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鸡胚脊髓切片培养方案

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DOI：

10.3791/50295

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2013年3月25日

 ,  , 
1Research Department of Cell and Developmental Biology, University College London

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

利用组织切片培养可通过对基因和药物的干预来调控胚胎发育。然而，培养条件必须确保在切片的简化环境中仍能进行正常的发育过程。本文展示了一种可支持脊髓正常发育至少持续24小时的实验方案。

摘要

组织切片培养可通过对药物及基因操作来调控胚胎发育。在此简化体系中，可避免因全身给药导致的潜在致死性副作用。然而，培养条件必须确保在切片的简化环境中仍能进行正常发育。我们重点关注了脊髓的发育过程，尤其是脊髓运动神经元的发育。我们系统地调整了鸡胚切片的培养条件，切片取自绝大多数脊髓运动神经元已生成的时间点。我们检测了在培养期间存活的运动神经元的数量和类型，并比较了这些运动神经元的位置与体内（in vivo）位置的差异。我们发现，培养过程中需要特定的血清类型和神经营养因子，这些条件能够使运动神经元存活至少24小时，并使其迁移至脊髓内的适当位置。本文介绍了这些培养条件，以及利用去内脏的鸡胚包埋于琼脂糖中，再用振动切片机进行切片制备胚胎切片培养的方法。

引言

在正常胚胎发育过程中，会产生多种不同类型的细胞，这些细胞必须从其起源位置迁移到成熟生物体中发挥功能的最终位置。在发育中的脊髓内，前体细胞位于中线处的室管膜区，产生多种终末分化神经元和胶质细胞亚型，这些细胞必须迁移并整合到功能性的神经环路中，以实现感觉信息处理和运动输出1。控制肢体肌肉收缩的脊髓运动神经元已被广泛研究，关于其不同亚类形成的分子与机制已有较多了解。然而，对于运动神经元如何迁移、分离以及接收突触输入的机制，目前所知仍较为有限。

运动神经元亚型的身份在发育过程中以层级方式获得。运动神经元亚型大致可分为不同的柱、分区和池，这些分类依据其轴突投射模式而定义。运动柱的轴突分别投射至躯干肌、内脏肌或四肢肌。运动分区将外侧运动柱（LMC）中投射至四肢的运动神经元进一步划分为投射至腹侧肌或背侧肌的亚群2。在各分区内，被称为运动池的运动神经元簇则分别投射至四肢中的特定肌肉2, 3。投射至四肢的运动神经元由其表达转录因子Foxp1来界定4, 5，而分区身份则由同源结构域转录因子Islet-1（投射至腹侧）或Lhx-1（投射至背侧）的表达特征所决定6。事实上，Lhx-1的表达对于运动神经元正确的背侧投射是必需的7。这些亚型在脊髓中占据不同的位置：投射至腹侧的运动神经元最终位于投射至背侧的运动神经元的内侧。这导致外侧运动柱（LMC）被分为所谓的LMC内侧部（LMCm）和LMC外侧部（LMCl）两个分区。分区及运动池的组织结构通过两个阶段形成8。在第一阶段，运动神经元以典型的由内侧向外侧迁移的方式实现分区的分离。LMCl细胞在LMCm细胞之后生成，因此LMCl细胞需穿过LMCm区域，最终到达其定位位置。第二阶段则将同一分区内运动神经元聚集成运动池，推测该过程可能通过运动神经元在背-腹方向上的排序完成。研究表明，依赖钙黏蛋白（catenin-dependent classical cadherin）家族成员在运动神经元组织的这两个阶段中均起关键作用8-10。然而，钙黏蛋白功能如何调控细胞运动仍不清楚。

