激光捕获显微切割富集的神经元群体或单个神经元用于创伤性脑损伤后基因表达分析

摘要

我们介绍了如何使用激光显微切割技术（LCM），从损伤大鼠脑组织的冷冻切片中分离富集的海马神经元或单个神经元，以用于后续通过定量实时PCR和/或全基因组微阵列进行基因表达分析。

摘要

创伤性脑损伤（TBI）后长期认知功能障碍与海马区损伤诱导的神经退行性变相关。海马位于内侧颞叶，是学习、记忆和执行功能的关键脑区。^1,2 因此，我们的研究聚焦于海马体不同亚区中特定神经元群体的基因表达分析。激光捕获显微切割技术（LCM）由 Emmert-Buck 于 1996 年首次提出， 等.,³ 使得对单细胞以及来自异质组织（如包含数千种功能细胞类型的哺乳动物大脑）的富集细胞群体进行基因表达分析取得了显著进展。⁴ 我们采用激光显微切割技术（LCM）和一种成熟的创伤性脑损伤（TBI）大鼠模型，研究TBI发病机制背后的分子基础。在实施液体冲击型TBI后，于预设的时间点处死动物并迅速取出脑组织，立即置于干冰上速冻，随后在恒冷箱中进行切片制备。大鼠脑组织可包埋于OCT包埋剂后立即切片，也可在-80 °C下保存数月后再进行激光显微切割所需的切片。此外，我们还利用LCM研究TBI对昼夜节律的影响。为此，我们捕获位于视上交叉核（suprachiasmatic nuclei）的神经元，该区域含有哺乳动物大脑的主时钟。本文展示了如何利用LCM获取单个明确识别的神经元（受损并退变的Fluoro-Jade阳性神经元，或未受损的Fluoro-Jade阴性神经元）以及富集的海马神经元群体，用于后续通过实时PCR和/或全基因组微阵列进行基因表达分析。这些基于LCM的研究揭示，大鼠海马不同解剖区域的选择性易损性，反映在从这些不同区域通过LCM获取的神经元群体所呈现的差异性基因表达谱中。我们开展的单细胞研究结果表明，在比较死亡神经元与其邻近存活海马神经元的转录谱后，提示存在一种细胞生存调节机制（cell survival rheostat），可在TBI后调控细胞的死亡与存活。

引言

异质性组织的基因表达分析一直存在困难，哺乳动物大脑尤其如此，其包含约5,000种不同的细胞类型。⁴ 在激光捕获显微切割（LCM）技术出现之前，关于创伤性脑损伤（TBI）影响的基因组学研究 体内 基于对脑细胞混合群体中基因表达的分析，该细胞群体不仅包含不同类型的神经元细胞，还包含支持性的胶质细胞和免疫调节细胞。从这些异质性组织中获得的复杂基因表达谱，以及损伤诱导的细胞信号通路中常见的相互矛盾的模式，可能是导致在TBI临床前研究中证明有效的治疗策略在人类临床试验中失败的原因之一。⁵

为了清晰理解大鼠海马中易损神经元群体在损伤后诱导的基因表达，我们采用了显微切割技术（LCM），该技术最初由 Emmert-Buck et al.³ 报道。随后，我们对该显微解剖技术进行了改进和优化，以高效捕获富集的神经元群体及单个神经元，用于通过定量实时 PCR 和微阵列分析进行 mRNA 表达谱分析。为了在冰冻脑组织切片中保持 mRNA 的完整性，以便进行基因组分析，我们对现有的固定、染色以及从大鼠冰冻脑切片中快速捕获神经元的操作流程进行了修改。为了识别和分离受损及正在死亡的海马神经元，我们还优化了适用于显微切割的 Fluoro-Jade 染色技术。Fluoro-Jade 无法区分凋亡性与坏死性细胞死亡，因此该染色法可检测所有类型的变性神经元^6,7。

