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方法文章

GST-His纯化：一种两步亲和纯化方案，可获得全长纯化蛋白

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DOI：

10.3791/50320

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2013年10月29日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Genome Stability Laboratory, Oncology Axis, Hôtel-Dieu de Québec

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

在本实验方案中，我们展示了一种高效且经济的小规模蛋白质纯化方法，该方法通过独特地结合可切割的GST标签和小型His标签，实现对重组蛋白的纯化。

摘要

酶学中用于蛋白质生化表征的关键检测方法 体外 需要高浓度的目标纯化蛋白。蛋白纯化方案应兼顾效率、简便性与成本效益1在此，我们介绍GST-His方法作为一种新的小规模亲和纯化系统，用于重组蛋白的纯化，该方法基于N端谷胱甘肽Sepharose标签（GST）2,3 C端10xHis标签4，两者均与目标蛋白融合。后者用于生成杆状病毒，以感染Sf9感染细胞进行蛋白表达5GST 是一个相对较长的标签（29 kDa），可用于确保纯化效率。然而，它可能影响蛋白的生理特性。因此，后续需使用 PreScission 酶将 GST 标签从蛋白上切割去除。6为了确保最大程度的纯度并去除被切割的GST，我们增加了一个基于相对较小的His标签的二次亲和纯化步骤。重要的是，我们的技术基于位于蛋白两端的两种不同标签，这是一种有效去除降解蛋白、从而富集全长蛋白的工具。本文所述方法无需昂贵的仪器设备（如FPLC）。此外，我们加入了MgCl₂2 并通过ATP洗涤去除热休克蛋白杂质，以及核酸酶处理以消除污染性核酸。总之，通过在N端和C端两侧使用两种不同的标签，并具备切除其中一个标签的能力，可确保获得高纯度且全长的目标蛋白。

引言

纯化重组蛋白对于解答生物化学中的基本问题至关重要。传统的蛋白质纯化方法，如离子交换层析和尺寸排阻层析，分别依赖于目标蛋白的等电点、电荷或分子大小等物理性质。然而，这些蛋白特性在多种蛋白质中普遍存在，显著增加了传统蛋白质纯化策略中杂蛋白污染的可能性。该问题可通过使用多个纯化柱加以规避，但此方法耗时较长。同时，上述层析技术还需要昂贵的实验设备。亲和标签纯化可显著提高对目标蛋白的特异性，因为在大多数情况下，该标签仅特异性地存在于目标蛋白上。在近期的研究中，Flag标签或HA标签亲和纯化已被广泛使用。

与现有的仅使用单一标签的重组蛋白纯化方案不同，我们建立了一种独特的双标签组合方法。本方法在目标蛋白的N端融合GST标签，C端融合His标签，以实现目标蛋白产量与纯度之间的最佳比例。GST是一种较大的标签（29 kDa），在谷胱甘肽Sepharose微珠上的纯化效率很高。此外，使用GST标签可确保本方法的成本效益1。利用PreScission蛋白酶（识别序列LeuGluValLeuPheGln/GlyPro，仅引入两个氨基酸）将GST标签切除，具有多种优势，例如可避免因别构位阻而影响蛋白的正常生理功能。在蛋白另一端融合的小型His标签可用于第二步纯化，通过洗脱去除已切割的GST标签、降解的蛋白及其他污染物，从而进一步提高蛋白纯度。此外，在从GST纯化步骤转换到His纯化步骤（TALON树脂）时，本方案无需透析步骤。此类纯化过程中常见的污染物为热休克蛋白（HSP）。通过添加MgCl2和ATP的孵育步骤，可有效去除这些污染物（图1）。

快速蛋白液相色谱（FPLC）和高效液相色谱（HPLC）是常见的纯化技术，依赖昂贵的仪器设备以获得高产量的目标蛋白。相比之下，本文所介绍的批量纯化方案为手动操作，无需昂贵的仪器设备。通过放大该方案的处理规模，同样可实现高产量的蛋白纯化。同时，在批量纯化过程中，可灵活调节洗脱体积以提高蛋白浓度，而这一点在FPLC或HPLC中难以实现。

