创建的胶粘剂和可溶性梯度荧光显微镜成像细胞迁移

摘要

为组件的粘接剂和可溶性的梯度在显微镜室，用于活细胞迁移研究的方法，进行说明。该工程环境结合溶液梯度的防污表面和粘接剂的轨道，并因此允许一个确定指导线索的相对重要性。

摘要

细胞可以感知并移向较高浓度的粘合剂线索，如糖蛋白如生长因子的细胞外基质和可溶性线索。在这里，我们列出了反对梯度的粘合剂和可溶性线索，微流控室，这是兼容与活细胞成像的方法来创建。聚-L-赖氨酸和聚乙二醇（PLL-PEG）的共聚物，以钝化玻璃的盖玻片和防止生物分子和细胞的非特异性吸附。往下，微接触印刷或蘸笔光刻被用来创建轨道的链霉抗生物素蛋白上的钝化表面的生物素化的肽，精氨酸 - 甘氨酸 - 天门冬氨酸（RGD）作为粘接剂提示作为锚固点。一种微流体装置被放置到改性的表面上，并用于创建的梯度粘合剂线索（100％到0％的RGD RGD）上的抗生蛋白链菌素的轨道。最后，相同的微流体装置是用于创建的单核细胞趋化自吸的梯度h为牛胎儿血清（FBS），在相反的方向上的梯度的粘合剂线索作为可溶性提示。

引言

导演细胞迁移是许多细胞的基本属性，是许多正常的生理过程，包括胚胎发育，抗感染，促进伤口愈合的一个重要方面。此外，细胞迁移也起到了突出的作用，在许多疾病，如血管疾病，肿瘤细胞的转移和慢性炎症^1,2。虽然传统的状态的细胞迁移-极化，凸出延伸，形成粘连，力产生收缩和后收缩-被普遍接受的^3,4，阐明的时空信号集成协调机制，已是更具挑战性。

的胞外基质（ECM）作为细胞粘附的基板，并通过固有的化学和物理⁶多样性，提供用于细胞导航^7,8的方向提示。除了 ​​这些粘合剂线索^9，可溶性因子^{10-12 <}/ SUP>，如趋化因子和生长因子，可诱导细胞迁移通过定向趋化因子受体和其下游motogenic的信令。目前，参与和信令通过粘附受体（ 即整合），或如趋化因子受体，受体酪氨酸激酶（RTK），不知道是否是显性的。也不知道是否是细胞类型特异性受体系统的层次结构。

活细胞显微镜提供了丰富的信息，是不是可以批量检测，可以结合微流体装置，产生梯度的固定^13,14和可溶性线索^{15 16。}这里描述的方法采用了一系列的简单和既定一并用市售的微流体腔室，以创建一个成像检测细胞的迁移，可以很容易地在细胞生物学实验室（ 图1）实施表面改性步骤。组装的微流体装置具有与玻璃^17的光学品质的梯度的扩散的分子是稳定的，至少16小时。该系统可用于落射荧光和先进的显微镜技术。不像其他的趋化性的设置^18，这个系统是适合用于记录缓慢迁移，贴壁细胞。更重要的是，该系统是模块化的，很容易使引进替代的粘合剂或可溶性迁移暗示的各种细胞类型和检查。

方案

1。 PLL-PEG-生物素玻片上与钝化

这一步的目的是钝化的表面，从而使细胞的粘附和迁移到特定区域的盖玻片上所建立的（步骤2-3A）microcontract印刷或的蘸水笔平版印刷（步骤3b）。对于钝化，一个共同的聚合物的聚-L-赖氨酸（PLL）和聚乙二醇（PEG）中，使用20％的PEG分子被接枝到生物素（PLL-PEG-生物素）。

1. 要清洁的玻璃盖片（18毫米×18毫米），浸没在100％乙醇中的齿条，和放置在机架中的声波处理30分钟，浴。擦干玻璃盖玻片，在空气或氮气流中下。
2. 接着，在1 M NaOH中的30分钟超声的玻璃盖玻片。事后冲洗玻璃表面通过仔细的机架中浸入烧杯中充满了1.5 L的Milli-Q H _{2 O}新鲜的Milli-Q H _{2 O}每次使用三次重复冲洗过程。干燥盖玻片在60℃的烘箱
3. 将一半的干净的玻璃盖玻片单独在潮湿的腔室部分地填充有H _{2 O} 24 -孔的板，它是由掉落PLL-PEG-生物素（1毫克/毫升），在PBS中的15μl的每个玻璃盖玻片上。以剩余的干净的玻璃盖玻片的另一半和仔细夹心的PEG溶液。将盖玻片，在潮湿室1小时。轻轻滑动夹持盖玻片远离彼此不刮的PEG-涂覆的表面的情况下，他们用Milli-Q H _{2 O}冲洗水应该很容易滑落的PEG处理侧。如果需要，空气干燥的玻璃盖玻片纸巾上与处理过的表面朝上。存储的玻璃盖玻片，在真空干燥器中，直到进一步使用。

