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在转基因鱼类完整大脑中记录特定神经元的电活动

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DOI：

10.3791/50312

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2013年4月30日

 , 
1Department of Physiology, University of California, Los Angeles

本文内容

摘要

在本视频中，我们将演示如何在保留复杂神经环路的全脑标本中记录已鉴定单个神经元的电活动。我们使用转基因鱼，其中促性腺激素释放激素（GnRH）神经元通过荧光蛋白进行基因标记，以便在完整脑标本中识别这些神经元。

摘要

通过使用可在完整脑组织中进行研究的模式系统，能够显著增强对调控复杂行为的神经回路细胞生理学的理解，在这种系统中，中枢神经系统（CNS）的神经回路保持完整。我们采用转基因鱼类，其中促性腺激素释放激素（GnRH）神经元通过绿色荧光蛋白进行基因标记，以便在完整脑组织中识别这些神经元。鱼类具有多个GnRH神经元群体，其功能取决于它们在脑内的位置以及所表达的GnRH基因1。本演示聚焦于位于端神经（TN）并与嗅球相关联的GnRH3神经元，使用的是转基因青鳉鱼的完整脑组织（图1B 和 C）。研究表明，青鳉鱼的TN-GnRH3神经元具有神经调质功能，可将来自外界环境的信息传递至中枢神经系统；它们并不像众所周知的下丘脑GnRH1神经元那样直接参与垂体-性腺功能的调控2, 3。TN-GnRH3神经元自发动作电位的紧张性放电模式是一种固有特性4-6，其放电频率可受到同种个体视觉线索2 和神经肽kisspeptin 15 的调节。在本视频中，我们使用一种稳定的转基因青鳉鱼品系，其TN-GnRH3神经元表达一种包含Gnrh3 基因启动子区域与增强型绿色荧光蛋白融合的转基因7，向您展示如何在全脑制备中识别神经元并监测其电活动6。

方案

1. 成年青鳉大脑的解剖

  1. 将成年雄性或雌性鱼（图1A）浸入5 ml MS-222（150 mg/L，pH 7.4）中进行麻醉；待鳃部运动停止后等待数分钟，再进行断头。所有操作均经加州大学洛杉矶分校机构动物护理与使用委员会批准。
  2. 在直径60 mm的培养皿中，用剪刀于鱼生理盐水中在鳃盖后端处将鱼断头。
  3. 将鱼头转移至一个直径35 mm、盛有鱼生理盐水的培养皿中，皿底铺有Sylgard，并设有凹槽以固定鱼头用于脑组织解剖；用昆虫针将鱼头背侧朝上固定。
  4. 用精细剪刀小心沿颅骨背侧边缘剪开，再用镊子轻轻取下颅骨，完全暴露脑的背侧部分，包括脊髓前部。
  5. 用尖头镊子轻轻提起脊髓，用精细剪刀切断脑腹侧的双侧连接神经：包括脑神经、脊神经和视神经，以及脑前部的嗅神经。
  6. 将完整解剖出的脑组织转移至盛有鱼生理盐水的新培养皿中，在显微镜下仔细检查，确保整个脑组织（包括垂体）完整无损，无任何切割或穿刺损伤。受损的脑组织不得用于实验。

2. 在记录室中安装脑组织

  1. 用针头将少量氰基丙烯酸酯或其他快干胶滴在记录室中央，并将胶水涂抹至约1 cm2的范围。
  2. 迅速转移脑组织，并将其腹面朝上固定在胶水上。
  3. 加入1 ml鱼类生理盐水，使记录室充满并完全覆盖脑组织。以至少200 μl/min的流速持续灌注通入氧气的鱼类生理盐水。
  4. 使用精细镊子小心去除脑记录区域表面的脑膜。

