GST-His纯化：一种两步亲和纯化方案，可获得全长纯化蛋白

摘要

在本实验方案中，我们展示了一种高效且经济的小规模蛋白质纯化方法，该方法通过独特地结合可切割的GST标签和小型His标签，实现对重组蛋白的纯化。

摘要

酶学中用于蛋白质生化表征的关键检测方法 体外 需要高浓度的目标纯化蛋白。蛋白纯化方案应兼顾效率、简便性与成本效益¹在此，我们介绍GST-His方法作为一种新的小规模亲和纯化系统，用于重组蛋白的纯化，该方法基于N端谷胱甘肽Sepharose标签（GST）^2,3 C端10xHis标签⁴，两者均与目标蛋白融合。后者用于生成杆状病毒，以感染Sf9感染细胞进行蛋白表达⁵GST 是一个相对较长的标签（29 kDa），可用于确保纯化效率。然而，它可能影响蛋白的生理特性。因此，后续需使用 PreScission 酶将 GST 标签从蛋白上切割去除。⁶为了确保最大程度的纯度并去除被切割的GST，我们增加了一个基于相对较小的His标签的二次亲和纯化步骤。重要的是，我们的技术基于位于蛋白两端的两种不同标签，这是一种有效去除降解蛋白、从而富集全长蛋白的工具。本文所述方法无需昂贵的仪器设备（如FPLC）。此外，我们加入了MgCl₂₂ 并通过ATP洗涤去除热休克蛋白杂质，以及核酸酶处理以消除污染性核酸。总之，通过在N端和C端两侧使用两种不同的标签，并具备切除其中一个标签的能力，可确保获得高纯度且全长的目标蛋白。

引言

纯化重组蛋白对于解答生物化学中的基本问题至关重要。传统的蛋白质纯化方法，如离子交换层析和尺寸排阻层析，分别依赖于目标蛋白的等电点、电荷或分子大小等物理性质。然而，这些蛋白特性在多种蛋白质中普遍存在，显著增加了传统蛋白质纯化策略中杂蛋白污染的可能性。该问题可通过使用多个纯化柱加以规避，但此方法耗时较长。同时，上述层析技术还需要昂贵的实验设备。亲和标签纯化可显著提高对目标蛋白的特异性，因为在大多数情况下，该标签仅特异性地存在于目标蛋白上。在近期的研究中，Flag标签或HA标签亲和纯化已被广泛使用。

与现有的仅使用单一标签的重组蛋白纯化方案不同，我们建立了一种独特的双标签组合方法。本方法在目标蛋白的N端融合GST标签，C端融合His标签，以实现目标蛋白产量与纯度之间的最佳比例。GST是一种较大的标签（29 kDa），在谷胱甘肽Sepharose微珠上的纯化效率很高。此外，使用GST标签可确保本方法的成本效益¹。利用PreScission蛋白酶（识别序列LeuGluValLeuPheGln/GlyPro，仅引入两个氨基酸）将GST标签切除，具有多种优势，例如可避免因别构位阻而影响蛋白的正常生理功能。在蛋白另一端融合的小型His标签可用于第二步纯化，通过洗脱去除已切割的GST标签、降解的蛋白及其他污染物，从而进一步提高蛋白纯度。此外，在从GST纯化步骤转换到His纯化步骤（TALON树脂）时，本方案无需透析步骤。此类纯化过程中常见的污染物为热休克蛋白（HSP）。通....