在此，我们描述了本实验室用于获取单个死亡或存活神经元群体以及不同神经元细胞类型富集区域的实验方案即 用于TBI后基因表达分析的CA1-CA3神经元）。本实验室实施的液体冲击性脑损伤操作步骤详见Shimamura 等.,⁸ 并且与 JoVE 上由 Alder 发表的小鼠侧向流体打击损伤模型方案非常相似 等.⁹ 由于激光显微切割技术已被证明对组织中DNA、RNA和蛋白质的完整性影响极小或无影响，因此该技术是进行特定细胞类型分子和蛋白质分析的理想工具。

方案

1. 手术操作与液体冲击性创伤性脑损伤

1. 所有动物实验均须首先获得德克萨斯大学医学分部（位于德克萨斯州加尔维斯顿）机构动物照护与使用委员会以及《美国国立卫生研究院实验动物照护与使用指南》（第8版，国家研究委员会）的批准。
2. 大鼠（成年雄性Sprague-Dawley大鼠，体重400–500 g，购自Charles Rivers公司，缅因州波特兰）每笼饲养两只，在使用前一周内，于动物饲养室中自由摄食饮水，环境条件保持恒定：光照周期（600时至1800时）、温度（21 °C至23 °C）和湿度（40%至50%）。
3. 使用4%异氟烷对大鼠进行麻醉，实施气管插管，并通过机械通气装置（NEMI Scientific；New England Medical Instruments，马萨诸塞州梅德韦）以氧气与空气混合气（70:30）中含1.5–2.0%异氟烷维持麻醉，随后按先前所述方法准备进行矢状旁液滴冲击损伤模型实验。^8,10
4. 根据实验设计，在损伤后的适当时间点处死大鼠。迅速取出脑组织，立即置于干冰上冷冻，随后在50 ml离心管中于-80 °C保存，或立即进行OCT包埋以制备冷冻切片。

2. 大鼠脑组织切片与染色

1. 未立即使用的脑组织可在 -80 °C 下保存长达一个月，前提是保持恒定温度。将脑组织在 -80 °C 冻存后，解冻至 -20 °C 进行切片，再重新冻存，第二次解冻后无法获得高质量的 RNA。一旦脑组织解冻、包埋于 OCT 并完成切片，载玻片应在 24 小时内染色，并在染色后 30 分钟至 1 小时内用于激光显微切割（LCM），以确保 RNA 质量良好。LCM 完成后，捕获细胞的 LCM 盖帽可置于裂解缓冲液中于 -80 °C 保存最多一周，但应尽快提取 RNA，以保证最高质量。
2. 在切片前，用 RNase-Zap 擦拭冷冻切片机，并用 ETOH 清洁刷子（每次处理不同脑组织之间需更换一次性刀片）。
3. 从 -80 °C 冰箱中取出装有脑组织的 50 ml 离心管；将其放入温度为 -22 °C 的冷冻切片机中，在管内解冻约 10 分钟。将脑组织从管中取出，置于纱布上，腹面朝上固定于切片台上。
4. 使用剃刀片切除小脑前方的脑后部以及视交叉处的脑前部。在冷冻模具中加入 OCT 包埋介质（Tissue Tek），将脑组织前部向下放入模具中。待脑组织在包埋介质中冻结至变白（约 10 分钟）。
5. 用 OCT 将样本盘（Tissue Tek）冻结在脑组织上。将脑组织从模具中取出，插入样本头并拧紧固定螺丝。
6. 将一次性低剖面刀片（Fisher Scientific）插入刀架中，并压紧杠杆。
7. 以 20 μm 开始切片，去除外层 OCT。当切至海马区域时，将微米调节旋钮设为 10。通过将玻璃载玻片或正电荷载玻片置于组织切片上收集连续冠状切片（Fisher Scientific）。切片完成后，将载玻片保存于 -20 °C 的无 RNase 染色架中。
8. 为去除处理组织切片所用玻璃器皿中的所有 RNase，使用 Eliminase（Fisher Scientific）擦拭所有染色容器和量筒，并用 Milli Q 水冲洗。所有溶液均使用无 RNase 水配制，并在使用前用 0.2 μm 滤器过滤 cresyl violet（Sigma-Aldrich）和 Fluoro-Jade（Histo-chem）染液。
9. 在室温下解冻脑切片 30 秒，并在 75% ETOH 中固定（1 分钟）。
10. 固定后进行单个损伤神经元的 LCM 时，将载玻片在无 RNase 水中漂洗（1 分钟），用 1% cresyl violet 复染（15–20 秒），在无 RNase 水中漂洗（2 × 30 秒），再用 Fluoro-Jade 染色（4 分钟），在无 RNase 水中漂洗（3 × 1 分钟），依次用由无 RNase 水配制的 95% ETOH（30 秒）、100% ETOH（30 秒）和二甲苯（2 × 3 分钟）脱水。
11. 固定后进行神经元条带区域 LCM 时，将载玻片在无 RNase 水中漂洗（1 分钟），用 1% cresyl violet 染色（1 分钟），在无 RNase 水中漂洗（3 × 1 分钟），依次用 95% ETOH（2 × 30 秒）、100% ETOH（2 × 30 秒）和二甲苯（2 × 3 分钟）脱水。
12. LCM 前，在通风橱中将所有切片风干 15 分钟。若需转移载玻片，可将其切片面朝上存放于内衬干燥剂的玻片盒中。但最佳结果是在切片干燥后立即进行 LCM。LCM 操作时间应控制在 30 分钟至 1 小时内。在下一节中，我们首先描述如何捕获连续的细胞条带，这对初学者而言最容易掌握；随后描述如何精确捕获单个神经元。在本实验流程中，我们通过 Fluoro-Jade 染色识别正在死亡的神经元——该染料是变性神经元的标志物。未染上 Fluoro-Jade 的细胞被视为存活神经元。