此外，采用批量GST-His纯化方案，可纯化分子量范围约为10-300 kDa的蛋白质。该方法最大的优势之一在于可同时纯化多种蛋白质，例如野生型蛋白及其突变体蛋白。本方案的成功完全取决于目标蛋白的表达水平和溶解性。

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方案

1. 重组杆状病毒的制备

杆状病毒的制备主要采用 Invitrogen 公司的 Bac-to-Bac 杆状病毒表达系统，基本按照制造商提供的方案进行，仅作轻微修改：

  1. 构建了一种改良的 pFastBac1 载体（Gibco, life），其中包含 GST 和 His 标签（图 2）。将含有 10xHis 标签的 pET-52b(+) 载体（Novagen）的多克隆位点（MCS）插入 pFastBac1 载体的 MCS 中，以生成 pFastBac1-Strep-10xHis。通过 PCR 扩增 pET-52b(+) MCS 序列，扩增引物在 XbaI 和 BlpI 限制性酶切位点之间引入了 5' 端的 BglII 限制性酶切位点和 3' 端的 HindIII 限制性酶切位点。将 PCR 产物利用 BamHI 和 BglII 限制性酶切序列的兼容性，克隆至 pFastBac1 的 BamHI 和 HindIII 位点之间。由于目标是构建一种可表达带有链霉亲和素标签和 10xHis 标签的重组蛋白的 pFastBac1 载体，因此未使用 pET-52b(+) MCS 序列中的 BamHI 位点。此外，未使用 XbaI 位点，以避免插入的 pET-52b(+) MCS 与 pFastBac1 原有 MCS 中已有的限制性酶切位点重复。随后，将带有 PreScission 蛋白酶识别位点（LeuGluValLeuPheGln/GlyPro）的 GST 编码序列插入 pFastBac1-Strep-10xHis 中。使用含有 NcoI 和 KpnI 限制性酶切位点的引物，对 pGEX-6P-2（GE Healthcare）中的 GST cDNA 序列进行 PCR 扩增，分别位于 5' 和 3' 末端。NcoI 位点可引入起始密码子，同时在 GST 上添加一个丙氨酸。将 PCR 产物克隆至 pFastBac1-Strep-10xHis 的 NcoI 和 KpnI 位点之间，导致链霉亲和素标签被删除。由此获得的新型融合载体命名为 pFastBac1-GST-10xHis。
  2. 将目标蛋白的 cDNA 克隆至 pFastBac-GST-10xHis 载体中 GST（N 端）与 His 标签（C 端）之间的位点。注意去除 cDNA 的终止密码子，以确保与 C 端 His 标签的融合表达。
  3. 将重组 pFastBac 载体（步骤 1.2 获得）转化至 E. coli DH10Bac 中，以生成杆状病毒基因组（bacmid）。在含有 Bluo-gal 和 IPTG 的选择性平板上（含 10 μg/ml 四环素、50 μg/ml 卡那霉素、7 μg/ml 庆大霉素、100 μg/ml Bluo-Gal、40 μg/ml IPTG），于 37 °C 培养过夜，随后在 30 °C 继续培养数小时，使菌落生长。
  4. 从步骤 1.3 中挑取 2 个白色菌落，并在选择性平板上重新划线，以确认其白色表型。
  5. 从步骤 1.4 中取两个白色菌落，接种于 2 ml 含 10 μg/ml 四环素、50 μg/ml 卡那霉素、10 μg/ml 庆大霉素的 LB 培养基中，在 37 °C、250 rpm 振荡条件下过夜培养。
  6. 为纯化 bacmid DNA，将步骤 1.5 中的细菌离心收集，用 300 μl 溶液 I 重悬细胞，加入 300 μl 溶液 II（Qiagen Maxiprep 试剂盒）。室温孵育 5 分钟，加入 300 μl 3 M KOAc（pH 5.5），冰上孵育 10 分钟。4 °C 下最大转速离心 10 分钟。向上清中加入 800 μl 异丙醇，冰上孵育 10 分钟。4 °C 离心 15 分钟，用 500 μl 70% 乙醇洗涤沉淀。将沉淀干燥后，在无菌条件下用 40 μl Tris-EDTA（pH 8.0）重悬。bacmid DNA 应保存于 4 °C。
  7. 按照制造商说明书生成杆状病毒。杆状病毒可在避光条件下保存于 4 °C。

