本文描述了一种在显微镜腔室中构建黏附性梯度和可溶性梯度的方法，用于活细胞迁移研究。该人工构建的环境结合了抗污表面与黏附轨迹以及溶液梯度，从而可确定不同导向信号之间的相对重要性。
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摘要
摘要
细胞能够感知并朝向更高浓度的黏附性信号（如细胞外基质中的糖蛋白）以及可溶性信号（如生长因子）发生迁移。本文介绍一种在微流控腔室中建立方向相反的黏附性信号与可溶性信号梯度的方法，该方法适用于活细胞成像。首先使用聚-L-赖氨酸与聚乙二醇的共聚物（PLL-PEG）对玻璃盖玻片进行钝化处理，以防止生物分子和细胞的非特异性吸附。随后，采用微接触印刷或蘸笔光刻技术在钝化表面上制备链霉亲和素的轨迹，作为生物素化肽段精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）的锚定位置，从而形成黏附性信号。将微流控装置置于修饰后的表面，并用于在链霉亲和素轨迹上建立黏附性信号梯度（100% RGD 至 0% RGD）。最后，利用同一微流控装置在与黏附性信号梯度相反的方向上建立趋化因子（如胎牛血清，FBS）的浓度梯度，作为可溶性信号。
引言
定向细胞迁移是多种细胞的基本特性，在许多正常的生理过程中起着关键作用，包括胚胎发育、抗感染防御以及伤口愈合。此外，细胞迁移还在多种疾病中发挥重要作用，例如血管疾病、肿瘤细胞转移和慢性炎症1,2。尽管细胞迁移的经典阶段——极化、突起延伸、黏附形成、力的产生以及尾部回缩——已普遍被接受3,4，但揭示信号整合如何在时空上协调的机制仍具有较大挑战性。
细胞外基质（ECM）作为细胞黏附的底物，通过其内在的化学5和物理6多样性，为细胞迁移提供方向性引导信号7,8。除了这些黏附性信号9之外，可溶性因子10-12（如趋化因子和生长因子）也可通过趋化因子受体及其下游促运动信号通路诱导细胞定向迁移。目前尚不清楚黏附受体（例如整合素）或趋化因子受体（如受体酪氨酸激酶RTK）在介导细胞响应和信号传导中哪一个占主导地位，也不清楚这些受体系统的层级关系是否具有细胞类型特异性。
活细胞显微镜技术能够提供大量在群体实验中无法获得的信息，并可与微流控装置结合，用于生成固定化13,14和可溶性信号分子的浓度梯度15,16。本文所述方法结合一系列简单且成熟可靠的表面修饰步骤，以及一种市售的微流控腔室，构建了一种可用于细胞迁移研究的成像分析系统，该系统可轻松在细胞生物学实验室中实施（图1）。组装完成的微流控装置具有与玻璃相当的光学性能17，且可扩散分子的浓度梯度至少在16小时内保持稳定。该系统适用于落射荧光及多种高级显微成像技术。与其他趋化实验装置18不同，该系统特别适合记录迁移速度较慢的贴壁细胞。重要的是，该系统具有模块化设计，可方便地引入不同的黏附性或可溶性迁移诱导信号，并适用于多种细胞类型的检测。
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方案
1. 使用 PLL-PEG-生物素对玻璃盖玻片进行钝化处理
此步骤旨在使表面钝化，从而使细胞能够黏附并迁移至通过微接触印刷（步骤2-3a）或蘸笔光刻（步骤3b）在玻璃盖玻片上形成的特定区域。钝化过程中使用一种由聚-L-赖氨酸（PLL）和聚乙二醇（PEG）组成的共聚物，其中20%的PEG分子被接枝到生物素上（PLL-PEG-生物素）。