3. 激光显微切割（LCM）

海马神经元富集群体的激光显微切割

1. 使用 PixCell IIe 显微镜（Life Technologies）配合红外二极管激光器进行激光显微切割（LCM）。
2. 将中心操纵杆调整至垂直位置。旋转并锁定 4X 物镜至工作位置。
3. 将载玻片置于显微镜载物台中央，并手动调节至海马区位于视野范围内。使用粗调和细调焦旋钮将图像调至清晰。
4. 按下控制器上的真空按钮，启动真空吸盘。旋转并锁定 10X 物镜到位，再次使用粗调和细调进行对焦。
5. 将 CapSure Macro LCM 盖帽（Life Technologies）装入 CapSure 胶囊模块中，并将盖帽移至装载线位置。旋转盖帽放置臂并将其定位在盖帽周围，抬起盖帽放置臂，将 CapSure 盖帽从胶囊模块中取出。
6. 将盖帽放置臂旋转至载玻片上方，并将臂下降至载玻片上，从而将盖帽放置于载玻片表面。调节细调焦旋钮，并移动操纵杆，检查细胞是否位于盖帽上的黑色圆圈内。所有捕获的细胞均应位于该黑色圆圈内。
7. 设置激光参数。首先按下控制器上的激光启用按钮。激光目标点将在计算机显示器的视野中显示为一个粉红色光点。
8. 将激光光斑大小设为小（7.5 μm），以聚焦激光，并根据需要将激光功率和持续时间调整至 65–75 mW 和 1.0–2.0 msec，以实现最佳细胞捕获效果。
9. 为测试激光，使用操纵杆将激光点移至无细胞区域进行发射。使用拇指开关触发激光。再移动操纵杆使激光点离开已熔化的聚合物区域，检查是否在激光发射处形成一个清晰区域，周围环绕可见的深色环。
10. 为捕获细胞，使用操纵杆将激光点移至目标细胞区域，使用拇指开关触发激光。在发射激光的同时移动操纵杆，以捕获较大范围的细胞。激光发射时会使盖帽上的热塑性聚合物膜熔化并粘附于目标细胞表面。该聚合物吸收激光辐射，从而不破坏RNA、DNA或蛋白质，确保样本在后续分子应用中的完整性。
11. 完成所有目标细胞的激光发射后，抬起盖帽放置臂。捕获的细胞将从组织切片上分离，并粘附于 CapSure 盖帽上。剩余组织及缺失的细胞将在视野中可见。也可将盖帽置于载玻片的空白区域观察盖帽上的细胞。
12. 抬起盖帽放置臂，并将其旋转至盖帽卸载站。将盖帽降入卸载站，然后将盖帽放置臂旋回原位。
13. 沿平台滑动 CapSure 插入工具至盖帽上方，抬起工具，盖帽将保持附着状态。轻轻将盖帽接触 CapSure 清洁垫，以去除不需要的组织残留。
14. 将盖帽放入含有 100 μl 裂解缓冲液的 0.5 ml 无RNase离心管中（裂解液来自 RNAqueous Micro-Isolation Kit）。立即涡旋震荡盖帽 30 秒以裂解细胞。将样品在 42 °C 下孵育 30 分钟，随后于 -80 °C 冻存，直至进行RNA提取。