2。微接触印刷邮票的制作

我们描述了两种模式的链霉亲和轨道的过程钝化的盖玻片上。第一个，话筒rocontact印刷，通常需要制作的PDMS印章硅主投。在我们的例子中，PDMS印章上的图案是为100μm宽的线的特征高度为25μm，间距为290μm的中心到中心的。下面，我们简单地描述了如何制作一个合适的硅主（2.1-2.3）和PDMS印章（2.4）。但是，也有文献^19-23，这是适合用于打印到盖玻片上的蛋白质模式中描述的微接触印刷的多个协议。大师也可以进行定制，并从商业渠道购买。

1. 首先，在硅晶片（4"直径）清洁Piranha溶液（3:1体积比的硫酸和30％的过氧化氢 ​​）中孵育20分钟。彻底冲洗晶片用MilliQ H _{2 O中的} 10倍干燥的晶片在烘箱中在150℃CO / N。
2. 冲洗干净并干燥的硅晶片由100％的异丙醇，然后用100％丙酮。下旋涂2毫升GM1070 SU-8的光刻胶（Gersteltec Sarl的）在3100转的晶片上，持续40秒，以创建一个25μm厚的层。然后将样品在65℃的热板上烘烤5分钟，然后通过进一步的5分钟，在95℃下
3. 在SU-8的光致抗蚀剂暴露于UV光下，进行60秒的所需图案的光掩模（例如，使用掩模对准器Quintel Q6000），并重复烘烤过程中在2.2中描述。然后样品被开发的晶片浸渍在SU-8显影剂（Gersteltec Sarl公司）为4分钟，在100％异丙醇冲洗并在氮气流中干燥。由此除去未暴露于UV光的SU-8的光致抗蚀剂的区域的，创建的逆图案的PDMS印章。
4. 下一步是从硅主投PDMS印章。首先，彻底混合1份（重量/重量）的固化剂的弹性体预聚物与10份（Sylgard的184）。中去除任何空气气泡，脱气混合物在干燥器中连接到真空管线为1小时。接下来，倒入到陪替氏培养皿内的硅主的PDMS弹性体至约1厘米的高度，并在烘箱中在70℃下固化该主站和PDMS混合物1小时。最后，除去PDMS印章从硅主站，并切割成一定的尺寸。

3。钝化的盖玻片上的图案链霉亲和素或粘合剂线索

钝化盖玻片后，蛋白质模式上都印有微接触印刷（步骤3a）或蘸笔光刻技术（步骤3b）。在我们的例子中，链霉抗生物素蛋白的打印线，RGD梯度（步骤4）形成的基础。相同的步骤也可以用于印刷基质蛋白创建粘合剂图案。

到表面上的图案化的生物分子的微接触印刷的另一种方法是蘸笔光刻。在蘸笔光刻，以悬臂是用来传输一个小的表面上，溶液的体积。悬臂，V的大小iscosity的解决方案，在悬臂的表面上的接触时间，表面的疏水性和湿度在印刷室确定的大小印刷的功能。此方法的优点是，不同的图案可印每个实验，因为没有必要制作主人和邮票。它的缺点是，它需要更长的时间来打印一个给定模式和，蘸笔光刻技术需要专门的仪器可能无法使用在许多实验室。蘸水笔光刻工具，我们使用的是从Bioforce纳米NanoeNabler。在这里，我们印小点直径<10微米，我们SPT10悬臂。

3A。 "微接触的印刷（μCP）技术

1. 要清洁和使PDMS印章更具亲水性，在1.5小时的紫外线和臭氧（例如，紫外线臭氧Procleaner奈米从Bioforce）的PDMS邮票治疗图案侧。或者，也可以使用等离子吸尘器用于相同目的的时间更短。此过程创建的氧化的PDMS表面^24，从而提高了印刷过程。
2. 后立即臭氧或等离子处理，将10微升的链霉亲和素（1毫克/毫升在PBS中）和传播到PDMS邮票和离开1小时，在潮湿的腔室（例如在部分充满的6孔板中，见步骤1.3） 。如果轨道应该是在荧光显微镜下可见，使用链霉抗生物素蛋白，如链霉抗生物素蛋白-AlexaFluor350荧光团共轭。
3. 删除多余的链霉亲和素的邮票用纸巾和空气干燥的邮票约1分钟。 PLL-PEG-生物素包被盖玻片上，轻轻按下邮票。
4. 如果荧光链霉亲和素使用在步骤3.a2，检查落射荧光显微镜下使用的模式。印刷面储存在干燥器中。

