本文介绍了一种显微解剖技术，随后将荧光染料注射至早期鸡胚的听觉神经节，以选择性示踪听觉轴突纤维在神经及后脑中的走行。
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本文内容
摘要
摘要
鸡胚是研究周围性和中枢性神经节细胞投射的常用模型。在听觉系统中，若能选择性地标记第八脑神经内的听觉轴突，将有助于深入研究中枢听觉环路的发育过程。这一研究方法面临挑战，原因是内耳的多个感觉器官均向第八脑神经提供神经纤维1。此外，目前尚未发现能够可靠区分鸟类第八脑神经中听觉与前庭神经纤维群的特异性标记物。在早期胚胎中，听觉和前庭通路无法通过功能方法加以区分，因为在神经环路形成之前，不会出现感觉诱发的反应。虽然已有部分研究对投射至中枢的第八脑神经轴突进行了示踪，但这些听觉轴突的标记往往伴随其他第八脑神经成分的共同标记2,3。本文介绍一种顺行示踪方法，可从听觉神经节出发，选择性地标记发育中第八脑神经内的听觉轴突。首先，将8日龄鸡胚置于充氧的人工脑脊液中，部分暴露其头部前部区域，并依据解剖标志识别耳蜗管。随后，将一根精细拉制的玻璃微电极定位，向耳蜗管及其深部邻近区域（即听觉神经节细胞所在位置）注入少量罗丹明葡聚糖胺。注射后30分钟内，即可观察到听觉轴突向后脑中枢方向延伸，之后通过组织学处理可进一步清晰显影。该方法为研究从周围到中枢的听觉环路发育提供了有力工具。
方案
1. 准备以下解剖工具和试剂
- 人工脑脊液（aCSF；130 mM NaCl，3 mM KCl，1.2 mM KH2PO4，20 mM NaHCO3，3 mM HEPES，10 mM 葡萄糖，2 mM CaCl2，1.3 mM MgSO4），在室温下持续通入95% O2 / 5% CO2。用于灌注时，将500 ml广口Nalgene瓶装至其容积的2/3，并在瓶盖上钻孔。通过管道将储液瓶连接至玻璃茎式起泡器，起泡器穿过瓶盖上的孔插入aCSF中。调节压力，使气泡持续稳定地冒出，气泡高度达到液面约1/3处，但力度不足以引起液体飞溅至瓶口外。将最多6个5 ml玻璃小瓶浸入Nalgene瓶中，以使各个样品彼此隔离，并远离气体流动造成的扰动。在用于任何组织孵育前，aCSF应至少氧合20分钟。
- 小型硅胶解剖皿（35 mm × 10 mm培养皿，使用Sylgard弹性体试剂盒包被），置于底部直径为47 mm的六角形聚苯乙烯称量舟中，并插入两枚解剖针。
- 两把尖头镊子、一把弯头镊子、一个50 ml烧杯以及一个用于盛放组织废弃物的容器。
- 拉制的玻璃微量移液管（外径1.2，内径0.9），尖端断裂后形成约20–50 μm的开口，并用含0.4% Triton X-100的PBS配制的6.25%罗丹明葡聚糖胺（RDA，分子量=3,000，Invitrogen）溶液填充。通过细管连接至压电喷射仪（picospritzer），并固定于显微操作仪上。
2. E8 期耳蜗管微解剖以暴露基底乳头状体 4,5
- 用弯头镊子在脑干下方剪开 E8 胚胎，将头部直接置于称量舟内的硅胶涂层解剖皿上。
- 使用解剖针将头部固定为腹面朝上，使感兴趣一侧的耳略为可见，头部轻微向背侧倾斜，并偏离中线 10–30 度（图 2A）。立即用解剖针固定头部。若需进行双侧示踪，可将头部置于 0 度位置，即完全腹面观，以便操作两侧。类似地，若进行左侧注射，应将头部固定在偏离中线 -10 至 -30 度的位置，以便接触左侧。
- 使用 50 ml 烧杯将 30 ml 充氧人工脑脊液（aCSF）转移至解剖皿中，完全浸没组织。
- 用尖头镊子轻轻夹住并向下剥离下颌，随后移除感兴趣一侧的下眼睑。