柱状、分节及细胞群身份的获得需要外源信号来调控转录因子的内在表达模式11此外，在正常发育过程中，约有50%的运动神经元通过凋亡方式死亡，该过程依赖于肢体提供的外源性信号，主要通过神经营养因子支持运动神经元的存活。因此，运动神经元的发育需要在相对较长的时间内维持适宜的环境。基于这一原因，建立能够维持运动神经元存活的脊髓切片培养体系，需明确其适宜的培养条件。既往已有利用胚胎切片培养技术追踪外源添加的纯化神经元群体行为的研究。12-14然而，据我们所知，尚无培养条件能够促进 原位 脊髓运动神经元在脑片内部的存活与迁移尚未见发表。我们改进了一种标准培养条件，该条件原本用于促进经纯化和分离的颅脑运动神经元的存活，现被优化以支持运动神经元在胚胎脑片培养系统中的发育。我们还监测了存活运动神经元的定位情况，并证明在培养期间，运动神经元各亚群基本能够达到正常的位置分布。

方案

1. 配制所需溶液

  1. 1 M 磷酸盐缓冲液： 称取 109.4 g Na2HPO4 和 32 g NaH2PO4·H2O，混合后加水溶解至总体积为 1 升。
  2. 磷酸盐缓冲液（PBS）： 配制 0.1 M 磷酸盐缓冲液，含 0.15 M NaCl。处理 10 个胚胎的切片约需 100 ml PBS。
  3. 琼脂糖： 将 PBS 溶液加热至约 70 °C，边持续搅拌边缓慢加入低熔点琼脂糖粉末，最终配制成 4% (w/v) 的琼脂糖溶液。配制 50 ml 此溶液作为储备液，置于 48 °C 水浴中待用。实验后未用完的琼脂糖溶液可在 4 °C 保存数周。
  4. 抗体封闭液： 在 PBS 中加入胎牛血清和吐温 X-100，使其终浓度分别为 1% (v/v) 胎牛血清和 0.1% (v/v) Triton X-100。5 张冷冻切片的免疫染色约需 10 ml 封闭液。
  5. 固定液： 配制含 0.75 mm NaOH 和 4% (w/v) 多聚甲醛的溶液（注意：操作需谨慎）。配制时将所需量的水加热至 70 °C，加入浓 NaOH 至所需终浓度，再加入多聚甲醛粉末，搅拌至完全溶解，随后在冰上冷却至 4 °C。20 孔胚胎切片的固定约需 10 ml 此溶液。
  6. 蔗糖溶液： 配制 10 ml 含 30% (w/v) 蔗糖和 0.1 M 磷酸盐缓冲液的溶液。处理 10 孔胚胎切片约需 10 ml 此溶液。
  7. 70% (v/v) 乙醇： 将 70 ml 无水乙醇与 30 ml 水混合稀释而成。
  8. 培养基： 在神经基础培养基中加入 1% 鸡胚提取物、1% 青霉素/链霉素、0.35% L-谷氨酰胺、0.1% 2-巯基乙醇、4% 鸡血清、2% B27 补充剂以及 100 ng/ml 的睫状神经营养因子（CNTF），所有成分均稀释于神经基础培养基中；现用现配，全程冰上操作，且当日使用。20 孔胚胎切片约需 10 ml 培养基。

2. 鸡胚制备

  1. 将受精的鸡蛋以长轴水平放置于强制通风孵化箱中，在38 °C下孵化至发育阶段15 24，通常需要约4天的孵化时间。
  2. 在孵化的第二天，用浸有70%乙醇的纸巾擦拭蛋壳进行消毒。使用连接5 ml注射器的21号针头小心刺破蛋的钝端，抽出5 ml蛋清。此举可使胚胎远离蛋壳，从而在打开蛋壳时避免损伤胚胎。将鸡蛋放回孵化箱，继续孵化2天。
  3. 使用钝头Dumont #5镊子小心刺破蛋壳顶部中央，移除约9 cm2的蛋壳。沿胚胎周围剪开，小心取出胚胎并置于HBSS中进行解剖。胚胎发育阶段应根据Hamburger和Hamilton（1992）15的标准进行判定，所用胚胎应接近第24期。任何显示异常迹象的胚胎均应弃用。
  4. 使用两把Dumont #5镊子去除羊膜、绒毛尿囊膜、头部及尿囊。将胚胎去脏以移除所有内脏器官：用显微解剖剪沿胚胎腹侧中线剪开，用一对镊子夹住胚胎头侧躯干部位，另一把镊子夹住肠道头侧部分和心脏，向尾侧方向拉出。此操作需干净利落，应能清晰看到胚胎的体节。在上肢芽与下肢芽之间横向将胚胎切成两半，然后用显微解剖剪修剪胸壁。