海马区单个 FJ+ 神经元的激光显微切割

15. 为捕获单个细胞，将 CapSure HS LCM 盖帽装入 CapSure 试剂盒模块，并将盖帽置于加载线位置。旋转盖帽放置臂并将其定位至盖帽周围。抬起盖帽放置臂，将 CapSure 盖帽从试剂盒模块中取出。
16. 将激光光斑尺寸设为小（7.5 μm），以聚焦激光，并将激光功率和持续时间调整至 65–75 mW，脉冲时间为 0.45–0.50 msec，以实现单细胞的最佳捕获效果。
17. 将盖帽放置臂旋转至载玻片上方，并将臂向下降低至载玻片表面，使盖帽接触载玻片。在激光显微切割（LCM）过程中，CapSure HS 盖帽表面高于样品位置。
18. 使用操纵杆将激光移动至单个 FJ+ 细胞上方。所有待捕获的细胞必须位于盖帽上的小黑色圆环区域内。使用拇指开关触发激光。
19. 当黑色圆圈区域内的所有细胞均已被激光照射后，抬起盖帽放置臂。被捕获的细胞将从组织切片上分离，并粘附至 CapSure HS 盖帽上。
20. 将另一张载玻片置于显微镜载物台上，继续收集 FJ+ 细胞，直至 HS 盖帽收集满。将盖帽放入盛有 40–50 μl 裂解缓冲液的 0.5 ml 无 RNase 管中。立即涡旋震荡盖帽 30 秒以裂解细胞。将样品在 42 °C 下孵育 30 分钟，随后于 -80 °C 冻存，直至进行 RNA 提取。

4. 从LCM样品中提取总RNA（本节仅在视频演示中进行描述）

1. 使用 RNAqueous-Micro 试剂盒（Ambion）按照制造商提供的方案从细胞中分离总 RNA。该试剂盒中包含所有试剂和洗涤液。通过向滤膜中加入 30 μl 裂解液缓冲液预润湿微型滤过柱组件，室温静置 5 分钟后，在 10,000 × g 条件下离心 30 秒。
2. 向样本裂解液中加入 3 μl LCM 添加剂，用移液器吹打混匀，然后离心。
3. 向样本裂解液中加入 52 μl 100% 乙醇（1/2 体积），用移液器吹打混匀，然后将裂解液转移至滤柱中。
4. 在 10,000 × g 条件下离心滤柱 1 分钟，使 RNA 结合到柱上。若一个样本有多个上清液，应将各份裂解液分别通过同一滤柱离心。
5. 按照 RNAqueous Micro 试剂盒说明书完成 RNA 分离步骤。
6. 对 LCM 获得的 RNA 样本进行 DNase 处理及 DNase 失活操作（按试剂盒说明进行），将 RNA 转移至无 RNase 的离心管中，并于 -80 °C 保存。

5. RNA 定量与下游应用

使用安捷伦生物分析仪（Agilent Bioanalyzer）及微量试剂盒（Pico Kit，安捷伦科技公司，美国加利福尼亚州圣克拉拉）按照制造商提供的操作说明对RNA的质量和浓度进行评估与定量。