2. 重组蛋白表达

  1. 为了选择最高效的杆状病毒用于纯化，并监测目标蛋白表达量达到峰值的时间，请按以下步骤进行小规模感染实验：将133 μl（1/150）的杆状病毒感染2 × 107个在Grace's培养基（添加10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素）中、于27 °C培养的Sf9细胞。在感染后0、24、48和72小时分别收集1.5 ml样品。离心收集细胞沉淀，利用抗标签抗体通过蛋白质印迹法分析目标蛋白的表达水平。
  2. 采用步骤2.1中确定的最高效杆状病毒，以病毒与培养基体积比1/150的比例，感染装有500 ml培养基、细胞密度为1.0 × 106个/ml Sf9细胞的悬浮培养瓶。将感染后的细胞在27 °C下悬浮培养，当蛋白表达量达到最高水平（依据上述步骤2.1确定）时收获细胞。细胞沉淀可于-80 °C保存，待后续使用。

3. 可溶性细胞裂解液的制备

以下所有孵育步骤均在 4 °C 下温和旋转条件下进行。

  1. 在约 20 ml GST 结合缓冲液（150 mM NaCl、1 mM EDTA、0.05% Triton-X-100、1 mM DTT 溶于 PBS 1X，最终 NaCl 浓度为 250 mM）中裂解表达目标蛋白的 Sf9 细胞，并加入蛋白酶抑制剂混合物（Roche）。将溶液置于冰水浴中，使用 Dounce 匀浆器匀浆 20 次，超声处理 3 次，每次 30 秒（输出功率 70%），再重复 Dounce 匀浆 20 次。
  2. （可选）将总细胞裂解液与 1 mM MgCl2 和 Benzonase7 核酸酶（2.5 U/ml）在 4 °C 下孵育 30 分钟，以去除 DNA 或 RNA 污染。
  3. 在 4 °C 下以 18,000 rpm 离心 30 分钟，保留上清液。
  4. （可选）将上清液再次在 4 °C 下以 18,000 rpm 离心 30 分钟，以获得澄清的可溶性裂解液。将上清液通过 0.2 或 0.45 μm 滤膜过滤，防止堵塞。

4. 蛋白质在 GST 珠上的结合

  1. 将可溶性细胞裂解液与1 ml GST凝胶珠（预先用10 ml GST结合缓冲液洗涤两次）在4 °C下轻柔旋转孵育1小时。

注释：孵育时间需根据蛋白质的稳定性和结合效率进行优化。

  1. 以700 rpm短暂离心，弃去含有未结合蛋白的上清液（可保留用于进一步分析）。用GST洗涤缓冲液（含终浓度350 mM NaCl的GST结合缓冲液）洗涤GST结合的蛋白（图3B，泳道1）。
  2. 重复步骤4.2两次。最后一次洗涤时，尽可能彻底去除上清液。
  3. 将珠子与5 mM ATP和15 mM MgCl2（溶于10 ml GST结合缓冲液中）在4 °C孵育1小时，以避免热休克蛋白的非特异性结合8。随后用GST洗涤缓冲液洗涤珠子三次。

5. GST 的 PreScission 酶切

  1. 离心GST磁珠，弃上清液，并用P5缓冲液（50 mM NaHPO4 pH 7.0，500 mM NaCl，10%甘油，0.05% Triton-X-100，5 mM 咪唑）洗涤GST磁珠。
  2. 将GST磁珠与PreScission酶在P5缓冲液中于4 °C孵育3小时至过夜。（将GST磁珠分成每份100 μl，加入溶于100 μl P5缓冲液中的4–8单位（2–4 μl）酶。）

