选择性示踪鸟类胚胎前庭耳蜗神经中的听觉纤维

摘要

本文介绍了一种显微解剖技术，随后将荧光染料注射至早期鸡胚的听觉神经节，以选择性示踪听觉轴突纤维在神经及后脑中的走行。

摘要

鸡胚是研究周围性和中枢性神经节细胞投射的常用模型。在听觉系统中，若能选择性地标记第八脑神经内的听觉轴突，将有助于深入研究中枢听觉环路的发育过程。这一研究方法面临挑战，原因是内耳的多个感觉器官均向第八脑神经提供神经纤维¹。此外，目前尚未发现能够可靠区分鸟类第八脑神经中听觉与前庭神经纤维群的特异性标记物。在早期胚胎中，听觉和前庭通路无法通过功能方法加以区分，因为在神经环路形成之前，不会出现感觉诱发的反应。虽然已有部分研究对投射至中枢的第八脑神经轴突进行了示踪，但这些听觉轴突的标记往往伴随其他第八脑神经成分的共同标记^2,3。本文介绍一种顺行示踪方法，可从听觉神经节出发，选择性地标记发育中第八脑神经内的听觉轴突。首先，将8日龄鸡胚置于充氧的人工脑脊液中，部分暴露其头部前部区域，并依据解剖标志识别耳蜗管。随后，将一根精细拉制的玻璃微电极定位，向耳蜗管及其深部邻近区域（即听觉神经节细胞所在位置）注入少量罗丹明葡聚糖胺。注射后30分钟内，即可观察到听觉轴突向后脑中枢方向延伸，之后通过组织学处理可进一步清晰显影。该方法为研究从周围到中枢的听觉环路发育提供了有力工具。

方案

1. 准备以下解剖工具和试剂

• 人工脑脊液（aCSF；130 mM NaCl，3 mM KCl，1.2 mM KH₂PO₄，20 mM NaHCO₃，3 mM HEPES，10 mM 葡萄糖，2 mM CaCl₂，1.3 mM MgSO₄），在室温下持续通入95% O₂ / 5% CO₂。用于灌注时，将500 ml广口Nalgene瓶装至其容积的2/3，并在瓶盖上钻孔。通过管道将储液瓶连接至玻璃茎式起泡器，起泡器穿过瓶盖上的孔插入aCSF中。调节压力，使气泡持续稳定地冒出，气泡高度达到液面约1/3处，但力度不足以引起液体飞溅至瓶口外。将最多6个5 ml玻璃小瓶浸入Nalgene瓶中，以使各个样品彼此隔离，并远离气体流动造成的扰动。在用于任何组织孵育前，aCSF应至少氧合20分钟。
• 小型硅胶解剖皿（35 mm × 10 mm培养皿，使用Sylgard弹性体试剂盒包被），置于底部直径为47 mm的六角形聚苯乙烯称量舟中，并插入两枚解剖针。
• 两把尖头镊子、一把弯头镊子、一个50 ml烧杯以及一个用于盛放组织废弃物的容器。
• 拉制的玻璃微量移液管（外径1.2，内径0.9），尖端断裂后形成约20–50 μm的开口，并用含0.4% Triton X-100的PBS配制的6.25%罗丹明葡聚糖胺（RDA，分子量=3....

结果

第八脑神经的组成部分及其神经本身的解剖结构复杂且盘曲交错图1、图3）。通过选择性示踪源自听觉神经节细胞的纤维，可以清晰地示踪并区分前庭蜗神经第八对神经的特定节段以及脑干内的初级听觉传入纤维，从而将其与前庭传入纤维区分开来（图2、图3同样，该技术也可用于研究听觉神经节细胞的周围投射。图3G），或经修改用于研究源自单个前庭器官的投射。由于轴突可被完整清晰地示踪其全长，因此可在发育过程中准确地区分听觉与前庭投射，并进行精确的定量分析，包括初始神经支配的时间和模式、靶向错误率等 等等。 此外，与之前听觉纤维标记方法不同，该方法在未固定的活体组织上进行，因此可与其他方法同时使用 体外 实验。

尽管该技术适用于E6至E9时期的胚胎，但最佳结果出现在E8时期，此时听觉轴突已支配其主要的中枢靶区³。相比之下，前庭投射更早到达脑干^9,10，因此更适合作为早期示踪的候选，但由于此时期前庭器官体积较小且发育相对不成熟，技术上.......