3. 胚胎切片制备

  1. 从水浴中取出琼脂糖溶液。剪下一次性 3 ml 塑料巴斯德吸管底部约 5 cm 的部分。
  2. 用两把镊子轻轻夹住已解剖胚胎的腰段，将其从解剖液中取出并置于干燥的培养皿中。使用巴斯德吸管吸取约 2 ml 琼脂糖溶液，将其中约 0.5 ml 滴加在胚胎上方，然后将胚胎切片吸入吸管中。将胚胎和琼脂糖转移至可剥离的塑料模具中，注意避免在琼脂糖中引入气泡。用 21 号针头轻轻将胚胎在模具的琼脂糖底部放直，胸部朝下。胚胎的定位应确保其发育中的肢体部分也能被包含在切片中。将模具置于冰上使琼脂糖凝固，注意在此期间（约 2 分钟）胚胎方向不得改变。
  3. 将 Leica VT1000S 振动切片机设置为速度 3、频率 4，切片厚度为 400 μm，并将切片室中充满 HBSS，周围用冰水包围。用超级胶水将琼脂糖块固定在振动切片机平台上。用剃刀刀片修整琼脂糖块，使胚胎周围保留 1–3 mm 的琼脂糖。选择包含肢芽且具有清晰顶外胚层嵴的切片，并将这些切片放入 HBSS 中。通常每个胚胎仅能获得一到两个合适的切片。使用两根细针小心而彻底地去除组织切片周围的琼脂糖，此步骤至关重要，必须仔细完成。

4. 胚胎切片的培养

  1. 向24孔超低吸附处理的组织培养板中所需的孔内加入500 ml培养液（如上所述）。小心将组织切片从HBSS溶液中转移至孔中。通常，每个孔中放置两到三个切片。将24孔板置于37 °C、5% CO2的组织培养孵箱中培养24小时。

5. 用于免疫染色的切片切片

  1. 培养期结束后，向每个胚胎切片孔中加入 500 μl 未缓冲的固定液，冰上放置 20 分钟。随后小心移除全部溶液，用 PBS 洗涤三次，每次间隔 5 分钟。然后将切片置于蔗糖溶液中，4 °C 下静置至切片下沉，约需 6 小时，也可放置更长时间（例如 过夜）。
  2. 取出切片，吸去多余的蔗糖溶液，加入约 1 ml O.C.T. 包埋剂中，在 20 °C 下平衡约 5 分钟。将每个切片平整地置于盛有 O.C.T. 的可剥离塑料模具中。包埋后，将模具垂直放置于干冰上使其凝固。
  3. 将 O.C.T. 包埋块装入冷冻切片机中，在 -24 °C 下平衡约 20 分钟。以 15 mm 厚度对每个切片进行切片，并贴附于 Superfrost-Plus 载玻片上。载玻片可于 -80 °C 保存，直至后续使用。

6. 免疫荧光

  1. 在加湿孵育盒中水平放置载玻片，并将载玻片垫高（我们使用经高压灭菌胶带固定的1或2 ml塑料移液器作为垫高物），用移液器向载玻片上加入1–2 ml PBS。在20 °C下用PBS孵育切片5分钟，以去除多余的O.C.T.包埋剂。吸去载玻片上的PBS溶液，然后在切片上加入500 µl封闭液，在20 °C下孵育30分钟。去除封闭液后，立即加入500 µl稀释的一抗溶液，4 °C孵育18–22小时。
  2. 吸去一抗溶液，立即用1 ml PBS在20 °C下洗涤载玻片，每次5分钟，共洗三次，以去除未结合的一抗。在切片上加入500 µl稀释的二抗溶液，在20 °C下避光孵育30分钟。随后吸去二抗溶液，并在20 °C下用PBS洗涤载玻片三次，每次5分钟。
  3. 完成上述洗涤步骤后，吸去最后一次PBS洗涤液，用吸水纸轻轻蘸去载玻片边缘的多余液体，在切片上滴加两滴Vectashield封片剂，然后小心地盖上盖玻片，避免产生气泡。成像前用吸水纸从盖玻片边缘吸去多余的Vectashield封片剂。

