在小鼠脊髓中进行病毒载体的立体定位注射以实现条件性基因操作

摘要

病毒载体可实现靶向基因操作。本文演示一种在小鼠脊髓中进行条件性基因表达或基因剔除的方法，通过立体定位注射将病毒载体注入脊髓背角，此处是初级躯体感觉传入神经与中枢神经系统神经元之间突触联系的重要部位。

摘要

向脑实质内注射病毒载体可实现对中枢神经系统中特定神经元群体或特定区域的条件性基因操作。本文演示了一种立体定位注射技术，可在小鼠脊髓背角实现靶向基因表达或基因沉默。该手术过程简短，仅需切除单个椎骨的椎板，从而实现动物快速恢复及脊柱运动功能不受影响。通过控制低速注射少量病毒载体悬液，并使用带有斜面玻璃套管的微量注射器，可最大限度减少组织损伤。机体对病毒载体的局部免疫反应取决于所用病毒的内在特性；根据我们的经验，当使用重组腺相关病毒时，该反应轻微且持续时间短暂。报告基因（如增强型绿色荧光蛋白）有助于监测病毒载体的空间分布，以及转染效率和细胞特异性。

引言

小鼠中条件性基因操作的先进技术为探索中枢神经系统中的突触通路和功能连接提供了多方面的研究手段。转基因的表达可通过小分子效应物进行调控，例如四环素控制的转录激活因子（tetracycline-controlled transactivator）可被强力霉素（doxycycline）所调节，该系统可被设计为基因转录的抑制子或激活子；此外，他莫昔芬（tamoxifen）可识别雌激素受体中突变的配体结合结构域¹。不可逆的转基因修饰通常通过脱氧核糖核酸（DNA）重组酶实现。Cre（causes recombination）和Flp（flippase recombination enzyme）分别催化位于loxP（locus of crossing over, P1）或Frt（flippase recognition target）位点之间的DNA片段发生切除、倒位或易位¹。这些技术的应用包括基因的激活或沉默，以及可诱导的核糖核酸（RNA）干扰²。通过条件性表达荧光蛋白或酶报告基因（如β-半乳糖苷酶或碱性磷酸酶），可用于标记神经元并研究其空间分布与连接性³。北美地区（http://www.norcomm.org/index.htm）和欧洲（

方案

所述手术程序已获得哥伦比亚大学机构动物护理与使用委员会（IACUC）的批准。

1. 设备与病毒颗粒悬液的制备

1. 清洁并消毒设备，对将用于固定第一腰椎（L1）的手术器械和V型缺口棘突进行灭菌。
2. 拉制并修整玻璃移液管。我们使用的移液管尖端直径为40 μm，并以20°角度修整。对玻璃移液管进行灭菌。
3. 安装立体定位仪，将微量注射器固定在操纵器上，并将注射器与控制器连接。
4. 使用压接套件将一根玻璃移液管连接到微量注射器上。
5. 从微量注射器中取出活塞，用矿物油填充注射器。可在矿物油中加入油红O（1-(2,5-二甲基-4-(2,5-二甲基苯基偶氮)苯基偶氮)-2-萘酚）以增强其可见性。重新插入活塞并将其推至注射器尖端，注意避免产生气泡。
6. 在生物安全柜中制备病毒颗粒悬液。将冷冻保存的病毒在冰上解冻，使用前用无菌磷酸盐缓冲液稀释至所需颗粒浓度。
7. 将微量注射器插入注射装置的固定架中。
8. 将5 μl病毒悬液移液至一小片塑料膜上， 例如 Parafilm。将玻璃移液器尖端插入液滴中，拉动活塞以填充微量注射器。在移液器尖端形成一个小的气泡，以防止堵塞。

2. 椎板切除术

1. 使用消毒剂擦拭实验台和加热垫，准备手术区域。
2. 对....

结果

成功的转染可在注射侧背角的神经元中实现高效的基因表达（图1），而对侧背角、腹角以及背根神经节则不受影响。

图1. 背角神经元的转染。 (A) 在立体定位注射rAAV-eGfp（血清型AAV2/8，10⁹基因组拷贝/μl）两周后，L4脊髓左侧背角中荧光报告基因eGfp（绿色）的表达。神经元经神经元核蛋白（NeuN，红色）免疫染色标记。箭头指示背柱中散在的转染胶质细胞。比例尺，150 μm。 (B) 背角内侧约80%的神经元被感染。比例尺，20 μm。免疫染色使用EMD Millipore公司的NeuN单克隆抗体，稀释比例为1:2,000。

....

讨论

立体定位病毒载体注射可用于靶向脊髓神经元，以实现多种应用，例如基于跨突触病毒扩散的神经网络示踪^6,7或光遗传学解析⁸、损伤后再生过程中的轴突导向^9,10，以及用于预防或治疗神经退行性疾病的基因治疗^11,12。病毒载体已被用于脊髓中的基因操作，以研究躯体感觉、运动及自主神经通路^9,10,13-15。小鼠是进行脑或脊髓立体定位注射病毒载体研究中最广泛使用的模式生物，但该技术也已应用于其他物种，包括非人灵长类动物¹⁶。

立体定位法将载体注射至小鼠脊髓是安全的；此处描述的手术过程仅需在注射部位进行一次椎板切除术，因此动物术后脊柱运动不会出现不稳。插管注射及缓慢撤出导管的操作在10分钟内完成，包括皮肤准备和伤口缝合在内的整个手术过程约持续40分钟。术后我们使用卡洛芬（carprofen）——一种非甾体抗炎镇痛药——提供长达72小时的镇痛处理。

为了尽量减少组织损伤，我们采用拉制的玻璃毛细管，其尖端直径为 4.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
脊柱基板	David Kopf Instruments	912
小型动物立体定位仪	David Kopf Instruments	900
小动物气体麻醉头部固定器	David Kopf Instruments	923-B
可调式基座安装架	David Kopf Instruments	982
V型槽尖钉	David Kopf Instruments	987
小动物温控系统	David Kopf Instruments	TCAT-2LV
阿顿镊	Fine Science Tools	11006-12
椎板切除镊	Fine Science Tools	11223-20
UltraMicroPump（一台）配SYS-Micro4控制器	World Precision Instruments	UMP3-1
微量注射器，65RN	Hamilton	7633-01
RN压缩接头，1 mm	Hamilton	55750-01
硼硅酸盐玻璃毛细管	World Precision Instruments	1B100F-4
微量研磨器	Narishige	EG-44