- 移除覆盖的血管组织，包括残留的腭部和食管。这些软组织应可剥离，暴露出发育中软骨颅骨的光滑表面，其表面可见特征性的椎动脉。此时，特征性的白色耳石团块应已可见。
- 小心解剖外耳道周围、下颌关节软骨及中耳结构，同时保持内耳完整。使用镊子轻轻剪除这些软骨结构。
- 用尖头镊子的尖端轻轻扫动，移除椎动脉及积聚的血液。血液可能遮挡视野，且凝血可能堵塞注射移液管的开口。
- 耳蜗管及其相邻的感觉上皮（基膜乳头）和听觉神经节位于软骨颅骨正下方6，可观察到为从内耳向前腹侧延伸的细长指状突起，其最远端尖端（顶点）靠近前正中线5。在耳蜗管顶点处可能出现少量解剖过程中产生的积血（红色）和/或耳石钙化物（白色）（图 2B），有助于识别结构。顶点处为囊斑（lagenar macula），被认为具有前庭功能的感觉区域7,8。
3. CN VIII 听觉纤维的选择性标记
- 将注射移液管置于耳蜗管及基底乳头区域的胚胎表面附近。
- 缓慢下移微量移液管，首先刺穿颅骨。该颅骨区域比周围区域更薄，穿透所需力量较小。此时微量移液管应已进入耳蜗管内。可选：此处可进行少量示踪染料注射，以帮助可视化基底乳头。
- 在不重新定位微量移液管的情况下，继续下移，直至其刚好穿透耳蜗管的深层边界（图1）。在此处进行注射，并沿基底乳头全长的多个区域重复操作（图2C、2D），但需避开前庭隐窝所在的位置，即最靠近近端的尖端区域。使用设定为10–30 psi的皮升喷射仪进行多次注射。注入染料液体的体积可变，取决于所需的标记范围。每次注射应产生直径约为200–400 μm的荧光染料标记点（图2D）。
- 注射完成后，使用镊子在脑干上方横切样本，并用转移移液管将尾部部分放入持续以95% O2 / 5% CO2 气体灌注的aCSF容器中的小瓶内。
- 对每个胚胎，根据所需的中枢示踪距离，静置20–30分钟，以允许染料转移。
- 取出组织并准备进行组织学切片。在本示例中，组织在4%多聚甲醛（溶于1× PBS）中浸泡过夜，随后在30%蔗糖（溶于1× PBS）中浸泡过夜。
4. 复染与分析
- 复染有助于观察者定位解剖位置，并识别特定的兴趣区域。在此制备过程中，有效的复染方法是神经丝蛋白免疫标记（图1，3B，3E），该方法可强烈标记轴突，从而清晰显示中枢神经系统中的轴突束走行。
- 应在整个标记区域进行分析，因为投射可沿头尾轴延伸数百微米甚至更长。基本分析的示例包括：投射的靶向错误率、投射模式的时间进程及/或发散程度的变化。RDA标记的轴突可在周围和中枢神经系统中以高分辨率进行观察（图3A，3D）。
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结果
第八脑神经的组成部分及其神经本身的解剖结构复杂且盘曲交错图1、图3）。通过选择性示踪源自听觉神经节细胞的纤维，可以清晰地示踪并区分前庭蜗神经第八对神经的特定节段以及脑干内的初级听觉传入纤维，从而将其与前庭传入纤维区分开来（图2、图3同样，该技术也可用于研究听觉神经节细胞的周围投射。图3G），或经修改用于研究源自单个前庭器官的投射。由于轴突可被完整清晰地示踪其全长，因此可在发育过程中准确地区分听觉与前庭投射，并进行精确的定量分析，包括初始神经支配的时间和模式、靶向错误率等 等等。 此外，与之前听觉纤维标记方法不同，该方法在未固定的活体组织上进行，因此可与其他方法同时使用 体外 实验。
尽管该技术适用于E6至E9时期的胚胎，但最佳结果出现在E8时期，此时听觉轴突已支配其主要的中枢靶区3。相比之下，前庭投射更早到达脑干9,10，因此更适合作为早期示踪的候选，但由于此时期前庭器官体积较小且发育相对不成熟，技术上...