7. 成像

  1. 对免疫染色切片进行成像。我们使用配备 Hamammatsu ORCA ER 数字相机以及 10 X、20X 和 40 X 物镜的 Nikon Eclipse E80i 荧光显微镜。

结果

利用培养的脑片来追踪中间神经元和投射神经元的发育过程，已显著推动了我们对大脑皮层内结构形成机制的理解16。在脊髓中，已有研究通过培养完整的斑马鱼胚胎来观察运动神经元的发育17。然而，斑马鱼的脊髓运动神经元组织相对简单（由于鱼类缺乏发达的肢体肌肉）。目前，对于驱动高等脊椎动物发育过程中脊髓运动神经元层级化组织的分子机制仍知之甚少。因此，亟需建立能够支持神经元存活和胞体迁移的高等脊椎动物胚胎脑片培养条件。目前，高等脊椎动物脊髓脑片培养已被用于在脑片上接种解离的神经元12-14、研究脑片周边区域中荧光标记的轴突18，或分析早期脊髓发育过程中前体细胞的行为19。然而，针对发育后期脊髓（尤其是能够维持运动神经元正常发育）的脑片培养条件仍处于缺乏状态。

为尝试追踪脊髓神经元的发育过程，尤其是脊髓运动神经元的发育，我们研究了多种培养条件，以期促进运动神经元的存活，并通过神经元的侧向迁移实现运动功能组织的初步有序化。最初采用鸡胚第18至20期的脊髓切片进行的试验未能成功；运动神经元在培养中无法存活超过数小时，且在培养期间未能观察到大量LMCl细胞的生成（数据未显示）。因此，我们转而研究鸡胚第24期的脊髓切片培养，该时期大多数LMCl和LMCm神经元已经生成，但LMCl神经元的迁移仍处于初始阶段。图1a-c）。LMCl神经元的这种侧向迁移在发育第27期基本完成，大约在24至36小时后图1 d-f）。因此，我们的检测方法可以简化为能够维持神经元存活，并促进它们向腹角区域横向迁移。我们最初采用相对简单的培养条件进行实验，仅包含Hank's平衡盐溶液，添加或不添加鸡血清或鸡胚提取物。在所有情况下，尽管我们能够维持脊髓切片中LMC神经元的存活，但发现LMCl神经元的维持证据很少（至少通过Lhx-1的表达来判断）。此外，我们观察到HB9等基因在背侧脊髓中出现异常表达，而这种情况在正常发育过程中从不发生 体内 （数据未显示）。因此，这些简单的培养条件不适合用于研究运动神经元结构的形成。

因此，我们尝试寻找更复杂的培养条件，并以一种已发表的配方为基础，该配方旨在促进解离的胚胎鸡颅脑运动神经元的存活。这种条件20 （1% 鸡胚提取物、1% 青霉素-链霉素、0.35% L-谷氨酰胺、0.1% 2-巯基乙醇、2% 马血清、2% B27 添加剂以及 50 ng/mL 纤毛神经营养生长因子（CNTF）溶于神经基础培养基中（此处称为 Guthrie 培养基））相比更简单的培养基，确实能维持更多运动神经元的存活。此外，该条件不会导致脊髓背侧出现转录因子的非特异性表达。然而，LMCl 神经元的存活情况较差（图 1 g-i, p）。因此，我们对 Guthrie 培养基中我们认为是关键的因素进行了调整，即血清的动物来源、血清浓度以及培养基中 CNTF 的浓度。我们发现，将血清由马血清更换为鸡血清，并将 CNTF 浓度从 50 ng/mL 提高至 100 ng/mL，可显著提高 LMCl 和 LMCm 细胞的存活率，同时促进这些细胞在培养 24 小时内向腹角迁移（图 1 j-l, p）。运动神经元的总数、LMCm 与 LMCl 的比例，以及 LMCl 细胞向腹角的迁移情况，均与在蛋内（in ovo）正常发育的胚胎切片非常相似，而非仅存在于组织切片培养中（图 1 k-o, p）。因此，我们认为，基于转录因子的表达、运动神经元的数量及其位置，我们的组织切片培养条件至少在 24 小时内重现了正常的脊髓运动神经元发育过程。