3. 电生理学

  1. 动作电位发放的松散贴附记录
    1. 玻璃微电极（6-10 MΩ）采用硼硅酸盐玻璃毛细管（1B150F-4，World Precision Instruments）使用电极拉制仪制备例如 Sutter P-87）中，并用松散贴片记录液在电极内回填至一半高度。
    2. 使用配备有冷却电荷耦合器件（CCD）相机的直立荧光显微镜，通过10倍物镜寻找表达GFP的TN-GnRH3神经元图1B），然后使用40倍水浸物镜（图1C位于嗅球腹侧表面或其附近，紧邻端脑前方。
    3. 切换至提供显微镜实时图像的视频监视器，以定位TN-GnRH3神经元簇（图1C).
    4. 将微电极置于浴液中，使电极尖端位于目标神经元上方。对微电极施加持续的轻微正压，以防止其堵塞，并轻柔地用电极尖端接近目标神经元。
    5. 使用 AxoGraph 软件和 Axoclamp 200B 放大器（Axon Instruments）在电压钳模式下检查并监测电极电阻。当从视频监视器上可见电极尖端已到达神经元表面，且从 AxoGraph 显示中观察到电阻发生轻微变化时，释放正压，必要时施加轻微负压，以在神经元上形成低电阻封接<100 MΩ
    6. 切换至电流钳模式，持续记录膜电位，期间不施加任何电流输入，必要时调整电压量程和记录速率。数据由 Powerlab 软件（ADInstruments Inc.）采集并分析。
    7. 在任何处理前，用正常鱼用生理盐水记录约5分钟的基础电活动图 2A）。药物、激素、肽类的浴式灌流 等等加入鱼生理盐水后，以200 μl/min的速率持续灌注，随后用正常鱼生理盐水进行洗脱 5, 6, 11.
  2. 全细胞膜电位记录
    全细胞膜片钳电生理实验步骤与上述细胞外游离膜片记录步骤3.1.1至3.1.4相同，之后操作流程相应改变：
    1. 在电压钳模式下检查并监测电极电阻。当从视频监视器上观察到电极尖端已接触神经元表面，同时从示波器上观察到电阻发生轻微变化时，释放正压并施加轻微负压，以在神经元上形成高阻封接（约 3 GΩ）。通过嘴部施加轻柔吸力以破裂封接区域的膜，此时将观察到电阻突然下降至约 120–250 MΩ。
    2. 切换至电流钳模式，持续记录膜电位，期间不施加任何电流输入，必要时调整电压刻度和记录速率。
    3. 在进行任何处理前，按照上述3.1.7步骤所述，在正常鱼用生理盐水中记录约5分钟的基础电活动。图2B).

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结果

在分离的青鳉鱼脑中，GFP标记的TN-GnRH3神经元双侧簇的示例如图1B和图1C所示。每个簇包含约8-10个GnRH神经元。在电流钳模式（I=0）下记录目标TN-GnRH3神经元的自发性神经活动，其典型的放电频率为0.5-6 Hz。动作电位的放电模式通常表现为紧张性或节律性放电，峰间间隔相对规则。图2显示了典型记录轨迹（2A：松散封接；2B：全细胞记录）。

这种实验方法在记录成年斑马鱼前脑中GFP标记的GnRH神经元时同样取得了成功（图3A和图3B）。在离体的完整脑组织中，神经元的电活动通过与上述青鳉实验类似的方法进行记录，包括松散贴附记录（图3C）和全细胞记录（图3D）。与青鳉的TN-GnRH神经元不同，斑马鱼位于视前区、腹侧端脑和下丘脑的GnRH神经元的自发动作电位发放模式通常不规则。

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讨论

GnRH3:GFP 转基因鱼类为研究神经元整合与调控的神经生理学机制提供了独特的模型，这些机制直接或间接参与生殖相关行为的中枢调控3, 8-10。该模型系统的一个显著优势在于，许多表达 GFP 的 GnRH3 神经元位于脑腹侧表面附近，使得在不破坏神经回路的前提下，相对容易地对这些神经元进行电生理记录6, 9, 11, 12（图 1B 和 图 1C；图 3A 和 图 3B）。在本视频中，我们展示了在青鳉鱼完整成年脑中对 TN-GnRH3 神经元进行的松散封接（loose-patch）和全细胞（whole-cell）记录。TN-GnRH3 神经元表现出持续性或节律性自发动作电位发放，频率为 0.5–6 Hz。在自发放电频率方面未观察到明显的性别差异5，但在胚胎发育过程中，GnRH3 神经元的电活动表现出显著的发育变化9。松散封接与全细胞电生理记录在方法学上各有优缺点。松散封接在技术上比全细胞记录更简便...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢林梦真博士和董媛女士提供的技术协助。本工作获得了美国国立卫生研究院资助项目HD053767（子合同授予NLW）以及加州大学洛杉矶分校生理学系和研究副校长办公室资金的支持（NLW）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
显微镜OlympusBX50W (直立式)
放大器Axon InstrumentsAxoclamp 200B
A-D转换器Computer Interference Corp.Digidata ITC-18
制冷CCD相机PCO Computer OpticsSensicam
氙灯Sutter Instruments Co.
GFP滤光片组Chroma Technologies
成像软件Intelligent Imaging InnovationsSlidebook软件
电生理数据采集软件Axon InstrumentsAxograph软件
电生理数据采集软件AD Instruments Inc.PowerLab
电生理用前置放大器Axon InstrumentsCV 203BU
微操纵器Sutter Instrument CoMP-285
记录室平台Warner Instrument Corp.P1
记录室Warner Instrument Corp.RC-26G
电极拉制仪Sutter instrumentsP87
电极拉制仪用灯丝Sutter InstrumentsFB330B3.0 mm宽槽灯丝
1.5 mm玻璃毛细管World Precision Instruments1B150-4用于记录的微–电极
注射器Becton Dickinson3095863 ml
MS-222 SigmaE10521-10G氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐
鱼用生理盐水mM: 134 NaCl; 2.9 KCl; 2.1 CaCl2; 1.2 MgCl2; 10 HEPES
电极液（松散贴附式记录）mM: 150 NaCl; 3.5 KCl; 2.5 CaCl2; 1.3 MgCl2; 10 HEPES; 10 葡萄糖
电极液（全细胞记录）mM: 112.5 K-葡萄糖酸盐; NaCl; 17.5 KCl; 0.5 CaCl2; 1 MgCl2; 5 MgATP; 1 EGTA; 10 HEPES; 1 GTP; 0.1 亮肽素; 10 磷酸肌酸