3b所示。浸笔微影技术

1. 首先，将1份为1毫克/毫升链霉亲和素或STREptavidin-AlexaFluor350甘油与10份（体积/体积），并加载到悬臂5微升该混合物。然后开始印刷过程中，，蘸水笔光刻仪器的操作手册中所描述的。为了减少到约5μm的光斑尺寸，调整印刷速度，接触时间在悬臂的悬臂的表面上的表面或垂直距离。在图2c中所示的例子中，印刷在设置为10-15μm的行和列的分离的线与点。这个距离是足够的，以防止点从彼此合并成，但允许在一个字段中的观点与大多数显微镜设置多个点的观看。
2. 印刷面储存在干燥器中。

4。创建链霉亲和型面的胶渐变到

我们创建粘合剂梯度生物素-RGD的玻璃盖玻片上都涂有链霉抗生物素蛋白（ 图3）或共聚ntain钝化玻璃盖玻片上的链霉抗生物素蛋白的模式（ 图5）。要创建一个表面的倾斜度，我们使用市售微流体装置（称为粘性滑动趋化^三维 Ibidi）的梯度通过被动扩散，创建一个稳定的解决方案。为链霉抗生物素蛋白的结合位点的竞争，我们采用两个相对的梯度是不共轭的RGD序列（参见图1）的生物素-RGD和生物素。

1. 坚持的链霉亲和素包被或图案的盖玻片上的粘性面的粘幻灯片趋化^3D设备。为了确保有几个小时是无泄漏，而装置边缘有一薄层的温热凡士林和石蜡的1份（重量/重量）的混合物1份凡士林用第二层密封。
2. 填充与6μlPBS中的信道的信道的设备。然后填写70微升0.03μg/μL的生物素 - 荧光素在PBS和70米的两个水库U;升0.03微克/μL生物素-RGD的PBS，分别。的样品在室温下孵育1小时，在黑暗。
3. 移除的生物素溶液，并同时仍连接到的微流体装置，两次用PBS仔细冲洗表面。马克的粘接剂梯度的方向，并且如果需要的话，储存在4℃下用PBS填充设备，但确保该设备不干燥。如果需要，粘合剂梯度用荧光显微镜进行分析。

5。标签的萤光细胞与活细胞成像

将细胞用荧光染料，协助细胞在荧光显微镜下的跟踪标记。常见的探针荧光的细胞器标记物，如祥发64红，标记细胞核。要做到这一点，细胞首先被洗涤三次，用PBS 1μM祥发64红45分钟的培养基中，然后孵育，最后用PBS洗涤进一步三次。请注意，细胞不应该是在PBS中保持很长一段时间。

替代染料的细胞追踪CellTracker系列染色的细胞质，并保留在细胞迁移和分裂。转染的细胞与荧光融合蛋白是特别有用的，在迁移过程中记录感兴趣的蛋白的亚细胞分布。然而，典型的光漂白剂的速度比有机染料的荧光蛋白，使长期观测不可以有可能。

6。载入细胞的渐变成一种可溶性的微流体装置

1. 计数荧光标记的细胞分裂成两管相同的手机号码。洗净，重悬于一个管与媒体含有低葡萄糖Dulbecco的修改的Eagle培养基（DMEM）中，用10％胎牛血清（FBS）的趋化因子，如细胞。洗净，在媒体的细胞没有趋化， 即 0％FBS的DMEM悬浮管。的最终浓度每个试管中的细胞应为5×10 ⁵细胞/ ml。
2. 删除所有的解决方案，微流体装置（4.3），并把它放在显微镜载物台（见第7步）。 70微升的细胞（5×10 ^5个细胞/毫升0％FBS的DMEM中）加载到一个水库和70微升的HeLa细胞（5×10 ^5个细胞/毫升在10％FBS的DMEM中）到另一个。松松地将磁带的水库，以避免蒸发。如果细胞的表面上的预孵育成像之前，可取的做法是将细胞生长介质中的装置装入未经梯度。该装置然后被放置在显微镜载物台上，并用不含FBS的DMEM培养液梯度介质， 即在一个贮存器和DMEM含10％FBS在其他媒体取代。

