微粒子图像测速法用于微小血流速度分布测量

摘要

微粒图像测速技术（μPIV）用于可视化血流中示踪微粒的成对图像，通过互相关分析获得精确的速度分布。剪切速率、最大流速、速度分布形态及流量等参数均可由这些测量结果推导得出，这些参数均具有临床应用价值。

摘要

微粒子图像测速技术（μPIV）用于可视化血液流动中示踪微粒的成对图像。通过对图像进行互相关分析，可获得精确的速度分布。本文介绍了一种在微通道中进行血液流动μPIV测量的实验方案。在微循环尺度下，血液不能被视为均质流体，因为它是由悬浮在牛顿流体——血浆中的柔性颗粒组成的悬浮液。通过这些测量，可推导出剪切速率、最大速度、速度分布形状以及流量等关键参数。为了确保获得准确且有用的数据，本文还介绍了若干关键参数，如焦深、示踪粒子浓度和系统顺应性，并提供了不同红细胞压积和流动条件下的示例及代表性结果。

引言

人体内含有大量直径小于50 μm的血管，这些血管是血液与组织之间进行物质交换的主要场所。由于测量尺度极小以及血液本身的流体特性，研究这些血管中的血流状况面临巨大挑战。包括微动脉和微静脉中的压力梯度、管壁剪切力以及速度分布在内的这些测量参数，是与生理反应密切相关的关键因素。得益于在微尺度上研究微循环的新实验技术，如今已前所未有地具备了解决这些测量难题的机遇，从而应对这一多尺度的科学问题。

微粒子图像测速技术（μPIV）是一种基于粒子的流动可视化方法，通过互相关分析来评估微通道中血液流动的速度分布。μPIV 最初由 Santiago et al. 开发，自 2001 年 Sugii et al. 首次将其用于测量 100 μm 圆形玻璃管中的血流以来，该技术已广泛应用于血液流变学研究^1,2。目前存在多种 μPIV 实现方式：可采用高速相机对红细胞（RBCs）的运动进行相关分析，也可利用脉冲图像对示踪粒子的运动进行相关分析。根据具体应用需求，上述任一方法均可与正置或倒置显微镜联用。在这两种情况下，均可获得二维速度分布图。另一种方法是结合共聚焦显微镜以获取二维和三维速度分布图，该方法已被应用于血液研究^3,4,5。

与宏观PIV相比，微尺度PIV存在若干技术难点。在宏观PIV中，可通过片状光将数据限制在单一平面内，但在微尺度下必须采用体照明。体照明在微血管血流成像中带来更大的挑战，因为红细胞（RBC）本身的尺寸相对于微通道较大，若以RBC作为示踪粒子，会导致相关深度（DOC）增大，从而显著降低互相关分析结果的准确性^6,7,8。根据Wereley et al.（1998）的研究，在使用RBC作为示踪物时，40 μm高的通道其DOC为8.8 μm，而使用1 μm示踪粒子时DOC为6.7 μm。当改变通道高度和放大倍数时，这种差异会更加显著。此外，RBC具有不透明性，增加流体中RBC的密度会导致成像困难。 Santiago et al.（1998）首次使用的荧光示踪微粒被推荐为一种有效手段，可在使用尽可能小的粒子时减少离焦粒子的干扰。结合激光使用直径为1 μm的荧光微粒，是一种有望缓解微血管血流成像中焦深问题的方法¹⁰。目前已有若干关于μPIV技术发展现状的综述文章，均强调了μPIV在血液流动研究中的重要性^11,12。在将μPIV应用于血液研究时，必须考虑若干关键因素。在微尺度下，由于微循环的尺度极小，血液不能被视为均质流体，而是一种由可变形的红细胞（RBC）、较大的白细胞、血小板及其他蛋白质悬浮于牛顿流体（血浆）中所形成的复杂悬浮液。

此处测量的速度分布可用于评估微血管血流的某些特性。微循环流变学中的重要参数包括血流速率、速度分布的形状以及血管壁处的剪切应力。这些信息具有临床意义，因为微循环是体内营养物质交换的场所，而这种交换依赖于剪切力。目前已有若干综述研究探讨了微循环领域的研究现状^13,14,15。