参考文献

  1. Kah, O., Lethimonier, C., Lareyre, J. J. Gonadotrophin-releasing hormone (GnRH) in the animal kingdom. J. Soc. Biol. 198 (1), 53-60 (2004).
  2. Ramakrishnan, S., Wayne, N. L. Social cues from conspecifics alter electrical activity of gonadotropin-releasing hormone neurons in the terminal nerve via visual signals. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 297 (1), R135-R141 (2009).
  3. Abe, H., Oka, Y. Mechanisms of neuromodulation by a nonhypophysiotropic GnRH system controlling motivation of reproductive behavior in the teleost. 57 (6), 665-674 (2011).
  4. Oka, Y. Tetrodotoxin-resistant persistent Na+ current underlying pacemaker potentials of fish gonadotrophin-releasing hormone neurones. J. Physiol. 482 (Pt. 1), 1-6 (1995).
  5. Zhao, Y., Wayne, N. L. Effects of Kisspeptin1 on Electrical Activity of an Extrahypothalamic Population of Gonadotropin-Releasing Hormone Neurons in Medaka. PLoS One. 7 (5), e37909(2012).
  6. Wayne, N. L., et al. Whole-cell electrophysiology of gonadotropin-releasing hormone neurons that express green fluorescent protein in the terminal nerve of transgenic medaka (Oryzias latipes). Biol. Reprod. 73 (6), 1228-1234 (2005).
  7. Okubo, K., et al. Forebrain gonadotropin-releasing hormone neuronal development: insights from transgenic medaka and the relevance to X-linked Kallmann syndrome. Endocrinology. 147 (3), 1076-1084 (2006).
  8. Okubo, K., et al. A novel form of gonadotropin-releasing hormone in the medaka, Oryzias latipes. Biochem. Biophys. Res. Commun. 276 (1), 298-303 (2000).
  9. Ramakrishnan, S., et al. Acquisition of spontaneous electrical activity during embryonic development of gonadotropin-releasing hormone-3 neurons located in the terminal nerve of transgenic zebrafish (Danio rerio). Gen. Comp. Endocrinol. 168 (3), 401-407 (2010).
  10. Abraham, E., et al. Targeted gonadotropin-releasing hormone-3 neuron ablation in zebrafish: effects on neurogenesis, neuronal migration, and reproduction. Endocrinology. 151 (1), 332-340 (2010).
  11. Wayne, N. L., Kuwahara, K. Beta-endorphin alters electrical activity of gonadotropin releasing hormone neurons located in the terminal nerve of the teleost medaka (Oryzias latipes. Gen. Comp. Endocrinol. 150 (1), 41-47 (2007).
  12. Oka, Y. Three types of gonadotrophin-releasing hormone neurones and steroid-sensitive sexually dimorphic kisspeptin neurones in teleosts. J. Neuroendocrinol. 21 (4), 334-338 (2009).
  13. Molleman, A. Patch Clamping: An Introductory Guide To Patch Clamp Electrophysiology. , Wiley & Sons. England. (2003).

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