讨论

对前庭耳蜗神经（VIII脑神经）早期发育的研究在一定程度上受到限制，部分原因在于难以识别起源于多个不同神经节的胚胎期轴突。已有若干研究探讨了在早期发育过程中指导听觉和前庭感觉细胞及神经节细胞命运的分子信号^5,11,12，但调控中枢神经支配的过程尚未明确。关于耳蜗神经节细胞投射的研究报道通常描述的是通向感觉上皮的外周突起^13-15，而对其投射至初级核团的中枢突起了解较少。在胚胎发生过程中对具有中枢投射特性的前庭耳蜗神经亚区进行的研究多采用电生理方法，例如对鸡胚后脑的光学记录¹⁶或对哺乳动物脑组织切片的钙成像¹⁷，但这些方法无法在神经回路完成之前实施。目前尚无法利用免疫标记物对鸡胚前庭耳蜗神经中的听觉轴突进行有效标记。尽管已鉴定出若干不同的转录因子组合，可分别对应听觉与前庭神经元^18-23，但这些因子的表达并不出现在轴突中。在小鼠中，螺旋神经节与前庭神经节在基因表达上存在差异，其中包括一些有望区分不同感觉模式下轴突生长的候选基因²³。进一步研究这些基因产物可能为哺乳动物和鸟类的研究提供重要的工具。通过本文所述方.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
聚苯乙烯称量皿	Fisher Scientific	02-202-101
培养皿，35 × 10 mm	Fisher Scientific	50820644	用于制作硅胶解剖皿
Sylgard 硅胶弹性体试剂盒	World Precision Instruments	SYLG184	包被培养皿以制作解剖皿
解剖针	Various		在解剖过程中固定胚胎
NaCl	Various		aCSF 配方组分
KCl	Various		aCSF 配方组分
KH2PO4	Various		aCSF 配方组分
NaHCO3	Various		aCSF 配方组分
葡萄糖	Various		aCSF 配方组分
CaCl2	Various		aCSF 配方组分
MgSO4	Various		aCSF 配方组分
aCSF 容器。建议使用带盖的半透明广口 Nalgene 瓶，500 ml（16 oz）	CPLabSafety	QP-PLC-03717	在瓶盖顶部钻孔，以便玻璃鼓泡管插入液体中
5 ml 空玻璃小瓶或类似的透明小瓶	American Pharmaceutical Partners, Inc	6332300105	在 aCSF 孵育过程中用于将样品彼此分离，并与鼓泡气流隔离
连接至鼓泡装置的碳合气（95%O2 / 5%CO2）气罐	Various		通过管路连接至玻璃鼓泡管，用于向 aCSF 中通入气体
玻璃鼓泡管	Various		用于向 aCSF 中通入碳合气
弯头镊子	World Precision Instruments	501008	用于从蛋中取出胚胎头部
两把尖头镊子	World Precision Instruments	501985	用于显微解剖
50 ml 烧杯	various
罗丹明葡聚糖胺（RDA）	Invitrogen	various	荧光轴突示踪剂
Triton X-100	ICN Biomedicals
磷酸盐缓冲液（1× PBS）	Various		标准实验室试剂
薄壁玻璃毛细管，外径 1.2，内径 0.9，长度 4"（100 mm）	World Precision Instruments	TW120F-4	用于装载 RDA。每根毛细管可拉制两根玻璃微电极
针/移液器拉制仪	David Kopf Instruments	Model 720	使用参数：加热 16.4，电磁阀 2.2
Picospritzer	Parker Instrumentation	various	通过细管路连接至玻璃微电极
显微操作仪	Narishige	various
带荧光功能的解剖显微镜	Various
4% 多聚甲醛	Various		标准实验室试剂
抗神经丝蛋白抗体（可选）	Millipore	AB1991	遵循制造商推荐的组织学实验方案
切片用冷冻切片机及相关材料	Leica	various
用于成像的落射荧光显微镜	Zeiss, various