1. 使用安捷伦生物分析仪 2100（Agilent Technologies）对总 RNA 进行分析。软件通过为每个样本分配一个从 1 到 10 的 RNA 完整性数值（RIN），来评估 RNA 样本的浓度和完整性。1–5 表示 RNA 已降解，7–10 表示 RNA 质量良好。
2. 将使用未降解的完整 RNA 进行实时 PCR 分析，包括个体 Taqman 检测或基于 Sybr-green 化学法的 RT2 分析谱阵列。该 RNA 还可用于 mRNA 芯片分析和 microRNA 芯片分析。

结果

在我们首次进行的激光显微切割（LCM）研究中，我们发现大鼠海马体内功能不同的亚区（CA1和CA3）具有反映其对创伤性脑损伤（TBI）易感性的基因表达谱。⁸ 图1A-1C展示了在激光显微切割前后，海马区锥体神经元（CA1-CA3）、齿状回神经元以及视交叉上核（SCN）神经元的激光捕获过程。宏帽上显示了分别对锥体细胞、颗粒细胞或SCN神经元的清晰捕获。图2A-2B展示了在激光显微切割前后，呈Fluoro-Jade阳性（正在死亡）的锥体神经元和Fluoro-Jade阴性（存活）的锥体神经元。通过观察捕获后LCM帽上的细胞，可确认对死亡或存活神经元的成功且纯净的捕获。

激光显微切割（LCM）后，总RNA可用于多种分子学研究，包括使用TaqMan或SYBR Green化学法进行基因表达的定量实时PCR分析（图3A）、采用SYBR Green探针的小规模靶向PCR阵列（图3B）或全基因组微阵列研究（图3C）。

图 1. 从大鼠脑组织中激光捕获显微切割特定细胞群的区域。 大鼠脑组织的冷冻冠状切片（厚度为 10 μm）经乙醇固定后，使用尼氏染色（焦油紫）染色，并进行 LCM 前处理。图中展示了 LCM 操作前后的大鼠海马体和视交叉上核图像，以及在 Macro Caps 上观察到的捕获细胞。 A. 来自大鼠海马体 CA1-CA3 区域的锥体神经元。 B. 海马体齿状回中的颗粒细胞。 C. 位于第三脑室两侧、视交叉上方的双侧视交叉上核。 点击此处查看高清大图。

图2. 从大鼠海马组织中激光捕获显微切割单个神经元。 图中显示A. 变性、Fluoro-Jade阳性（染色）的海马CA3区神经元，以及B. 存活、Fluoro-Jade阴性（未染色）的CA3区神经元在激光捕获显微切割前后的图像。已捕获的细胞可见。 点击此处查看高清大图。

图3. 激光捕获神经元中分离的总RNA的基因表达分析。 A. 视交叉上核（SCN）中昼夜节律钟基因表达的定量实时PCR数据。B. 濒死和存活的海马神经元中基因表达的热图，显示使用靶向PCR阵列检测的凋亡相关基因的表达。C. 对接受假手术、创伤性脑损伤（TBI）或TBI联合重组腺相关病毒siRNA（旨在抑制脑损伤诱导基因表达，包括神经元型一氧化氮合酶和谷胱甘肽过氧化物酶-1）处理的大鼠海马CA1-CA3区神经元进行的Agilent全基因组微阵列基因表达分析。点击此处查看高清大图。

讨论

这种激光显微切割技术使我们在理解创伤性脑损伤（TBI）的分子机制方面取得了重要进展。^{8,10,11,12,13} 我们是首批利用该技术证明大鼠海马不同亚区具有与各自选择性易损性相关的基因表达谱的研究者。我们的研究显示，通过qPCR可对低至10个激光捕获细胞的基因表达进行定量分析，并且可对低至600个捕获细胞进行全基因组微阵列分析。LCM技术在研究其他已知参与多种神经系统及神经精神疾病的大脑区域时也将成为一种有价值的工具。例如，已有研究利用LCM揭示了帕金森病中黑质多巴胺能神经元的发病机制，¹⁴ 并推动了对伏隔核的全基因组表达谱分析，该脑区参与与物质滥用障碍相关的奖赏环路。¹⁵