Lhx-1 and FoxP1 proteins in chicken embryo; immunohistochemistry, slice culture, expression analysis.
图1. a-c. LMC 生成状态（Foxp1 染色） b）以及 LMCl（Lhx-1 染色在 a在24期时。c是两个通道的合并图像。a中的虚线表示中线，D、V表示脊髓背腹（D、V）轴的方向。 d-f. LMC 状态（Foxp1 染色在 d）以及 LMCl（Lhx-1 染色在 e）在27期的组织结构。 f 是两个通道的合并。 g-iLhx-1（g）和 Foxp1（h) 在支持颅运动神经元存活的培养基（Guthrie 培养基，即我们的“初始培养基”，参见文献20）中培养的脑片切片中，Lhx-1 在运动神经元中不再表达，尽管通过 Foxp1 的表达可见部分运动神经元柱（LMC）细胞仍存活。D，V 在（g) 显示脊髓背腹（D, V）轴的方向。M-L 显示脊髓内外侧（M, L）轴的方向 j-l. LMCl 细胞（腹侧角中的 Lhx-1）在 j）以及LMC整体（Foxp1在 k) 可在含有 4% 小鸡血清和 100 ng/ml CNTF 的培养基中培养的脑片中观察到。请注意，部分 LMCl 细胞位于腹角的外侧位置。(箭头所示)j) 显示了部分LMCl细胞的侧向位置。l) 是两个通道的合并。 m-oLhx-1 表达状态m）和 Foxp1（n) 在保存的胚胎切片中 在卵内 在所示胚胎的脑片培养过程中 j-l. (o) 是两个通道的合并图像。 p. LMCl（Foxp1）百分比的定量分析阳性Lhx1阳性) 细胞与LMC（Foxp1阳性/Lhx1阴性) 在不同条件下与对照组胚胎相比，在脑片培养中发现的细胞 在卵内 （代表100%）。Student's t检验 *** 表示 p<0.01. 单击此处查看大图.

讨论

本文所述方案可使鸡胚组织切片在培养期间维持运动神经元存活并持续迁移，且培养时间超过一天。在阐明维持运动神经元存活的条件时，我们确定了若干关键因素。结果表明，高达4%的鸡血清对运动神经元的存活至关重要，而使用其他物种的血清替代则无法耐受。有趣的是，我们发现较高浓度的血清对切片有害，因其会促进组织过度生长，导致切片形态发生明显畸变。更为重要的是，睫状神经营养因子的存在也被证明至关重要。切片或许能够培养远长于24小时的时间，这种可能性依然存在，甚至可能实现对脊髓感觉传入连接的可视化观察。此外，本文所述的培养条件也可能适用于脑干及中脑/小脑发育过程中组织切片的培养。

使用这些脑片培养条件的最大潜在优势在于，它们能够在最小化对胚胎其他部分（如心脏）产生不良影响的前提下，实现对蛋白质功能的药理学操控。大量不同信号通路的抑制剂和激动剂可用于评估不同脊髓神经元亚型的迁移情况，以及它们在发育过程中对局部脊髓环路形成的潜在作用。此外，某些针对蛋白质表达的遗传干扰手段（例如使用siRNA和吗啉代寡核苷酸）存在局限性，即由于技术限制，这些干预措施只能在发育早期引入 在卵内 电穿孔操作）且其效应仅持续较短时间（通常为一天）。我们的脑片培养始于较晚的发育阶段，因此可在切片阶段后期使用该技术，以观察其在脑片培养期间的作用效果。

