从人类多能干细胞诱导端脑谷氨酸能神经元的特化

摘要

该实验通过模拟人类发育过程中所经历的类似检查点，获得端脑神经元。细胞首先被允许自发分化，随后暴露于促使其向神经谱系分化的因子中，再经过分离后接种至盖玻片上，以促进其终末分化与成熟。

摘要

本文介绍了一种从人类多能干细胞（PSCs）高效生成端脑谷氨酸能神经元的逐步操作流程。分化过程首先将人类PSCs分解为细胞团块，当这些细胞置于悬浮培养中时，团块会聚集成球状结构。在第1至第4天，将这些细胞团在hESC培养基中培养，以促进其自发分化。在此期间，细胞具有分化为三个胚层中任意一种的潜能。从第5至第8天，将细胞转移至神经诱导培养基中，促使其向神经谱系分化。大约在第8天，让细胞贴附于6孔板上继续分化，期间神经上皮细胞逐渐形成。这些神经上皮细胞可在第17天被分离。随后可将细胞以神经球形式维持培养，直至准备将其接种至盖玻片上。通过使用不含任何尾部化因子的基础培养基，可将神经上皮细胞特化为端脑前体细胞，并进一步高效地分化为背侧端脑祖细胞及谷氨酸能神经元。总体而言，该体系为研究人员提供了一种生成人类谷氨酸能神经元的工具，可用于研究此类神经元的发育过程及其相关疾病。

引言

人类多能干细胞（PSCs），包括人类胚胎干细胞（hESCs）和诱导多能干细胞（iPSCs），具有生成体内所有细胞类型（包括神经元）的能力^1-3人类多能干细胞向多种神经元亚型的定向分化是其在再生医学中应用的关键。在发育过程中，功能性神经元亚型的生成是一个复杂的过程，涉及神经谱系的诱导、沿头尾轴方向区域化前体细胞的特化，以及由这些区域化前体细胞分化产生终末分裂后的神经元类型。^4,5自2001年起，已建立多种系统用于从人胚胎干细胞（hESCs）诱导生成神经谱系，这些系统为后续产生不同神经元亚型提供了平台^6,7根据发育学原理，多种神经元类型，例如脊髓运动神经元^8-12中脑多巴胺能神经元^13-15和神经视网膜细胞^16,17 已通过应用在这些神经元类型特化过程中起关键作用的重要形态发生素，从人类多能干细胞（PSCs）中高效地获得了特化的神经元。 体内 发育。其他方案也已开发出来，以通过使用额外因子促进hESCs向神经元的分化^18-20 例如小分子或通过与其他细胞类型共培养以促进分化²¹.

人类新皮层高度发达，包含多种细胞类型，其中包括在学习、记忆和认知功能中发挥重要作用的谷氨酸能神经元^22,23。在体外培养中生成谷氨酸能神经元的第一步是定向诱导端脑前体细胞。Yoshiki Sasai 研究组首次报道了通过在含有 DKK1（可抑制 Wnt 信号通路）和 LeftyA（可抑制 nodal 信号通路）的无血清悬浮培养体系中，将小鼠胚胎干细胞（mESCs）定向分化为端脑前体细胞的方法²⁴。随后，包括我们研究组在内的多个团队也报道了在无血清培养基中由人多能干细胞（PSCs）诱导生成端脑前体细胞的方法^25-27。由人 PSCs 生成端脑前体细胞无需外源形态发生因子，且前体细胞的诱导效率远高于小鼠 ESCs^26,27。本文描述了一种由 Zhang 研究组建立并优化的化学成分明确的神经诱导体系⁷。在不添加外源后脑化因子的条件下，该方案可高效地从人 PSCs 诱导生成端脑前体细胞²⁷。随后可通过调控 Wnt 和音猬因子（SHH）信号通路，将这些前体细胞进一步分化为背侧或腹侧前体细胞。其中，背侧前体细胞可高效地进一步分化为谷氨酸能神经元²⁷。此外，该方案同样适用于由人诱导性多能干细胞（iPSCs）生成谷氨酸能神经元²⁸，从而可获得患者特异性的神经元，用于研究多种疾病的发病机制及潜在治疗方法。同时，我们的体系也为研究端脑中多种神经元类型的发育与特化提供了平台。