- 为了清洗玻璃盖玻片（18 mm × 18 mm），将其放入装有100%乙醇的支架中，并将支架置于超声波清洗仪中处理30分钟。随后在空气中或氮气流下干燥玻璃盖玻片。
- 接着，将玻璃盖玻片在1 M NaOH溶液中进行超声处理30分钟。之后，将支架小心浸入盛有1.5 L Milli-Q H2O的烧杯中，清洗玻璃表面。每次使用新鲜的Milli-Q H2O，重复清洗过程三次。将玻璃盖玻片在60 °C的烘箱中干燥。
- 将一半洁净的玻璃盖玻片分别放入湿润室中（湿润室由一个部分装有H2O的24孔板构成）。在每片玻璃盖玻片上滴加15 μl PLL-PEG-生物素（1 mg/ml）的PBS溶液。取剩余洁净盖玻片的另一半，小心地与含有PEG溶液的盖玻片叠合并形成夹心结构。将夹心结构的盖玻片在湿润室中静置1小时。轻轻滑动分离夹心结构的盖玻片，避免刮擦PEG涂层表面，并用Milli-Q H2O冲洗。水应能轻易从PEG处理的一侧滑落。如有需要，将处理面朝上放置在纸巾上进行风干。将玻璃盖玻片储存于真空干燥器中，待后续使用。
2. 微接触印刷用印模的制备
我们描述了两种将链霉亲和素轨迹图案化到钝化玻璃盖玻片上的方法。第一种是微接触印刷，通常需要先制备硅模板，再用其浇铸PDMS印章。在本实验中，PDMS印章上的图案为宽100 μm、中心间距290 μm、特征高度为25 μm的线条。下文简要描述了如何制备合适的硅模板（步骤2.1–2.3）和PDMS印章（步骤2.4）。然而，文献中已有多种关于微接触印刷的方案19-23，适用于在玻璃盖玻片上印制蛋白质图案。此外，模板也可定制或从商业渠道购买。
- 首先，将硅片（直径 4 英寸）浸入piranha溶液（浓硫酸与30%过氧化氢按体积比3:1混合）中孵育20分钟进行清洗。用MilliQ H2O彻底冲洗硅片10次。在150 °C烘箱中过夜干燥硅片。
- 用100%丙酮冲洗洁净干燥的硅片，随后用100%异丙醇冲洗。接着，在硅片上旋涂2 ml GM1070 SU-8光刻胶（Gersteltec Sarl），转速为3,100 rpm，持续40秒，形成厚度为25 μm的涂层。然后将样品在热板上于65 °C加热5分钟，再于95 °C加热5分钟。
- 使用带有目标图案的掩膜版（例如Quintel Q6000掩膜对准仪）对SU-8光刻胶进行60秒紫外光曝光，并重复步骤2.2中所述的烘烤过程。随后将硅片浸入SU-8显影液（Gersteltec Sarl）中显影4分钟，再用100%异丙醇冲洗，并在氮气流下吹干。未被紫外光照射的SU-8光刻胶区域因此被去除，从而形成与PDMS印章相对应的反向图案。
- 下一步是从硅模板浇铸PDMS印章。首先，将1份（质量比）固化剂与10份弹性体预聚物（Sylgard 184）充分混合。为去除气泡，将混合物置于连接真空泵的干燥器中脱气1小时。然后，将PDMS弹性体倒入培养皿中的硅模板上，厚度约为1 cm，并在70 °C烘箱中固化1小时。最后，将PDMS印章从硅模板上剥离，并裁剪至所需尺寸。
3. 在钝化玻璃盖玻片上构建链霉亲和素或黏附信号图案
在对玻璃盖玻片进行钝化处理后，通过微接触印刷（步骤 3a）或蘸笔纳米光刻（步骤 3b）打印蛋白质图案。在本实验中，链霉亲和素被印制成线条状，作为构建 RGD 梯度的基础（步骤 4）。相同的方法也可用于打印基质蛋白，以形成黏附性图案。
