利用慢性社会应激建立哺乳期啮齿类动物的产后抑郁模型

摘要

本文描述了使用慢性同域入侵者社会应激作为一种符合动物行为学的范式，以模拟哺乳期啮齿类动物的产后抑郁和焦虑。

摘要

长期压力暴露是抑郁障碍的可靠预测因素，而社会压力在动物和人类中均是一种常见的、符合自然行为学的相关压力源。然而，许多抑郁症动物模型是在雄性动物中建立的，不适用于或对产后雌性动物的研究无效。最近的研究报道了哺乳期长期社会压力（一种符合自然行为学且有效的压力刺激）对母体行为、生长以及行为神经内分泌学具有显著影响。本文将描述这一长期社会压力范式，即反复让哺乳期雌性动物暴露于陌生雄性入侵者，并评估该模型对行为、生理和神经内分泌方面的影响。长期社会压力（CSS）是研究压力对母体及其后代乃至未来几代行为与生理影响的有价值模型。将幼崽暴露于长期社会压力（CSS）也可作为一种早期生命压力，对行为、生理和神经内分泌产生长期影响。

引言

情绪障碍（包括产后抑郁症）的病因通常涉及长期应激的暴露^1,2。尽管母亲抑郁会对育儿行为³以及子代的心理发育⁴产生负面影响，但目前绝大多数关于抑郁和焦虑的研究都集中在雄性动物和人类身上。虽然已有少数利用慢性应激建立的母性行为改变动物模型，但大多数模型具有显著的生理学成分，可能并不适用于人类常见的慢性心理社会应激，或主要集中于产前阶段。在大鼠妊娠期间施加慢性束缚应激，在某些研究中会增加母性照料和焦虑水平，并降低母性攻击性⁵，但在其他研究中却会减少母性照料行为⁶。束缚应激是一种强烈的生理应激源⁷，且部分研究结果与临床上产后抑郁症患者母亲表现出的母性照料减退现象不一致⁴。产前超轻微应激不会影响对幼崽的照料行为，但可降低母性攻击性⁸。超轻微应激范式在数天内采用多种随机化的应激因素（如笼具倾斜30度、光照周期颠倒、限制活动、整夜照明以及脏笼等），但各个单一因素的具体影响往往尚不明确。超轻微应激范式中使用的某些应激因素（例如光照周期颠倒和整夜照明）很可能独立于应激效应之外直接干扰母性照料行为，因为大鼠的母性照料行为具有昼夜节律性。潮湿垫料对幼崽构成显著的热应激，在幼龄仔鼠中可在不到24小时内导致死亡（个人观察）。

近期的啮齿类动物研究主要关注使用生态学上相关联的应激源（如慢性社会应激，CSS），来研究应激对子代行为及情绪障碍的影响^9-13。为了建立一种具有生态学意义的产后抑郁模型，减少所用应激源的生理成分，并获得稳定的行为学和生理学结果，本实验室专注于社会应激的应用。虽然慢性社会挫败已被有效用作雄性啮齿类动物社会应激诱导抑郁的模型¹⁴，但如果使用雄性入侵者，则该模型对许多母体啮齿类动物而言并不符合生态学实际，因为单次社会挫败通常会导致雄性入侵者对整窝幼仔进行同类相食。然而，让哺乳期雌性短暂接触陌生雄性入侵者而不发生社会挫败，即可引发强烈的应激行为和内分泌反应^15-18。另有证据表明，哺乳期的慢性应激（包括暴露于雄性入侵者）会直接损害乳汁分泌^19,20，从而可能影响幼仔的生长发育。母鼠中的这些结果得到了未交配雌性研究的支持：在后者中，慢性社会不稳定（交替的隔离与拥挤环境）可增加下丘脑-垂体-肾上腺轴的活动性^11,21，改变体温调节，减少蔗糖摄入和食物摄取，并已被提出作为女性抑郁症的动物模型¹¹。自我理毛行为是焦虑的一种测量指标^22,23，也对社会应激操作敏感^24,25。

哺乳期的慢性社会应激（CSS）可破坏母体行为，并抑制母体及其子代的生长发育。在哺乳期间每天引入陌生雄性入侵者会减少母体的育幼行为，增加母体对陌生雄性入侵者的攻击性以及自我理毛行为，同时抑制母体和子代的生长¹⁰。这些效应表明，CSS是一种符合动物自然行为特征且有效的模型，可用于研究涉及母体护理受损、快感缺失、焦虑升高以及子代生长迟缓等特征的情绪障碍，例如产后抑郁。母体护理行为和子代相关数据均提示，CSS可能对后代产生持久影响；关于慢性应激对母体行为影响的研究支持这一假说：慢性应激对母体行为的作用是由激素介导的（Murgatroyd 和 Nephew，2012）。此外，近期来自经历应激母体的成年雌性子代的数据支持另一假说：CSS作为一种早期生活应激形式，会引起中枢催产素（OXT）和催乳素（PRL）的改变，进而导致哺乳行为效率下降¹²。CSS模型补充了其他有效的应激诱导母体行为紊乱模型，例如限制筑巢材料^26,27和母婴分离^28,29。CSS模型的独特之处在于，它在啮齿类动物和人类中均具有行为学相关性，生理应激成分相对较小，并且可与其他生命阶段的类似应激源（如社会挫败、慢性社会不稳定）联合使用。

开发慢性社会应激（CSS）范式的主要目标是采用一种在行为学和临床意义上均相关的应激源，诱导快感缺失（通过母体照料行为和糖精偏好来衡量），增加焦虑相关的行为学指标，并损害幼崽的生理、行为和/或内分泌发育。该模型的目的是用于评估当前及新型的产后抑郁和焦虑治疗方法与干预措施。