方案

1. 人类多能干细胞聚集体的生成（D1-D4）

1. 人类多能干细胞在含有基础成纤维细胞生长因子（bFGF，4 ng/ml）的hESC培养基中，于小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）饲养层上进行培养。培养5-7天后，当细胞集落变大但仍保持未分化状态时，即可进行下一步操作。
2. 首先应配制酶溶液。在50 ml离心管中，将dispase（或胶原酶）溶解于DMEM/F12培养基中，使其终浓度为1 mg/ml。由于该溶液在加热后更易混匀，将含有培养基和酶的离心管置于37 °C水浴中10-15分钟，随后使用Steriflip滤器进行灭菌。
3. 吸除细胞上的培养基，用DMEM/F12培养基轻轻冲洗一次，再吸除。每孔加入1 ml dispase，将培养板放入培养箱中孵育3-5分钟（iPSC可延长至10分钟）。在显微镜下观察细胞，当集落边缘略微卷起或颜色稍变深时，表明细胞已准备就绪。建议在3分钟后开始检查细胞，必要时可继续孵育。首次使用本方案时，建议每次仅处理一块培养板，因为必须尽快将细胞从dispase中移出。
4. 吸除dispase溶液。每孔轻轻加入1.5 ml DMEM/F12培养基（此阶段细胞非常脆弱，容易从培养板上脱落），以充分洗去残留的dispase，随后吸除DMEM/F12。每孔再加入1.5 ml hESC培养基。
5. 为使细胞脱离并分散成团块，将10 ml玻璃移液管的管口置于孔板右下角（接触细胞表面），上下（垂直方向）移动移液管——上提动作应紧邻下压动作的路径。到达孔的另一侧后，再沿水平方向重复此操作。
6. 待所有细胞均悬浮后，将其转移至15 ml离心管中，在200 × g条件下离心2分钟，管底应形成细胞沉淀。小心吸除沉淀上方的培养基。
7. 用于维持细胞聚集体的细胞培养瓶规格取决于初始细胞数量。对于6孔（1块板）的hESC，应使用一个未经组织培养处理的T75培养瓶，并加入50 ml hESC培养基。将第1.6步获得的细胞转移至该培养瓶中，于37 °C培养。
8. 为去除细胞碎片，约12小时后应更换培养基和培养瓶。操作方法如下：将全部培养基和细胞转移至50 ml离心管中，以200 × g离心2分钟，吸除旧培养基。向细胞沉淀中加入50 ml新鲜hESC培养基，转移至新的T75培养瓶中。此后可每日按此方法换液（直至第5天）。