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讨论
对前庭耳蜗神经（VIII脑神经）早期发育的研究在一定程度上受到限制，部分原因在于难以识别起源于多个不同神经节的胚胎期轴突。已有若干研究探讨了在早期发育过程中指导听觉和前庭感觉细胞及神经节细胞命运的分子信号5,11,12，但调控中枢神经支配的过程尚未明确。关于耳蜗神经节细胞投射的研究报道通常描述的是通向感觉上皮的外周突起13-15，而对其投射至初级核团的中枢突起了解较少。在胚胎发生过程中对具有中枢投射特性的前庭耳蜗神经亚区进行的研究多采用电生理方法，例如对鸡胚后脑的光学记录16或对哺乳动物脑组织切片的钙成像17，但这些方法无法在神经回路完成之前实施。目前尚无法利用免疫标记物对鸡胚前庭耳蜗神经中的听觉轴突进行有效标记。尽管已鉴定出若干不同的转录因子组合，可分别对应听觉与前庭神经元18-23，但这些因子的表达并不出现在轴突中。在小鼠中，螺旋神经节与前庭神经节在基因表达上存在差异，其中包括一些有望区分不同感觉模式下轴突生长的候选基因23。进一步研究这些基因产物可能为哺乳动物和鸟类的研究提供重要的工具。通过本文所述方...
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
作者感谢Candace Hsieh博士在成像技术方面提供的建议和帮助，以及Doris Wu博士在鸡胚早期胚胎发生过程中内耳解剖学方面的专业知识。本研究得到了以下资助：NSF IOS-0642346、NIH T32-DC010775、NIH T32-GM008620、NIH R01-DC010796 和 DOE GAANN P200A120165。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 聚苯乙烯称量皿 | Fisher Scientific | 02-202-101 | |
| 培养皿，35 × 10 mm | Fisher Scientific | 50820644 | 用于制作硅胶解剖皿 |
| Sylgard 硅胶弹性体试剂盒 | World Precision Instruments | SYLG184 | 包被培养皿以制作解剖皿 |
| 解剖针 | Various | 在解剖过程中固定胚胎 | |
| NaCl | Various | aCSF 配方组分 | |
| KCl | Various | aCSF 配方组分 | |
| KH2PO4 | Various | aCSF 配方组分 | |
| NaHCO3 | Various | aCSF 配方组分 | |
| 葡萄糖 | Various | aCSF 配方组分 | |
| CaCl2 | Various | aCSF 配方组分 | |
| MgSO4 | Various | aCSF 配方组分 | |
| aCSF 容器。建议使用带盖的半透明广口 Nalgene 瓶，500 ml（16 oz） | CPLabSafety | QP-PLC-03717 | 在瓶盖顶部钻孔，以便玻璃鼓泡管插入液体中 |
| 5 ml 空玻璃小瓶或类似的透明小瓶 | American Pharmaceutical Partners, Inc | 6332300105 | 在 aCSF 孵育过程中用于将样品彼此分离，并与鼓泡气流隔离 |
| 连接至鼓泡装置的碳合气（95%O2 / 5%CO2）气罐 | Various | 通过管路连接至玻璃鼓泡管，用于向 aCSF 中通入气体 | |
| 玻璃鼓泡管 | Various | 用于向 aCSF 中通入碳合气 | |
| 弯头镊子 | World Precision Instruments | 501008 | 用于从蛋中取出胚胎头部 |
| 两把尖头镊子 | World Precision Instruments | 501985 | 用于显微解剖 |
| 50 ml 烧杯 | various | ||
| 罗丹明葡聚糖胺（RDA） | Invitrogen | various | 荧光轴突示踪剂 |
| Triton X-100 | ICN Biomedicals | ||
| 磷酸盐缓冲液（1× PBS） | Various | 标准实验室试剂 | |
| 薄壁玻璃毛细管，外径 1.2，内径 0.9，长度 4"（100 mm） | World Precision Instruments | TW120F-4 | 用于装载 RDA。每根毛细管可拉制两根玻璃微电极 |
| 针/移液器拉制仪 | David Kopf Instruments | Model 720 | 使用参数：加热 16.4，电磁阀 2.2 |
| Picospritzer | Parker Instrumentation | various | 通过细管路连接至玻璃微电极 |
| 显微操作仪 | Narishige | various | |
| 带荧光功能的解剖显微镜 | Various | ||
| 4% 多聚甲醛 | Various | 标准实验室试剂 | |
| 抗神经丝蛋白抗体（可选） | Millipore | AB1991 | 遵循制造商推荐的组织学实验方案 |
| 切片用冷冻切片机及相关材料 | Leica | various | |
| 用于成像的落射荧光显微镜 | Zeiss, various |
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