方案

1. 重组杆状病毒的制备

杆状病毒的制备主要采用 Invitrogen 公司的 Bac-to-Bac 杆状病毒表达系统，基本按照制造商提供的方案进行，仅作轻微修改：

1. 构建了一种改良的 pFastBac1 载体（Gibco, life），其中包含 GST 和 His 标签（图 2）。将含有 10xHis 标签的 pET-52b(+) 载体（Novagen）的多克隆位点（MCS）插入 pFastBac1 载体的 MCS 中，以生成 pFastBac1-Strep-10xHis。通过 PCR 扩增 pET-52b(+) MCS 序列，扩增引物在 XbaI 和 BlpI 限制性酶切位点之间引入了 5' 端的 BglII 限制性酶切位点和 3' 端的 HindIII 限制性酶切位点。将 PCR 产物利用 BamHI 和 BglII 限制性酶切序列的兼容性，克隆至 pFastBac1 的 BamHI 和 HindIII 位点之间。由于目标是构建一种可表达带有链霉亲和素标签和 10xHis 标签的重组蛋白的 pFastBac1 载体，因此未使用 pET-52b(+) MCS 序列中的 BamHI 位点。此外，未使用 XbaI 位点，以避免插入的 pET-52b(+) MCS 与 pFastBac1 原有 MCS 中已有的限制性酶切位点重复。随后，将带有 PreScission 蛋白酶识别位点（LeuGluValLeuPheGln/G....

结果

为了说明 GST-His 纯化方案的效率，我们纯化了大小为 32.9 kDa 的 S. pombe 蛋白 Rec14。将 Rec14 的 cDNA 克隆至我们改造的 pFastBac1 载体中，使其在 N 端和 C 端分别添加 GST 和 His 标签（图 1A）。随后制备重组杆状病毒，并用于感染 SF9 细胞以表达目标蛋白。将可溶性细胞裂解液与 GST 琼脂糖微珠孵育，通过 PreScission 蛋白酶切割 GST 标签来洗脱结合的蛋白。所得的 Rec14-His 蛋白使用 TALON 树脂进行亲和层析纯化，并用含有 500 mM 咪唑的 TALON 缓冲液洗脱结合的蛋白。纯化后的 Rec14-His 蛋白经储存缓冲液透析后，保存于 -80 °C（图 1B）。

通过考马斯亮蓝染色分析了感染 Rec14 重组杆状病毒或模拟感染（对照）的 SF9 细胞的可溶性及全细胞裂解液，从而确认了 GST-Rec14-His 蛋白的表达（图 3A）。在纯化过程中，我们对多个样.......

讨论

本文所介绍的GST-His纯化方案适用于多种分子量大小的重组蛋白纯化：我们已成功纯化了LiRAD51（41kDa）、piBRCA2（120kDa）、PALB2（130kDa），以及一种不稳定的高分子量蛋白——来自Leishmania infantum的LiBRCA2（125kDa）^6,9。此外，采用该方案纯化的蛋白均具有生物化学活性⁶。该方法的成功完全取决于目标蛋白的表达水平、溶解性及稳定性。

用于在其他宿主（如 E. coli 或酵母）中表达的分子生物学载体，可通过广泛使用的 GST 和 His 标签轻松进行改造。这凸显了本技术在大多数分子生物学实验室中的适用性和成本效益。多种优势促使我们选择感染细胞而非细菌或哺乳动物细胞，用于重组蛋白的表达与纯化。例如，翻译后修饰（如甲基化、磷酸化和泛素化）可显著影响蛋白质的酶活性¹⁰。因此，为了研究蛋白质的生理特性，宜采用能够实现翻译后修饰的表达系统，例如 Sf9 感染细胞。与哺乳动物细胞相比，使用 Sf.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
<强>试剂
大肠杆菌 DH10Bac（感受态）	Invitrogen
Bac-to-Bac杆状病毒表达系统	Invitrogen
Maxi Prep 试剂盒	Qiagen	12163	溶液I和溶液II
Ultra Pure Bluo-Gal	Gibco（Life）	15519028
IPTG	Gibco（Life）	15529019
Sf9 感染细胞	ATCC	CRL-1711
PreScission酶	GE Healthcare	27084301
Grace's 感染培养基补充液	Gibco（Life）	11605-094
胎牛血清表征	Hyclone	SH30396.03
青霉素-链霉素（P/S）	Gibco（Life）	15070-063
谷胱甘肽 Sepharose 树脂	GE 生物科学	17075605
蛋白酶抑制剂混合物	罗氏	11873580001
Talon 树脂	Clontech	635504
咪唑	BioShop	288324
庆大霉素	Gibco（Life）	15710064
多克隆GST抗体	自行生产
单克隆6X-His抗体	Clontech	631212
<强>仪器设备
Dounce匀浆器（紧密型）	Wheaton	357546
超声波破碎仪（Fisher dismembrator）	Fisher	Model 150
透析袋（50 mm）	Fisher Scientific	2115217