本文介绍了一种利用微粒子图像测速技术（μPIV）测量聚二甲基硅氧烷（PDMS）微通道中血液流动的实验方案。PDMS微通道根据本方案第1节所述方法自行制备。猪血样本取自经认证的屠宰场，并按照方案第2节进行清洗处理。所有数据均使用LaVision MITAS μPIV系统采集，该系统在方案第3节中有详细描述。该系统由一台Nd:YAG激光器（New Wave Research，美国）、一台CCD相机（Image Intense，LaVision）组成，二者由可编程触发单元控制，配备荧光显微镜及三轴移动载物台，以及一台计算机；此外，还增加了一台高速相机（Dalsa 1M150，荷兰），用于红细胞（RBC）本身的可视化观察。两台相机均连接至一个双通道光学分光盒（由Zeiss公司，德国，定制）。在典型的in vivo（体内）血液流动测量中，通常使用直立显微镜直接追踪红细胞；而在典型的in vitro（体外）应用中，则使用倒置显微镜追踪示踪粒子。本实验采用独特的双相机配置，通过光学分光盒，使倒置显微镜可同时成像两种示踪物。血液通过高精度注射泵（Nexus3000，Chemyx Inc.，美国）引入微芯片。系统示意图见图1，图中上半部分表示由PDMS制成的140 μm × 40 μm矩形微通道，下半部分展示了整个系统，包括两台相机、激光器、注射泵和显微镜。

目前可用的微粒子图像测速（μPIV）系统通常配备专有软件，包括TSI、Dantec Dynamics和LaVision。标准的互相关算法可通过多种软件实现，其中包括MATLAB。软件本身并非关键，更重要的是理解对话框中各项参数所对应的数学含义，这将使用户受益更多。本实验方案中使用了LaVision的专有软件DaVis或MATLAB。该方案不依赖于特定软件，但不同软件包中的菜单选项位置可能有所不同。

方案

1. 微芯片制备

第一步是制备或购买微通道。微芯片材料有多种选择。

最常选用的材料之一是聚二甲基硅氧烷（PDMS）。已有大量文献报道了通过软光刻技术制备PDMS的操作方法^16,17,18。

PDMS 通道制备完成后，可通过多种表面处理方法逆转其天然的疏水性。其中，氧气等离子体处理是一种常用方法。

Zhou、Ellis 和 Voelcker（2009）综述了表面处理及其对 PDMS 的影响。然而，这些结果是针对水的，而血液具有不同的性质。Pitts 已开展研究，探讨该表面处理对血液的意义。 等 (2012a)

对于此处展示的结果，微流控芯片表面及其所键合的玻璃载片均经过45秒的氧气等离子体处理，随后被紧密压合，从而形成永久性键合。

2. 血液制备

1. 从经认证的机构采集血液样本。例如，可使用乙二胺四乙酸（EDTA）作为抗凝剂的猪血。将1 g EDTA溶于4 ml水中，然后将该溶液加入1 L全血中，轻轻混匀10次。

采集血样后，应让其缓慢冷却至室温。血样应保持新鲜，最好在采集当天使用，以维持血液的流变学特性。

样本可在室温下冷藏一次；然而，不含抗凝剂的全血在冷藏后将无法使用。根据所用抗凝剂的不同，红细胞可在冷藏条件下保存最长42天，全血可在冷藏条件下保存35天，但在非医疗场所中可能存在污染风险²¹。

此外，采集牛或猪样本时需注意采集方法，避免骨髓污染。

2. 将血液样本以3,000 rpm离心3次，每次10分钟。第一次离心后，移除血浆和白膜层，并弃去。通常先移除血浆最为方便，然后可选择弃去或保存以备后续使用，再单独移除白膜层。

缓慢插入移液管，以免将白膜层重新混入血液中。去除白膜层后，加入约 20 ml 磷酸盐缓冲液（PBS），轻轻混匀，再次离心。重复上一步骤。第三次离心后，移除 PBS 及残留的白膜层，并弃去。

如果希望保留血液的聚集特性，也可以使用天然血浆代替PBS。注意不要将任何血沉棕黄层或白细胞混入血浆中。

3. 取清洁后的红细胞（RBCs），用 PBS 或血浆悬浮至所需浓度（红细胞压积）。使用微量离心机（CritSpin FisherSci, USA）检测红细胞压积。

血细胞比容为10%至20%的血液应比40%或50%（生理血细胞比容）更易于观察。在微循环中，血液的血细胞比容通常约为大循环的一半，因此H=20是足够的¹⁵。

4. 将荧光示踪粒子以所需浓度加入血液样本中。一般原则是每个相关窗口内应有10个粒子，该数值可预先计算得出。

例如，在视频所示的实验设置中，将 30 μl 颗粒加入 1 ml 血液溶液中。或者，也可对红细胞本身进行荧光标记。

5. 此外，使用水和荧光微粒配制校准溶液。必须使用牛顿流体溶液对系统进行校准。

例如，当使用10倍物镜且通道尺度为100 μm时，合适的浓度是将300 μl的微粒与15 ml蒸馏水混合。另一种选择是使用蒸馏水稀释甘油，使其黏度达到3 cP，这更接近血液的宏观黏度。