一种用于在表面图案化生物分子的微接触印刷替代方法是蘸笔光刻技术。在蘸笔光刻中，使用悬臂梁将少量溶液转移到表面。悬臂梁的尺寸、溶液的黏度、悬臂梁与表面的接触时间、表面的疏水性以及打印腔室内的湿度共同决定了所打印特征的大小。该方法的优点是每次实验均可打印不同的图案，无需制备母版和印章。其缺点是打印特定图案所需时间较长，且蘸笔光刻需要专用仪器，而这类仪器在许多实验室中可能并不具备。我们所使用的蘸笔光刻仪器为Bioforce Nanoscience公司的NanoeNabler。在此，我们打印了直径小于<10 μm的微小点，所用悬臂梁为SPT10型号。
3a. 微接触印刷（μCP）技术
- 为了清洁PDMS印章并使其更具亲水性，将PDMS印章的图案面置于紫外光和臭氧环境中处理1.5小时（例如，使用Bioforce Nanoscience公司的UV Ozone Procleaner）。或者，也可使用等离子清洗仪进行较短时间处理以达到相同目的。该过程可形成氧化的PDMS表面24，从而改善打印效果。
- 在臭氧或等离子处理后立即取10 μl链霉亲和素（1 mg/ml溶于PBS中），滴加并均匀涂布于PDMS印章表面，随后置于湿润环境中孵育1小时（例如置于部分装有液体的6孔板内，参见步骤1.3）。若需在荧光显微镜下观察轨迹，请使用与荧光染料偶联的链霉亲和素，如链霉亲和素-AlexaFluor350。
- 用纸巾去除印章表面多余的链霉亲和素，并在空气中干燥约1分钟。随后将印章轻轻按压到PLL-PEG-生物素包被的玻璃盖玻片上。
- 若在步骤3.a2中使用了荧光标记的链霉亲和素，可在落射荧光显微镜下观察所形成的图案。将打印后的表面保存于干燥器中。
3b. 微探针蘸笔光刻技术
- 首先，将1份1 mg/ml的链霉亲和素或链霉亲和素-AlexaFluor350与10份甘油（v/v）混合，取5 μl该混合物加载到悬臂上。然后按照蘸笔纳米光刻仪器的操作手册所述开始打印过程。为将斑点尺寸减小至约5 μm，可调节打印速度、悬臂与表面的接触时间或悬臂与表面之间的垂直距离。在图2c所示示例中，点阵以线状打印，行列间距设定为10–15 μm。此间距足以防止各点相互融合，同时可在大多数显微镜设置下于单个视野中观察到多个点。
- 将打印后的表面存放于干燥器中。
4. 在链霉亲和素图案化表面上构建黏附梯度
我们在涂有链霉亲和素的玻璃盖玻片上（图3）或在钝化处理的玻璃盖玻片上带有链霉亲和素图案的表面（图5），构建了生物素-RGD的黏附性梯度。为了形成表面梯度，我们使用了一种 commercially available 微流控装置（Ibidi 公司的 sticky-Slide Chemotaxis 3D），该装置通过被动扩散建立稳定的溶液浓度梯度。为了竞争链霉亲和素的结合位点，我们采用了两种方向相反的梯度：一种是生物素-RGD梯度，另一种是未与 RGD 偶联的游离生物素梯度（见图1）。
- 将包被或图案化链霉亲和素的玻璃盖玻片粘附到 sticky-Slide Chemotaxis 3D 装置的粘性侧。为确保数小时内无泄漏，需在装置边缘涂覆一层薄薄的温热凡士林，并再覆盖一层由1份凡士林与1份石蜡（质量比）混合而成的第二层密封。
- 在装置的通道中加入6 μl PBS。然后分别在两个储液池中加入70 μl浓度为0.03 μg/μl的生物素-4-荧光素（溶于PBS）和70 μl浓度为0.03 μg/μl的生物素-RGD（溶于PBS）。将样品置于室温避光条件下孵育1小时。
- 移除生物素溶液，并在微流控装置仍保持连接的状态下，用PBS小心冲洗表面两次。标记黏附梯度的方向，如需保存，可将装置内充满PBS后置于4 °C，但需确保装置不干燥。必要时，可用荧光显微镜分析黏附梯度。
5. 活细胞成像中使用荧光染料标记细胞
