bregma 前方 2.7 mm，中线两侧 ± 0.5 mm，硬脑膜下 -2.2 mm）或背侧下托（bregma 后方 6.0 mm，中线两侧 ± 3.0 mm，硬脑膜下 -2.0 mm）。
6. 以0.1 μl/min的速率注射病毒。注射完成后，等待10分钟再撤出针头，以避免病毒回流至脑表面。
7. 使用带缝合针的缝线缝合皮肤，并在伤口处涂抹抗生素。
8. ChR2 和 NpHR 通过 AAV 载体实现功能表达的时间进程将根据实验设计和病毒滴度的不同而有所变化。本实验中， 体内 注射后18至21天进行记录。

3. ChR2 或 NpHR 表达神经元的光递送与体内记录

1. 使用快干胶将一根钨电极（~1-1.5 MΩ，MicroProbes）固定在玻璃毛细管（Fisher Scientific）上。
2. 使用光纤剥线工具（Thorlabs）暴露多模光纤（200 μm 直径纤芯，Thorlabs）的裸露端，并用乙醇清洁光纤端面。用楔形金刚石刀片（Thorlabs）极轻地在光纤端面划痕，然后小心去除多余的光纤部分例如 用精细镊子夹住）。光纤应在刻痕处轻易断裂。
3. 将光纤的FC端连接至200 mW单管激光器输出端口的PC接头www.Lumiphy.com使用所需波长的激光器。操作激光器时，务必始终佩戴适当的护目镜。
4. 使用光功率计测量光纤尖端的激光强度（www.Lumiphy.com ）。对于 体内 记录，光强低至 20–100 mW/mm² 可分别可靠地引发由ChR2或NpHR介导的神经元活动激活或沉默。
5. 将光纤插入毛细管中。使光纤尖端位于钨电极尖端上方约500 μm处，并在靠近尖端的若干位置用细缝合线缠绕两圈，确保电极与光纤保持平直。注意电极尖端与最近的结扎点之间的距离应足够长，以便插入目标区域。
6. 按照上述步骤 2.1 和 2.2 准备动物。利用初次开颅的位置作为参考，在颅骨上制作一个新的、干净的小窗口，用于定位光探针（optrode）www.Lumiphy.com 用细针在硬脑膜上做一个小切口。
7. 使用显微操作器（Narishige）将光遗传探针通过颅骨窗口缓慢插入脑内至转导区域，随后以10–50 μm为步长逐步推进，直至记录到光响应细胞信号。
8. 自定义软件用户界面（NeuroLux Pro www.Lumiphy.com) 使用 LabVIEW（National Instruments）编写的程序用于控制单个二极管激光器，并可视化和记录正在进行的神经活动。记录的信号通过 ExAmp-20K（Kation Scientific）放大器进行带通滤波（0.3–8 kHz），并由 National Instruments 模数转换板（NI USB-6009）采集。NeuroLux Pro 用户界面允许选择模拟输入通道（选择两个通道分别用于神经信号和 TTL 信号）以及数字输出。用户可定义采样率（20 kHz）、基线期（光照前）和光照后时期。用户可设定 TTL 激光刺激的脉冲宽度、频率和刺激持续时间（若频率为 20 Hz，刺激持续时间为 500 毫秒，则会输出 10 个设定脉冲宽度的激光脉冲）。用户还可选择连续光照模式（例如, 图1）。对于重复记录，用户还可设定脉冲序列的数量以及序列之间的间隔。数据可选择是否同时记录到磁盘。
9. 记录完成后，使用氯胺酮/赛拉嗪混合物对动物进行麻醉，并经心脏灌注生理盐水和4%多聚甲醛，以验证光探针放置位置及视蛋白表达情况。

结果

图1展示了在LabVIEW环境（National Instruments）中开发的定制软件（NeuroLux Pro）的截图，该软件用于同步记录神经元活动并控制光脉冲参数（即脉冲频率、脉冲宽度、刺激时长）。该软件向数字采集设备发送指令信号，以生成TTL脉冲，从而控制单个二极管激光器。此外，该软件还显示并存储记录的神经元活动信号以及输出的TTL信号。这些信号通过采集设备以设定的采样率（例如，20 kHz）进行数字化处理。记录的信号以二维双精度数组的形式保存在二进制文件中。

图2 显示了定制的光子电极，该电极由连接到一根光纤上的钨电极组成。使用细缝合线在三个点将光纤固定在电极上。如有需要，可使用少量超级胶水进行粘合。然而，应避免将光纤永久性地固定在电极上，因为尽管电极可重复使用多次，但光纤的光传输性能会随着重复使用而下降，每次插入脑组织前都应切割并清洁光纤端面，或直接更换光纤。