2. 神经上皮细胞的诱导（D5-D17）

1. 将细胞/培养基转移至50 ml离心管中，在200 × g条件下离心2分钟。随后吸除上清液，将细胞转移至新的（非组织培养处理的）T75培养瓶中，加入50 ml神经诱导培养基（NIM）。
2. 细胞进入NIM后，应每隔一天更换一半培养基。数天后，细胞聚集体应已足够大，可在几分钟内自行沉降至50 ml锥形离心管底部（无需离心）。在NIM中培养2–3天后（总计D7–D8），细胞即可准备铺板。可使用层粘连蛋白或胎牛血清（FBS）促进细胞贴附于培养板上。
3. 所需组织培养处理的6孔板数量取决于细胞密度，每个聚集体应能在培养板上继续生长数天而不与其他聚集体接触。通常情况下，一个T75培养瓶的细胞可获得约4–6块6孔板的细胞量。
4. 1. 若使用层粘连蛋白，将其用NIM稀释至10–20 μg/ml，用于包被6孔板（约0.5 ml/孔）。包被2–3小时后，将细胞聚集体接种至6孔板中（每孔约20–30个聚集体）。待聚集体贴附后，加入1.5 ml NIM。
   2. 若使用FBS，配制含90% NIM和10% FBS的混合液（1.5 ml/孔）。将含细胞的培养基1.5 ml加入各孔，轻轻前后摇动培养板使聚集体分散，然后置于培养箱中过夜（O/N）使细胞贴附。次日早晨务必更换培养基（每孔2 ml NIM），以去除FBS。
5. 铺板后一至两天内，每个聚集体将铺展形成单层细胞。数天内，大多数细胞的中心区域在形态上将呈现类似柱状细胞（细长形）的特征。在此期间，应每隔一天更换一次NIM。某些PSC系（尤其是iPSC）可能形成柱状细胞的效率较低。若出现此情况，可在第2阶段添加BMP和TGF抑制剂（Dorsomorphin²⁹、SB431542¹⁹，各2 μM）以促进形成。
6. 约第14–17天，柱状细胞将显得更为致密。有时这些细胞会形成具有可见管腔的脊状或环状结构。除柱状形态外，此阶段的细胞表达神经上皮标志物，如PAX6和SOX1^12,26。
7. 在开始分离前，必须首先观察细胞，判断是否存在非神经上皮细胞。可利用客观标志物识别非神经上皮克隆，并用移液器枪头将其刮除以消除。

3. 端脑前体细胞的生成（D17-D24）

1. 克隆中心含有神经上皮细胞，应将其与克隆的其余部分分离。可使用微量移液器和无菌的1 ml滤芯吸头完成此操作。当对克隆中心施加少量压力时，中心部分通常会很容易地脱离。注意避免克隆外周部分同时脱落。如果中心部分难以分离，可在无菌操作台的显微镜下用针进行切割去除。将克隆中心部分转移至15 ml离心管中，在200 × g下离心2分钟。
2. 应吸除细胞上的培养基。两块培养板的细胞可转移至一个未经组织培养处理的T25培养瓶中，加入10 ml NIM培养基，并添加B27（不含维生素A，1:50）。每块细胞培养板使用5–10 ml培养基。
3. 次日观察细胞时，应呈现类球状形态。必须将这些细胞转移至新的培养瓶中（继续使用含NIM和B27（1:50）的培养基），因为外周细胞容易悄悄附着到培养瓶底部。
4. 随后，神经球应在添加B27（1:50）的NIM培养基中悬浮培养一周。为促进细胞存活和增殖，可在悬浮培养期间向培养基中添加环磷酸腺苷（cAMP，1 μM）和胰岛素样生长因子（IGF1，10 ng/mL）。此时，神经球含有端脑前体细胞（FOXG1⁺），可接种至盖玻片上进行终末分化。