7。活细胞成像和数据分析

1. 开关上的显微镜（尼康的Ti-E）和预热阶段在实验开始前至少1小时。
2. 确保通道的MICRofluidic的移动设备的视场中，细胞是在焦点。选择图像采集参数，如曝光时间和荧光过滤器，以及明场和荧光捕获细胞和曲目的图像序列的时间点，记录长度（ 例如，每15分钟16小时）。
3. 分析数据与适当的软件，如ImageJ的手动跟踪或者Ibidi的趋化和迁移工具。

结果

为了了解细胞整合洄游信号^25，我们已经开发了一种方法的图像细胞用荧光显微镜观察，与竞争的粘接剂和可溶性的梯度（ 图1）的环境中迁移。胶粘剂的轨道含有荧光链霉亲和素和生物素标记的RGD创建的微接触印刷的曲目和蘸笔光刻（ 图2）。成功的微接触印刷粘合剂轨道和防污区域可以清楚地加以区分（ 图2b）的磁道之间的荧光强度表示的线剖面。用蘸水笔平版印刷点印刷圆的，而不是撕裂状，表示一个成功的印刷工艺。表面化学和湿度影响的打印处理的结果。一般来说，更疏水的表面，更好的印刷成果。

一个渐变的胶粘剂线索在印刷的磁道被创建的一个简单的微流体装置，通过加载生物素-4-荧光素和生物素的微流体室的相反侧（ 图3）到RGD。由于两种分子竞争结合链霉抗生物素蛋白的玻璃表面上的轨道，RGD序​​列的配体的固定化梯度产生。除去生物素/生物素-RGD的溶液后，在相同的室内，可以使用引入可溶性的梯度，其中的微流体通道的至少16小时（ 图4）

讨论

在这个协议中，我们使用市售的微流体装置（粘性滑动的趋化^三维 Ibidi）的化学表面改性及对细胞迁移的趋化因子梯度的影响进行研究。因为梯度设立的沿该通道的长度的扩散，这种微流体设置不需要流。这是很重要的，因为流量差异影响慢慢迁移的细胞，如成纤维细胞，形成稳定的粘着斑和快速迁移细胞最喜欢的白细胞，形成协调配合物与突触小^26。从层流剪应力可能影响稳定的细胞粘附粘合剂的线索和细胞的趋化对水溶性线索^27,28。我们发现滞销HeLa细胞和快速移动的J774细胞，从而示出的微流体设置适用于两种类型的细胞粘附和减少粘附在迁移​​行为之间的差异。这种比较也reveale的ð有趣的区别类型的细胞粘附和迁移反应，表面图案，在包含两种粘合剂的线索（RGD肽或纤连蛋白）和防污区域（PEG领域）。

表面图案创建的微接触印刷²⁹和蘸笔光刻^30,31。微接触印刷是一个简单的，相对快速的，可重现的图案化工艺。不过，由于设计和制造的，这是实现通过光刻法，PDMS印章是更复杂的和耗时的。它还引入了其自身的局限性...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
盖玻片染色设备	Thomas Scientific	8542 E40	盖玻片架
烘箱	粘合剂		ED 53 系列
硅晶片	Silicon Quest	708-007	掺硼 <100>晶圆，直径 4 英寸，500 μm，单面抛光
GM1070 SU-8 光刻胶	Gersteltec Sarl
SU-8 显影	Gersteltec Sarl
Sylgard 184 固化剂	道康宁
Sylgard 184 弹性体预聚物	道康宁
PLL-PEG-生物素 （20%）	SuSos AG	PLL（20）-g[3.5]-PEG（2）/PEG（3.4）-生物素 （20%）	1 毫克/ml 在 PBS
荧光素	Sigma	46955	中 1 mM 在 PBS
链霉亲和素-AlexaFluor350	Invitrogen	S-11249	中 1 mg/ml 在 PBS
生物素-4-荧光素	Invitrogen	B-1370	0.03 &μ 中;g/μl 在 PBS
生物素-RGD	金斯瑞	SC1208	中 0.03 mg/ml 在 PBS
Syto 64 Red	Invitrogen	S-11346	1 &μ 中;M in PBS
粘性玻片趋化性 3D	同比迪	80328
200 μl Greiner 黄色斜面尖端	Greiner Bio-One	739261
凡士林	Sigma	16415
石蜡，mp 55-57 °C	Sigma	327204
Nano eNabler 10 μm 悬臂式	BioForce	SPT-S-C-10s
Image J 软件	美国国立卫生		rsbweb.nih.gov/ij/download.html
手动跟踪插件	Fabrice Cordelières		rsb.info.nih.gov/ij/plugins/track/track.html
趋化性和迁移工具	Ibidi GmbH		www.ibidi.com/applications/ap_chemotaxis.html