3. μPIV 测量

1. 激光安全：检查温度和湿度。佩戴合适的激光防护眼镜。关闭激光防护帘或打开实验室门上的激光警示标志，以防止未受保护的人员暴露于激光下。
2. Davis 软件的操作流程见视频演示。更多详细信息请参考特定系统的产品用户手册。
3. 在采集数据之前，需使用显微测微尺对相机标尺进行校准。
4. 为降低系统顺应性，应使用最短的管路和尽可能小的刚性注射器，例如 15 或 50 μl 的 Hamilton Gastight 注射器。为减少血液泄漏或空气进入系统，需将管路与注射器及芯片之间进行密封。可使用胶水、PDMS 或凡士林进行密封（注意避免污染血液）。

由于微注射器的体积通常远小于需填充的体积，因此应使用反向灌注法将含有示踪粒子的水注入微注射器中。

我们的回流方法是通过通道的出口，使用一个辅助的塑料注射器，将液体注入微注射器和通道中。具体操作如下：首先移除微注射器的活塞，然后将连接在通道出口处的普通塑料注射器推动，使液体流入，让液体从微注射器末端流出，直至微注射器、管路或芯片中的所有微小气泡完全排出，最后将活塞重新插入，并拔下塑料注射器。微小气泡的存在与否可通过显微镜进行观察确认。

5. 调节注射泵以使管路保持水平。将注射泵设置为所需的流速。

需注意可能存在的瞬态效应，例如刚性系统中的“瓶颈效应”或系统顺应性对实际流速的影响。系统的特征时间可根据系统的材料和尺寸进行估算。（第2章，第77-81页，Tabeling，2005）

6. 将微芯片置于显微镜载物台上并启动泵。使用含有颗粒的水对系统进行校准，以获得中间速度分布，并校准 dT（脉冲图像之间的时间）。

为了获得良好的相关性，颗粒在相邻帧之间的移动距离应为5到10个像素¹¹。校准时，应注意在通道的中央区域进行测量，因为中间层面的焦平面具有最高的流速⁸。

若使用圆形通道，请注意阴影效应。

使用脉冲相机拍摄的样本图像如图2所示，其中上方图像为第一次脉冲捕获的图像，下方图像为第二次脉冲捕获的图像。从图中可以看出，最亮的点（发出荧光的颗粒）处于最清晰的焦平面。

7. 可选：通过采集不同高度的数据，可将各个矢量叠加至单幅图像中，重建出三维速度分布图。视频展示了一种为实现该过程自动化而开发的实验流程。
8. 使用血液采集数据时，采用与取水样相同的方法，用所需量的血液填充注射器。将注射泵设定至所需的流速，并采集所需数据。此处展示了获得的原始图像示例。 图2注意红细胞沉降问题。每次运行或每隔一次运行后重新填充注射器，可减少红细胞的沉降。
9. 获取图像后，需对图像对进行互相关运算，以获得图像间的速度矢量场。获得高质量的图像对于实现良好的相关性至关重要。在进行相关运算前，可进行预处理以去除背景噪声。

在相邻图像的窗口之间进行互相关运算，窗口的大小和形状可以调整，以影响相关性结果。互相关运算完成后，可对图像进行后处理，以去除错误的矢量或异常值。

不同可选方法及其准确性的详细描述可参见 Pitts et al. (2012b)，其中发现针对血液的最佳处理方法是采用“图像重叠”法，即使用沿流动方向延长并对齐的窗口。这些操作可在 MATLAB 等程序中手动完成，也可在您系统配套的软件包中实现。软件本身并不重要，操作背后的数学原理更为关键，每一项操作都可能影响最终速度分布的准确性。

可对所得矢量在通道内进行空间平均，以获得瞬时速度分布，然后进一步进行时间平均，以得到具有代表性的平均速度分布。Kloosterman et al. (2011) 阐述了在景深较大时 μPIV 测量中的误差问题。关于本文所述数据处理方法的误差讨论，可参见 Pitts et al. (2012b) 对脉冲测量的分析，以及 Chayer et al. (2012) 对高速测量的分析。