4. 进一步分化为端脑神经元（D25+）

1. 1. 为接种细胞，准备已用多聚鸟氨酸/层粘连蛋白包被的盖玻片（置于24孔板中）。首先清洁盖玻片，然后用多聚鸟氨酸包被（0.1 mg/ml，37 °C，过夜），之后储存于冷冻室。
      多聚鸟氨酸包被步骤：
      1. 对盖玻片进行灭菌：将盖玻片放入盛有硝酸的烧杯中，在通风橱内轻轻震荡1小时。倒出硝酸，用去离子水多次冲洗，并将盖玻片置于流动的去离子水中至少15分钟。随后将盖玻片放入95%乙醇中，若立即使用则震荡30分钟，否则可在室温下保存于乙醇中。
      2. 在无菌操作台中，将装有灭菌后盖玻片的50 ml离心管内容物倒入6孔板的盖子中。使用灭菌镊子逐个夹取盖玻片，垂直插入24孔板的单个孔中。重复此操作，使每个孔均含有一片盖玻片。
      3. 待盖玻片完全干燥后，轻敲培养板使盖玻片平落于孔底。随后向每片盖玻片加入100 μl多聚鸟氨酸溶液（0.1 mg/ml，溶于无菌dH₂O），于37 °C孵育过夜。
      4. 次日，从培养箱中取出培养板，使其冷却至室温。从盖玻片边缘吸除多聚鸟氨酸溶液，注意避免触碰或刮伤盖玻片表面。吸除后让盖玻片干燥约30分钟，再进行洗涤。
      5. 向每孔加入1 ml无菌dH₂O，静置10分钟，然后吸除孔内液体。重复该洗涤步骤两次。待培养板完全干燥后（在操作台中保持敞口），盖上盖子，用铝箔包裹，于-20 °C保存。
   2. 1. 为进行层粘连蛋白包被，向每片经多聚鸟氨酸处理的盖玻片加入50 μl神经分化培养基与层粘连蛋白的混合液（终浓度为20 μg/ml），注意仅使液体接触盖玻片表面，避免溢出。在准备细胞接种前，于37 °C孵育1–2小时。
2. 收集神经球，并在15 ml离心管中以200 × g离心2分钟，吸除上清液。
3. 1. 用DMEM-F12培养基清洗细胞，再次离心。若神经球过大而难以有效贴附，可在该步骤使用Accutase进行解离。
   2. 若使用Accutase：在用DMEM-F12洗涤细胞后，加入Accutase（约2 ml）将神经球解离为小细胞团，于37 °C孵育3分钟。随后加入等量的胰蛋白酶抑制剂（约2 ml），并在200 × g下离心3分钟。将细胞重悬于NDM培养基中，使用P200移液器轻轻吹打破碎细胞团。随后将小细胞团接种至预先包被的盖玻片上。
4. 吸除大部分培养基，将细胞置于6 cm培养皿中，保留少量液滴以便于挑选细胞。向每片预先包被的盖玻片接种约4–5个神经球。无需预先吸除层粘连蛋白溶液。
5. 让神经球贴附至少2–4小时。待其充分贴附后，向每片盖玻片添加更多培养基（0.5 ml/盖玻片），培养基成分为神经分化培养基，并补充B27（1:50）、cAMP（1 μM）以及神经营养因子（BDNF、GDNF和IGF，均为10 ng/ml）。此后可每隔一天更换一半培养基，此类细胞可维持培养数月之久。

结果

本文描述了一种通过多个关键步骤将人多能干细胞（PSCs）分化为端脑谷氨酸能神经元的方案：包括PSC聚集体的形成、神经上皮细胞的诱导、端脑前体细胞的生成，以及这些前体细胞向端脑神经元的终末分化（图1）。该体系在生成端脑前体细胞和谷氨酸能神经元方面具有高度稳定性和高效性。例如（图2），在未添加尾部化因子的情况下，人胚胎干细胞（hESCs）被成功分化为神经谱系²⁷。在分化第24天，大多数神经前体细胞表达FOXG1（端脑表达的转录因子），但不表达HOXB4（后脑和脊髓细胞的标志物），表明端脑前体细胞已成功生成（图2D）。这些端脑前体细胞具有背侧表型，表现为表达PAX6（背侧前体细胞标志物）（图2E），而不表达NKX2.1（腹侧前体细胞标志物）（图2F）。经过进一步分化后，这些端脑背侧前体细胞分化为谷氨酸能神经元，其中约80%的细胞表达谷氨酸能标志物TBR1²⁷。TBR1阳性的神经元也同时表达神经元标志物βIII-微管蛋白（