左侧面板 图3 显示增强型黄色荧光蛋白的荧光图像，指示实际的 ChR2 和 NpHR 表达。这些照片展示了大鼠背侧下托中具有代表性的 NpHR 表达（图 3A) 以及前边缘皮层中 ChR2 的表达（图3B）。病毒表达主要局限于背侧下托和前边缘皮层（例如。 在齿状回观察到一些荧光（图3A，左图）。还可观察到电极（细轨迹，箭头头）和光纤（粗轨迹，箭头）的路径。

左侧面板 图4 表明ChR2可在大鼠前边缘皮层诱导出时间上精确的神经元放电。 图 4A 是ChR2触发的动作电位示例轨迹，响应对大鼠前边缘皮层以20 Hz频率递送的10毫秒蓝光脉冲。点阵图（图4B) 显示了ChR2诱导的六个代表性神经元的激活情况。所有记录的神经元均表现出由光诱发的放电，且响应精确无误。与ChR2相反，NpHR可快速且可逆地抑制自发性活动。 体内 大鼠前边缘皮层（右侧面板） 图4). 图 4C 是显示在CaMKllα启动子驱动下表达NpHR的前边缘皮层经连续532 nm光照（10秒）后，自发单单位活动被消除的示例轨迹 体内注意，前边缘区锥体细胞活动的完全沉默与10秒持续光刺激在时间上精确同步。下部的列点图（图4D) 显示了NpHR诱导的六个代表性神经元的沉默。两者 体内 记录结果典型地来自成年Sprague-Dawley大鼠，这些大鼠在18–21天前接受了腺相关病毒介导的微生物视蛋白基因递送。

图5展示了对大鼠前边缘区锥体神经元进行重复ChR2刺激的结果。以20 Hz频率递送蓝色光脉冲（10毫秒），持续5秒（共100次脉冲）。在2小时的记录过程中，每隔2分钟重复采集一次光诱发的动作电位电压轨迹（共61次重复）。即使采用这种重复刺激方案，ChR2仍能对光刺激产生稳定且强烈的放电反应。

图6和图7展示了NpHR介导的光抑制和ChR2驱动的光激活对大鼠下托神经元活动的影响结果。与前边缘皮层的情况类似，NpHR和ChR2能够以高度可重复的方式介导光诱导的、时间锁定的抑制和激活，从而调控表达视蛋白的下托神经元活动。

图 1. NeuroLux Pro 软件界面的截图，用于同步进行光传递和电生理记录。图中所示迹线显示，在持续 10 秒的 532 nm 光照刺激下，NpHR 引发大鼠前边缘区锥体细胞自发放电活动的抑制。 点击此处查看高清大图。

图 2. 自制光遗传电极的高倍图像。将一根光纤插入连接至钨电极的玻璃毛细管中，并使用缝合线将光纤固定在电极上。电极尖端与光纤尖端之间的中心间距约为 500 μm。

图3. 病毒表达与光遗传电极放置。（左）照片显示背侧下托（subiculum，SUB）中代表性NpHR表达（A）以及前边缘皮层（prelimbic cortex，PL）中ChR2表达（B）。（右）示意图表示各照片拍摄位置。每张照片中的箭头和箭分别指示钨电极和光学纤维的位置。SUB：下托，DG：齿状回，PL：前边缘皮层。 点击此处查看大图。

图 4. 来自 ChR2 或 NpHR 转导的大鼠前边缘皮层的 体内 电生理记录。（A）在 20 Hz 频率下给予蓝光（473 nm）脉冲（10 毫秒，蓝色条）触发 ChR2 产生动作电位的示例轨迹。（B）点阵图显示六个代表性神经元中由 ChR2 诱导的放电活动。每个神经元的活动以点表示。（C）在持续绿光（532 nm）照射（10 秒，绿色条）期间，NpHR 诱导自发活动抑制的示例轨迹。（D）点阵图显示六个代表性神经元中由 NpHR 诱导的沉默效应。每个神经元的活动以点表示。 点击此处查看高清大图。

图5. 大鼠前边缘区锥体神经元由20 Hz重复ChR2驱动产生的放电活动 体内. (A) 光刺激诱发的放电活动电压轨迹，记录于开始记录后的 0、30、60、90、120 分钟时间点。B光诱导激活的点阵图，显示了全部61次重复（试次间间隔2分钟，总计120分钟）。每个神经元的活动以点表示。 单击此处查看大图.

图6. 来自表达NpHR的大鼠背侧下托的体内电生理记录。（A）示例轨迹显示，对表达NpHR的背侧下托施加持续10秒的532 nm光照（绿色条）可消除其自发活动。（B）从上述轨迹中记录到的两个神经元单位的平均波形。使用振幅阈值来区分两个不同的神经元。（C）点阵图显示NpHR诱导的这两个神经元单位沉默的五次重复结果。每个神经元单位的活动以一个点表示。

图7. 大鼠背侧下托神经元在20 Hz重复CR2驱动下的放电活动 体内. (A) 光诱导放电的电压迹线，记录于开始记录后的 0、30、60、90、120 分钟时间点。插图：该细胞典型的簇状放电活动。B光诱导激活的点阵图，显示了全部61次重复（试次间间隔2分钟，总计120分钟）。每个神经元的活动以点表示。 单击此处查看大图.