注释：PreScission 酶切步骤的孵育时间需根据蛋白质的分子量及其稳定性进行优化。若观察到降解现象，可将孵育时间缩短至最少 2 小时，而非过夜孵育。

  1. 短暂离心并收集上清液。加入100 μl P5 缓冲液至珠粒后，重复此步骤两次，并合并所有组分（图3B，泳道2）。

注释：剩余的磁珠可用于切割效率分析（图3B，第3泳道）。通常，约有70-80%的蛋白被切割。

6. 蛋白质与TALON金属亲和树脂的结合

  1. 将上述洗脱液分为3份，每份1 ml，每份中加入100 μl 钴金属亲和树脂干珠（预先用P5缓冲液洗涤两次），旋转孵育1小时。

注释： 将洗脱液分为多个组分可提高结合/洗涤效率。

  1. 用P30缓冲液（含30 mM咪唑的P5缓冲液）洗涤树脂5分钟。
  2. 重复步骤6.2两次，并将珠子收集至同一根离心管中。最后一次洗涤前，尽可能吸除上清液。

注释：此条带对应于 TALON 结合样品（图 3B，第 4 泳道）。

7. 纯化蛋白的洗脱

  1. 将结合蛋白的TALON树脂与P500缓冲液（含500 mM咪唑的P5缓冲液）按1:1（v/v）的体积比混合，在旋转仪上孵育5分钟。（例如，若取用200 μl 干树脂珠，则需加入200 μl P500缓冲液。）重复此步骤两次，并分别收集每次洗脱的组分（命名为洗脱组分1（E1）、洗脱组分2（E2）和洗脱组分3（E3）；图3B，泳道5–7）。

注释： 剩余的磁珠可用于分析洗脱效率（图3B，第8泳道）。通常，总共有60-80%的蛋白质被洗脱下来。

  1. 通过将每个组分约 20–40 μl 与标准 BSA 浓度一同上样至 SDS-PAGE，并用考马斯亮蓝（图 3B）或 SYPRO 蛋白染色剂染色，分析纯化蛋白的产量和质量。

注释： 目标蛋白也可在纯化过程中使用抗 GST 和抗 His 抗体进行检测（图 3C）。

8. 纯化蛋白的保存

  1. 将纯化的蛋白质在适当的储存缓冲液（例如 20 mM Tris乙酸盐 pH 8.0，200 mM KAc，10% 甘油，1 mM EDTA，0.5 mM DTT）中于4 °C进行透析。透析过程中需注意检查纯化蛋白是否发生沉淀。我们通常在4 °C下轻轻旋转透析2次，每次1小时。
  2. 将纯化的蛋白质分装成小份（10–20 μl），在干冰上冷冻30分钟。将分装样品储存于-80 °C，避免反复冻融。

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结果

为了说明 GST-His 纯化方案的效率，我们纯化了大小为 32.9 kDa 的 S. pombe 蛋白 Rec14。将 Rec14 的 cDNA 克隆至我们改造的 pFastBac1 载体中，使其在 N 端和 C 端分别添加 GST 和 His 标签（图 1A）。随后制备重组杆状病毒，并用于感染 SF9 细胞以表达目标蛋白。将可溶性细胞裂解液与 GST 琼脂糖微珠孵育，通过 PreScission 蛋白酶切割 GST 标签来洗脱结合的蛋白。所得的 Rec14-His 蛋白使用 TALON 树脂进行亲和层析纯化，并用含有 500 mM 咪唑的 TALON 缓冲液洗脱结合的蛋白。纯化后的 Rec14-His 蛋白经储存缓冲液透析后，保存于 -80 °C（图 1B）。

通过考马斯亮蓝染色分析了感染 Rec14 重组杆状病毒或模拟感染（对照）的 SF9 细胞的可溶性及全细胞裂解液，从而确认了 GST-Rec14-His 蛋白的表达（图 3A）。在纯化过程中，我们对多个样...