细胞使用荧光染料进行标记，以便在荧光显微镜下追踪细胞。常用的探针为荧光细胞器标记物，例如 Syto 64 Red，可标记细胞核。具体操作如下：首先将细胞用 PBS 洗涤三次，然后在培养基中加入 1 μM Syto 64 Red，孵育 45 分钟，最后再用 PBS 洗涤三次。请注意，细胞不应长时间保存在 PBS 中。
用于细胞示踪的替代染料包括CellTracker系列，这类染料可标记细胞质，并在细胞迁移和分裂过程中保持滞留。通过转染使细胞表达荧光融合蛋白，特别适用于记录目标蛋白在迁移过程中的亚细胞分布。然而，荧光蛋白通常比有机染料更容易发生光漂白，因此可能无法实现长期观察。
6. 将细胞加载至微流控装置中的可溶性梯度环境
- 计数荧光标记的细胞，并均分为两管，每管细胞数量相等。用含有趋化因子的培养基（如含10%胎牛血清（FBS）的低糖Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM））洗涤并重悬其中一管细胞；用不含趋化因子的培养基洗涤并重悬另一管细胞。 即 含0% FBS的DMEM。每管中细胞的终浓度应为5 × 105 细胞/毫升
- 移除微流控装置中的所有溶液（见步骤 4.3），并将装置置于显微镜载物台上（见步骤 7）。加入 70 μl 细胞悬液（5 x 105 细胞/ml，置于无FBS的DMEM中）加入一个储液槽，再将70 μl HeLa细胞（5 × 10⁵5 细胞/ml，含10% FBS的DMEM）转移至另一容器中。在储液槽上方松松地贴上胶带，以防止蒸发。如果细胞在成像前需要预孵育，则建议将细胞加载至装置时使用不含浓度梯度的生长培养基。随后将装置置于显微镜载物台上，并将培养基更换为具有浓度梯度的培养基 即 一个储液槽中为不含FBS的DMEM，另一个储液槽中为含10% FBS的DMEM。
7. 活细胞成像与数据分析
- 打开显微镜（Nikon Ti-E），并在实验开始前至少预热载物台1小时。
- 确保微流控装置的通道位于视野范围内，且细胞处于聚焦状态。选择图像采集参数，如曝光时间、荧光滤光片，以及明场与荧光的图像序列，以捕获细胞及其轨迹，并设置时间点和记录时长例如 每15分钟一次，持续16小时。
- 使用适当的软件（如 ImageJ Manual Tracking 或 Ibidi Chemotaxis and Migration Tool）分析数据。
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结果
为了理解细胞如何整合迁移信号25，我们开发了一种利用荧光显微镜对在存在竞争性黏附性梯度和可溶性梯度环境中迁移的细胞进行成像的方法（图1）。通过微接触印刷技术和蘸笔光刻技术，在基底上构建了包含荧光标记链霉亲和素和生物素化RGD的黏附轨迹（图2）。成功的微接触印刷可通过轨迹上荧光强度的线轮廓图来判断，其中黏附轨迹与抗污区域可被清晰区分（图2b）。蘸笔光刻打印出的点呈圆形而非泪滴形，表明打印过程成功。表面化学性质和湿度会影响打印结果。一般来说，表面疏水性越强，打印效果越好。
通过将生物素-4-荧光素和生物素-RGD分别加入微流控室的两侧，利用一个简单的微流控装置在打印的轨迹上创建了黏附性信号的梯度（图3）。由于这两种分子均可竞争性地结合到玻璃表面的链霉亲和素轨迹上，从而形成了固定化的RGD配体梯度。在去除生物素/生物素-RGD溶液后，可利用同一微流控室引入可溶性梯度，该梯度在微流控通道内至少可稳定维持16小时（图4<...