讨论

在神经分化过程中有几个关键步骤。必须确保人多能干细胞（PSCs）具有多能性，否则这些细胞可能已偏向于非神经谱系的分化。可通过使用针对多能性标志物（如 Oct4、Sox2、Nanog 和 Tra-1-60）的抗体对人 PSCs 进行染色来验证其多能性^1-3。若人 PSCs 在传代后贴壁效果不佳，可添加 ROCK 抑制剂（Y27632）以改善。对于难以维持细胞多能性的实验者，可能存在的问题包括饲养层 MEF 细胞的质量/密度，以及所用 KOSR 的批次差异，因为不同批次之间可能存在变异。尽管上述方案中使用了 MEF 饲养层细胞来维持 PSCs，但本方法同样适用于在无饲养层体系中培养的 PSCs。

在将细胞解离形成PSC聚集体时，需将细胞暴露于dispase的时间限制在几分钟内（细胞边缘会变圆）。iPSCs细胞边缘变圆所需的时间（最长可达10分钟）通常比ESCs细胞（3–5分钟）更长。每次仅向一个培养皿的人源PSCs中添加dispase为最佳操作，以确保细胞不会因酶处理时间过长而受到损伤甚至死亡。当细胞进入PSC聚集体阶段后，应保持较低的细胞密度。在接种PSC聚集...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
含F12营养混合物的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM/F12）	Gibco	11330-032
无血清培养基替代物	Gibco	10828-028
L-谷氨酰胺（200 mM）	Gibco	25030
非必需氨基酸	Gibco	1140-050
2-巯基–乙醇（14.3 M）	Sigma	M-7522
Neurobasal 培养基	Gibco	21103-049
N2	Gibco	17502-048
B27	Gibco	12587-010
肝素	Sigma	H3149
聚-L-鸟氨酸氢溴化物（polyornithine）	Sigma	116K5103
层粘连蛋白（人）	Sigma	L-6274
层粘连蛋白（小鼠）	Invitrogen	23017-015
FBS	双子座	100-106
牛血清白蛋白（BSA）	Sigma	A-7906
Dispase	Gibco	17105-041
胶原酶	Invitrogen	17104-019
Accutase	创新细胞技术	AT104
ROCK抑制剂	Stemgent	04-0012
SB431542	Stemgent	04-0010
Dorsomorphin	Stemgent	04-0024
成纤维细胞生长因子2（FGF2, bFGF）	Invitrogen	13256-029
胰蛋白酶抑制剂	Gibco	17075
0.1% 明胶	Millipore	ES-006-B
Foxg1 抗体	Dr. Y. Sasai
Hoxb4 抗体（1:50）	发育研究杂交瘤库	I12
Pax6 抗体（1:5000）	发育研究杂交瘤库	PAX6
Nkx2.1 抗体（1:200）	Chemicon	MAB5460
Tbr1 抗体（1:2000）	Chemicon	AB9616
vGLUT1 抗体（1:100）	Synaptic Systems	135302
脑源性神经营养因子（BDNF）	PrepoTech Inc.	450-02
胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）	PrepoTech 公司	450-10
胰岛素样生长因子1（IGF1）	PrepoTech Inc.	100-11
环磷酸腺苷（cAMP）	Sigma	D-0260
Sonic hedgehog (SHH)	R&研发	1845-SH
50 ml 离心管	Becton Dickinson (BD)	352098
15 ml 离心管	BD	352097
6孔板	BD	353046
24孔板	BD	353047
T25 培养瓶（未处理）	BD	353009
T75 培养瓶（未处理）	BD	353133
盖玻片	Chemiglass生命科学	1760-012
6 cm 培养皿	BD	353004
9'' 玻璃移液管	Fisher	13-678-20D
Steriflip 滤器（0.22 μM)	Millipore	SCGP00525
Stericup 滤器 1,000 ml（0.22 μM	Millipore	SCGPU10RE
相差显微镜（Observer A1）	Zeiss	R2625
二氧化碳培养箱（Hera Cell 150）	Thermo Electron Corporation
生物安全柜（SterilGard III Advance）	The Baker Company
离心机（5702 R）	Eppendorf