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讨论

本文所介绍的GST-His纯化方案适用于多种分子量大小的重组蛋白纯化：我们已成功纯化了LiRAD51（41kDa）、piBRCA2（120kDa）、PALB2（130kDa），以及一种不稳定的高分子量蛋白——来自Leishmania infantum的LiBRCA2（125kDa）6,9。此外，采用该方案纯化的蛋白均具有生物化学活性6。该方法的成功完全取决于目标蛋白的表达水平、溶解性及稳定性。

用于在其他宿主（如 E. coli 或酵母）中表达的分子生物学载体，可通过广泛使用的 GST 和 His 标签轻松进行改造。这凸显了本技术在大多数分子生物学实验室中的适用性和成本效益。多种优势促使我们选择感染细胞而非细菌或哺乳动物细胞，用于重组蛋白的表达与纯化。例如，翻译后修饰（如甲基化、磷酸化和泛素化）可显著影响蛋白质的酶活性10。因此，为了研究蛋白质的生理特性，宜采用能够实现翻译后修饰的表达系统，例如 Sf9 感染细胞。与哺乳动物细胞相比，使用 Sf...

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致谢

我们感谢Anne-Marie Dion-Cote就本方法的开发所进行的讨论。J.K.和R.B.为FQNRT博士研究员，M.-M.G.为CIHR范尼尔学者，J.-Y.M.为FRSQ高级研究员。本研究工作获得了加拿大自然科学与工程研究理事会（NSERC）向J.-Y.M.提供的资金支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
<强>试剂
大肠杆菌 DH10Bac（感受态）Invitrogen
Bac-to-Bac杆状病毒表达系统Invitrogen
Maxi Prep 试剂盒Qiagen12163溶液I和溶液II
Ultra Pure Bluo-GalGibco（Life）15519028
IPTGGibco（Life）15529019
Sf9 感染细胞ATCCCRL-1711
PreScission酶GE Healthcare27084301
Grace's 感染培养基补充液Gibco（Life）11605-094
胎牛血清表征HycloneSH30396.03
青霉素-链霉素（P/S）Gibco（Life）15070-063
谷胱甘肽 Sepharose 树脂GE 生物科学17075605
蛋白酶抑制剂混合物罗氏11873580001
Talon 树脂Clontech635504
咪唑BioShop288324
庆大霉素Gibco（Life）15710064
多克隆GST抗体自行生产
单克隆6X-His抗体Clontech631212
<强>仪器设备
Dounce匀浆器（紧密型）Wheaton357546
超声波破碎仪（Fisher dismembrator）FisherModel 150
透析袋（50 mm）Fisher Scientific2115217

参考文献

  1. Lichty, J. J., Malecki, J. L., Agnew, H. D., Michelson-Horowitz, D. J., Tan, S. Comparison of affinity tags for protein purification. Protein Expr. Purif. 41, 98-105 (2005).
  2. Thain, A., Gaston, K., Jenkins, O., Clarke, A. R. A method for the separation of GST fusion proteins from co-purifying GroEL. Trends Genet. 12, 209-210 (1996).
  3. Carr, S., et al. Expression of a recombinant form of the V antigen of Yersinia pestis, using three different expression systems. Vaccine. 18, 153-159 (1999).
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  5. Kuhn, S., Zipfel, P. F. The baculovirus expression vector pBSV-8His directs secretion of histidine-tagged proteins. Gene. 162, 225-229 (1995).
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  7. Filimonova, M. N., et al. Isoforms of Serratia marcescens nuclease. The role of Mg2+ in the hydrolysis mechanism. Biochemistry. 62, 983-988 (1997).
  8. Thorslund, T., et al. The breast cancer tumor suppressor BRCA2 promotes the specific targeting of RAD51 to single-stranded DNA. Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 1263-1265 (2010).
  9. Genois, M. M., et al. Interactions between BRCA2 and RAD51 for promoting homologous recombination in Leishmania infantum. Nucleic Acids Res. 40, 6570-6584 (2012).
  10. Shrestha, B., Smee, C., Gileadi, O. Baculovirus expression vector system: an emerging host for high-throughput eukaryotic protein expression. Methods Mol. Biol. 439, 269-289 (2008).

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