该切片培养方案还可通过延时视频显微技术，实时观察脊髓运动神经元以及背侧中间神经元的迁移过程。此过程可通过白光下的相差显微镜实现，也可借助荧光成像技术完成。若采用后者，则需引入荧光标记。这可通过从肢体进行逆行标记或从脑室进行顺行标记，引入DiI或DiO等荧光染料来实现。 在卵内 通过电穿孔将表达荧光蛋白的载体导入特定神经元亚群。

披露

所有作者均无竞争利益或利益冲突。

致谢

我们感谢Sharon Boast提出的诸多深刻见解，以及B. Novitch惠赠Foxp1抗体。本研究由惠康信托（Wellcome Trust）为KCT提供的研究生奖学金以及为SRP提供的项目资助（资助编号094399/B/10/Z）支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
鸡蛋Henry Stewart Farms，英国受精的棕色Bovan Gold母鸡鸡蛋（Henry Stewart Farms，英国），在孵化前储存于14 °C
21号针头BD-Microlance-3304432
5 ml注射器BD Plastipak302187
#5 Dumont镊子RobozRS 5045
显微解剖剪刀RobozRS 5910SC（3.5英寸直头）
胚胎包埋模具：可剥离模具Agar ScientificG3764锥形，22 mm至12 mm
超级胶水Power Flex，Loctite
乙醇SIGMA32221
磷酸二氢钠一水合物BDH102454R
磷酸氢二钠VWR/BDH102494C
氯化钠VWR/BDH27810.295
低熔点琼脂糖Invitrogen16520
胎牛血清Gibco10500-064
吐温-100SIGMAT8787
氢氧化钠FLUKA71689
多聚甲醛VWR/BDH28794.295
一次性塑料巴斯德吸管ElKay精密实验室耗材127-P503-000容量为3 ml的Liquipette
汉克斯平衡盐溶液（HBSS）Gibco14170
蔗糖SIGMAS0389
碳酸氢钠SIGMAS5761
鸡胚提取物SeralabsCE650-J
青霉素/链霉素溶液Gibco15070
L-谷氨酰胺溶液Gibco25030
2-巯基–乙醇Gibco21985
马血清南方集团实验室（Southern Group Labs）9028B
B27添加剂Invitrogen17504-044
Neurobasal培养基Gibco货号 ~ 2103
睫状神经营养因子（CNTF）R和D Systems557-NT-010
鸡血清SIGMAC5405
一抗购自发育研究杂交瘤库（Developmental Studies Hybridoma Bank），其中抗foxP1抗体由加州大学洛杉矶分校（UCLA）的Bennett Novitch惠赠。一抗稀释比例为：兔抗FoxP1（1/32000）、小鼠抗Lhx1/2（4F2）（1/50）、豚鼠抗FoxP1（1/1000）。
所有抗体均保存于4 °C。
二抗驴抗豚鼠（cy3）（1:1000），购自Jackson Immunoresearch Laboratories Inc.；驴抗小鼠（Alexa Fluor 488）（1:1000）、驴抗兔（Alexa Fluor 594）（1:1000），购自Invitrogen。
所有抗体均保存于4 °C。
24孔板Corning COSTAR3473超低吸附24孔板
O.C.T.Tissue Tek，Sakura4583最佳切割温度包埋剂（Optimum Cutting Temperature）
VectashieldVector LabsH1000荧光封片剂（Vectashield fluorescent mounting medium）
载玻片Thermo ScientificSuperfrost-Plus正电荷载玻片，25 × 75 × 1.0 mm
盖玻片VWR International631-016725×60 mm
强制通风培养箱：Lyon Electric Company通过保持充足的水位维持湿度，温度维持在38 °C
冷冻切片机Brite，英国亨廷顿-36 °C
组织培养箱DH AutoflowNuaire 38 °C，5% CO2
振动切片机LeicaLeica VT1000-S
显微镜NikonNikon Eclipse E80i荧光显微镜
数码相机NikonNikon DS5M和Hamamatsu ORCA ER

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HBSS OCT

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