讨论

在啮齿类动物中，存在多种技术可用于将微生物视蛋白基因特异性地靶向至特定脑区。病毒介导的基因递送是一种相对经济且快速的方法，可实现ChR2和NpHR在特定细胞类型中的表达。腺相关病毒（AAV）载体系统因其在储存期间可保持高滴度、无致病性以及能够实现长期基因表达等优势，已成为光遗传学实验中的常用选择¹⁰。许多带有细胞类型特异性启动子的视蛋白表达载体已可商业化获取，可从诸如宾夕法尼亚大学（http://www.med.upenn.edu/gtp/vectorcore）或北卡罗来纳大学教堂山分校（http://genetherapy.unc.edu）等载体核心平台获得多种AAV血清型。AAV技术的一个局限在于其包装容量有限（约4.7 kb），这限制了可用于细胞特异性靶向的转基因表达盒的大小。作为替代方案，慢病毒载体具有更大的包装容量，因此能够容纳由较大启动子序列调控的视蛋白靶向表达。

使用光遗传探针（optrode）可实现电生理信号的可靠检测，并同时进行时间上精确的光传递。然而，如上所述，其制作过程中需格外小心。由于切割后的光纤较为脆弱，结扎缝合线时若过紧，可能导致光纤断裂。尽管该光遗传探针可用于多次记录，但在每次插入前仍应对电极和光纤进行清洁（对于裸露端面的光纤，需手动重新切割），因为电极的阻抗和所传递光的质量会随着重复使用而下降。

在进行电生理记录时，必须缓慢推进光电极。此处使用的光电极总厚度约为 350 μm（钨电极：125 μm；光纤核心：200 μm），若推进过快可能导致脑组织移位。此外，在特定的记录与光传递装置中，还需考虑光诱导伪迹的可能性 ^11-12。尽管我们在实验条件下未观察到光诱导伪迹，但记录转导脑区以外的神经活动可作为光伪迹的对照。记录过程中另一个需要考虑的因素是观察 ChR2 或 NpHR 表达神经元变化所需的光强，尤其是在长时间记录时。高强度激光照射和长时间光照可能导致组织损伤和/或对后续光照刺激的反应减弱^12-13。在行为学实验中，必须使用对照病毒载体以排除光纤传递热量所造成的影响。对于许多 commercially available 的光遗传学工具，已有相应的对照载体，其视蛋白基因序列已被移除。

需要注意的是，目前已开发出具有更优特性和动力学性能的ChR2工程化变体，以及其他可能更适用于特定科学问题的抑制性视蛋白。 ^14-15例如，一种新的ChR2变体已建立 通过 靶向突变技术，称为“ChETA”，可驱动神经元产生高保真放电，其频率（高达至少200 Hz）超过原始ChR2的放电频率 ¹⁴.

在建立基因靶向细胞群的模式化活动与相应时间锁定的行为事件之间的因果关系时，体内光传递与神经元反应同步记录的结合是一个关键步骤。本文所述的方法与硬件为在啮齿类动物中实施用于体内固定头部记录的光遗传学技术提供了简明可行的方案。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
注射器	Hamilton	7653-01	10 μl
可拆卸针头	Hamilton	7803-03	31 规格，斜面尖端
微量注射泵	World Precision Instruments	UMP3
泵控制器	World Precision Instruments	SYS-MICRO4
硅油	Alfa Aesar	A12728
激光防护眼镜	Kentek	KMT-4501
多模光纤	Thorlabs	BFL37-200	200 μm 直径纤芯，0.37 数值孔径
光纤剥线工具	Thorlabs	T12S21	适用于 200 μm 直径纤芯的多模光纤
光功率计	Lumiphy LLC	www.lumiphy.com
光电探测器	Newport	818-SL/DB
蓝光激光器（445–473 nm，100–200 mW）	Lumiphy LLC	www.lumiphy.com	通过 FC/PC 适配器耦合至 200 μm 多模光纤
绿光激光器（532 nm，100–200 mW）	Lumiphy LLC	www.lumiphy.com	通过 FC/PC 适配器耦合至 200 μm 多模光纤
钨/光纤光记录电极	Lumiphy LLC	www.lumiphy.com	Lumitrode
玻璃毛细管	Fisher Scientific	22-362-566
液压显微操作器	Narishige	MO-22
放大器	Kation Scientific	ExAmp-20K
数据采集设备	National Instruments	NI USB-6009
记录用啮齿类动物头部固定装置	Lumiphy LLC	www.lumiphy.com
小型动物立体定位仪	David Kopf Instruments	Model 963