神经元异质性在基因组水平上有所体现¹⁶，这可能是导致创伤性脑损伤（TBI）的实验性治疗方法在临床试验中疗效不佳的原因之一。因此，我们的目标是利用该技术探究影响TBI后神经元存活的关键因素。我们近期针对TBI后死亡神经元及其邻近存活的海马神经元开展的全基因组表达谱分析研究表明，细胞命运由细胞存活基因与细胞死亡基因表达水平的比值所构成的细胞稳态调节机制（cellular rheostat）所决定。这些持续进行的研究将有助于设计和开发能够正向调控细胞存活稳态调节机制的药物治疗策略。此外，我们目前正利用激光显微切割技术（LCM）追踪并监测潜在治疗药物对TBI后海马神经元的作用效果。因此，我们的研究证明，只要采用严谨的无RNase操作技术并对现有实验方案进行适当优化，即可从LCM获取高质量的RNA样本，用于准确的定量基因表达分析。

然而，激光显微切割（LCM）技术存在一些潜在问题。例如，完全避免小胶质细胞污染而仅收集神经元细胞几乎是不可能的。在海马体的锥体细胞层中，据估计约95%的细胞为神经元，其中90%为锥体细胞，10%为中间神经元，其余仅占很小比例的为胶质细胞及其他细胞类型。^8,17,18 在我们的研究中，使用Fluoro-jade这种荧光染料，它能特异性地标记脑组织中受损的神经元。若要标记小胶质细胞，则需要使用另一种针对GFAP的染色方法。¹⁹ 仅收集经Fluoro-jade染色的单个神经元胞体，可确保获得更为均一的神经元群体。另一个可能需要排查的常见问题是激光发射时未能定义出切割区域。若出现此情况，需检查激光设置，并根据需要调整激光功率和作用时间。此外，必须确保捕获帽平整地放置在组织上，并正确安装于机械臂中。必要时应参考LCM技术手册或联系技术支持。在完成激光显微切割及RNA提取后，所有RNA样本的质量均应在进行基因表达分析前通过生物分析仪进行评估。

目前市场上有多种激光捕获仪器，包括激光切割仪（Life Technologies、Leica Microsystems）和激光弹射仪（Zeiss）。我们的激光显微切割（LCM）系统适用于捕获少量细胞。其他高通量且更自动化的系统可能更适合获取大量细胞，用于基因组学尤其是蛋白质组学分析。事实上，使用这些自动化系统进行激光显微切割在分析特定细胞或富集细胞群体中蛋白质表达方面具有巨大潜力²⁰。此外，激光显微切割可促进对免疫标记细胞的基因表达分析²¹，使我们能够在最复杂的异质组织中，针对特定细胞类型研究其基因表达。因此，激光显微切割是进行单个细胞或富集细胞群体前沿分子研究的优秀工具。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
PixCell IIe 激光捕获显微镜	Life Technologies （Arcturus）
Agilent 2100 生物分析仪	Agilent Technologies
RNAqueous Micro- Kit	Life Technologies （Ambion）	AM1931
Agilent 6000 Pico Kit	Agilent Technologies	5067-1513
Capsure LCM caps	Applied Biosystems	LCM0211/LCM0214
Fluoro-Jade	Histo-chem Inc.
甲酚紫乙酸酯	Sigma-aldrich	C5042-10G
二甲苯（组织学级）	Fisher Scientific	X3P-1GAL
乙醇 200 证明（组织学级）	UTMB 药房
无 RNase 屏障移液器吸头	Fisher Scientific	2123635， 212364， 212361， 21-236-2A
Arcturus 激光捕获显微切割系统（Life Technologies） 蔡司激光显微切割 PALM 系列 徕卡显微系统