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讨论
在本实验方案中，我们采用了一种市售的微流控装置（Ibidi 公司的 sticky-Slide Chemotaxis 3D）来研究化学修饰表面以及趋化因子梯度对细胞迁移的影响。该微流控系统无需流体驱动，因为梯度通过通道长度方向上的扩散即可建立。这一点至关重要，因为流动可能对迁移速度不同的细胞产生差异性影响，例如迁移较慢、形成稳定黏着斑的成纤维细胞，以及迁移较快、形成小型黏着复合体和突触的大多数白细胞26。层流产生的剪切应力可能影响细胞对黏附信号的黏附稳定性，以及对可溶性趋化信号的趋化迁移行为27,28。我们观察到迁移较慢的 HeLa 细胞与迁移较快的 J774 细胞在迁移行为上存在差异，表明该微流控系统适用于黏附性较强和较弱的多种细胞类型。此类比较还揭示了不同类型细胞在对同时包含黏附信号（RGD 肽或纤连蛋白）和抗污区域（PEG 区域）的表面图案的黏附与迁移响应方面的有趣差异。
表面图案通过微接触印刷29和蘸笔光刻30,31技术制备。微接触印刷是一种简单、相对快速且可重复的图...
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披露
我们没有需要披露的商业利益。
致谢
作者感谢澳大利亚研究理事会和澳大利亚国家健康与医学研究委员会的资助，同时感谢澳大利亚国家制造设施为微接触印刷提供的SU-8母版。 SHN受到马来西亚高等教育 Ministry 和马来西亚理科大学的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 盖玻片染色器具 | Thomas Scientific | 8542 E40 | 盖玻片架 |
| 烘箱 | Binder | ED 53 系列 | |
| 硅片 | Silicon Quest | 708-007 | 硼掺杂 <100> 晶圆，直径 4"，厚度 500 μm，单面抛光 |
| GM1070 SU-8 光刻胶 | Gersteltec Sarl | ||
| SU-8 显影液 | Gersteltec Sarl | ||
| Sylgard 184 固化剂 | Dow Corning | ||
| Sylgard 184 弹性体预聚物 | Dow Corning | ||
| PLL-PEG-生物素（20%） | SuSos AG | PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)/PEG(3.4)-Biotin (20%) | 1 mg/ml PBS 溶液 |
| 荧光素 | Sigma | 46955 | 1 mM PBS 溶液 |
| 链霉亲和素-AlexaFluor350 | Invitrogen | S-11249 | 1 mg/ml PBS 溶液 |
| 生物素-4-荧光素 | Invitrogen | B-1370 | 0.03 μg/μl PBS 溶液 |
| 生物素-RGD | GenScript | SC1208 | 0.03 mg/ml PBS 溶液 |
| Syto 64 Red | Invitrogen | S-11346 | 1 μM PBS 溶液 |
| Sticky Slide 趋化作用 3D | Ibidi | 80328 | |
| 200 μl Greiner 黄色斜面吸头 | Greiner Bio-One | 739261 | |
| 凡士林 | Sigma | 16415 | |
| 石蜡，熔点 55–57 °C | Sigma | 327204 | |
| Nano eNabler 10 μm 悬臂探针 | BioForce | SPT-S-C-10s | |
| Image J 软件 | 美国国立卫生研究院 | rsbweb.nih.gov/ij/download.html | |
| 手动追踪插件 | Fabrice Cordelières | rsb.info.nih.gov/ij/plugins/track/track.html | |
| 趋化与迁移分析工具 | Ibidi GmbH | www.ibidi.com/applications/ap_chemotaxis.html |
参考文献
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