速度分布的示例如图3和4所示。图3展示了在140 μm宽的通道中，红细胞在H=10条件下以10 μl/hr流速流动时中心线处的单个速度分布。

通过在通道内对相关联的矢量进行平均，得到速度分布，再对时间进行平均，从而获得具有代表性的测量结果。本例中，在视场范围内对100组数据对进行了时间上的平均。

在程序设定流速为 30 μl/hr 的 100 μm 方形通道中进行水校准流动时，所获取的三维重建轮廓示例见图 4。在图 4中，轮廓以 1 μm 间隔进行测量。

10. 可选：在图示的实验装置中，可通过更换相机（及数据采集系统）在相同条件下拍摄高速图像。这有助于可视化通道中的无细胞层，并用于定量分析聚集情况。数据分析方法略有不同（Chayer et al., 2012）。

在 H=20 条件下，图5 展示了存在和不存在红细胞聚集时的白光图像示例。上方图像显示的是在 PBS 中 H=20、流速为 1 μl/hr 的情况，此时红细胞无法发生聚集。下方图像为在天然血浆中 H=20、流速为 0.5 μl/hr 的情况，可见明显的红细胞聚集现象。

11. 测量完成后，以安全的方式关闭系统。在激光电源完全关闭之前，应始终遵循正确的激光安全操作规程。

结果

在所有图中，原始图像中的流动方向为从左到右，计算得到的速度分布图中流动方向为从下到上。以下为红细胞压积 H=10 的血液流动时所获得原始数据的示例 10 μl/hr 如图所示 图2原始数据可直接进行互相关分析，无需任何数据预处理，即可获得速度分布曲线。Pitts 对预处理及数据处理方法的影响进行了讨论。 等，（2012b）。基于类似数据得到的速度分布剖面示例 图2 在血细胞比容 H=10 和流速为 10 μl/hr 如图所示 图3，显示了来自水校准的三维轮廓 图4. 图3 和 4 包含标准的数据处理。这些速度分布可用于测量不同流动条件、通道构型和生理状态下的通道中心最大流速、通道内的流量以及壁面处的剪切速率。 图5 展示了红细胞（RBC）聚集前后的一例高速图像。此类高速图像如 图5 也可用于通过互相关计算速度分布。

讨论

在微循环尺度上使用μPIV进行血流测量，可为大量相关的生物医学、机械工程和化学工程过程提供深入见解。需要考虑的一些关键因素包括红细胞（RBC）本身的密度、RBC的聚集性和变形能力、荧光示踪微粒的聚集或运动，以及RBC在通道中的沉降。只要遵循上述一般性指导原则，这些因素均可得到有效控制。使用该系统进行良好测量时，需牢记一个基本检查清单。首先，确定系统或拟用系统的顺应性程度。为最小化顺应性，应使用尽可能短的管路和尽可能小的注射器。刚性系统顺应性较低，但可能导致瓶颈效应。尽管测量尺度很小，重力仍会影响RBC。理想情况下，应使注射器、管路和通道处于同一高度。其次，确定悬浮液的浓度。确保溶液中存在足够数量的荧光示踪粒子，同时RBC浓度不宜过高。增加样品中示踪粒子的密度无法克服RBC本身固有的不透明性。示踪粒子的数量会影响互相关结果，但RBC过多会使流体变得不透明，导致示踪粒子难以成像。样品的整体红细胞压积（hematocrit）必须足够低，以确保能够清晰成像通道的中层平面。这需要在红细胞压积与通道尺寸之间进行权衡。即使红细胞压积较低，随着深度增加，物镜与测量平面之间的RBC数量也会增多。为了成像较高红细胞压积的样品或更大尺寸的通道，可采用“鬼细胞...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
聚二甲基硅氧烷（PDMS），即 Sylgard-184	Dow-Corning	3097358-1004
乙二胺四乙酸（EDTA）	Sigma Aldrich	E9884-100G
磷酸盐缓冲液（PBS）	Sigma Aldrich	P5368-10PAK
荧光微粒	Microgenics/FisherSci	R900
甘油（可选）	Sigma Aldrich	G6279-500 ml
微量离心机，即 CritSpin	FisherSci	22-269-291
注射器，即 50 μl 耐压型	Hamilton	80965
相机，即 Imager Intense，高速	LaVision, Dalsa	Imager Intense
显微镜，即 MITAS	LaVision	MITAS
Nd:YAG 激光器	New Wave Research	Solo-II
注射泵，即 Nexus3000	Chemyx, Inc.	Nexus-3000
柔性管路，即 Tygon	FisherSci	14-169-1A
数据处理软件，即 DaVis	LaVision	DaVis
离心机，即 Thermo Scientific CL2	Thermo Scientific	004260F