方案

成年雌性斯普拉格-道利大鼠在本实验动物设施中进行繁殖，每窝幼仔调整为8至10只，性别比例均衡，母性行为及攻击性测试均在大鼠的饲养笼内进行。实验动物在整个研究期间始终处于同一房间内。在妊娠第20或21天，将由透明有机玻璃制成的高约2.5厘米的笼内隔板放入笼中，将笼子均分为四个象限，以防止幼仔被放回后爬回母鼠身边。在分娩当天（哺乳第1天），通过直接观察幼仔的归巢、理毛、哺乳以及母鼠自梳理等行为，确认所有母鼠均表现出典型的母性行为。入侵雄鼠为体型较小或相近的斯普拉格-道利雄性大鼠，且雌性大鼠不会被同一只雄性重复测试。母性行为及母性攻击行为在哺乳第2、9和16天上午进行视频记录，具体方法如下所述：

1. 将幼崽从母鼠笼中移出，分别称量雄性和雌性幼崽的体重，并将整窝幼崽放入清洁的暂养笼中，持续60分钟。
2. 在60分钟分离期结束后，将雄性和雌性幼崽分别再次称重，然后将其放回母鼠的原笼中，并尽可能均匀地将幼崽分配到笼子的三个非筑巢象限区域。在重新引入幼崽前开始视频记录，以确保完整记录所有幼崽的回收行为。
3. 连续录像记录母鼠育幼行为30分钟。允许母鼠与其幼崽继续互动90分钟。在将幼崽放回母鼠笼中120分钟（30分钟录像加额外90分钟）后，再次称量幼崽体重，以确定两小时内摄入的乳汁量。在行为测试日，每次哺乳120分钟后，从每窝中安乐死一只幼崽，以从其胃中提取乳汁样本。采集幼崽胃内乳汁的目的是评估母鼠乳汁中激素及其他因子的水平，这些因子可能介导慢性社会应激对子代行为和/或生理的影响。
4. 称重后将剩余幼崽放回母鼠身边，并向笼中引入一只体型较小或相近的陌生雄性入侵者，持续30分钟，以检测母鼠攻击行为。在引入入侵者时即开始视频记录，确保所有攻击行为均被记录。对于对照组动物，30分钟记录结束后即移除陌生雄鼠；对于慢性社会应激组动物，雄性入侵者继续保留30分钟。在第2至16天期间的非行为测试日，向慢性社会应激组母鼠笼中放入陌生雄性入侵者一小时，但不进行录像记录。若出现受伤情况，则立即终止社会应激暴露，受伤动物接受治疗并从实验中剔除。
5. 在第2、9和16天下午3点，向母鼠笼中添加一瓶含0.02%糖精的饮水瓶，瓶子位置在左右两侧交替放置。在下午3点和次日早上8点分别称量糖精水瓶和普通水瓶的重量，以计算糖精偏好程度。
6. 幼崽于第23天断奶，此时将母鼠安乐死，采集基础状态下的血浆样本，并取出脑组织，用于对与生理和行为相关的关键核团进行基因表达分析。

母性行为评分

使用Odlog行为分析软件对表1和表2中描述的母性照料与攻击行为进行视频评分。每种行为均分配一个按键，当动物执行某项行为时持续按住对应按键，以记录该行为的持续时间。行为发生频率为每种行为对应的按键次数之和。该软件可生成两个数据文件：一个是包含每5秒时间戳的完整数据文件，另一个是汇总表格，其中列出了30分钟录像期间定义的各项行为的总频率和总持续时间。在母性攻击行为视频中，同时对母性攻击和母性照料行为进行评分，因为当雄性入侵者处于笼内时，母鼠仍会对幼崽表现出母性反应。

将幼崽放入笼子后不久，母鼠会逐一将每只幼崽叼回巢中。当所有幼崽均被带回巢内时，记为一次完整的归巢行为。通常情况下，完整归巢仅记分一次；但若母鼠在首次完成全部归巢后，又将整窝幼崽转移至新的位置，则可记分两次。每当母鼠用口或爪子整理筑巢材料时，即对筑巢行为进行记分。幼崽理毛行为包括母鼠用爪子舔舐或整理幼崽毛发。哺乳记分始于母鼠保持静止的蹲伏或俯卧哺乳姿势达10秒之后，以确保幼崽有时间开始吸乳。总的母性照料时长为筑巢、幼崽理毛和哺乳行为持续时间的总和；但若需重点关注针对幼崽的行为，可仅统计理毛和哺乳两项。自我理毛定义为母鼠用自己的口或爪子整理自身毛发。活动性记分适用于任何不属于上述已定义行为的运动行为。

母性攻击行为包括攻击、咬、踢和按压。攻击定义为母鼠对入侵雄鼠进行击打或扑压。当母鼠使用牙齿咬入侵者时记为咬行为，当母鼠用四肢或身体将雄鼠压住时记为按压行为。总攻击行为次数为攻击、咬、踢和按压行为的总和。

统计学

通过单尾t检验比较对照组和慢性社会应激（CSS）组母鼠在哺乳期各天的母性行为、乳汁摄入量及糖精偏好，以评估CSS在各单独天数上的效应。哺乳期第2、9、16天的生长数据采用单尾t检验进行比较，比较指标为第2天的体重（克）或相对于第2天的体重增长百分比（第9天或第16天体重 / 第2天体重 × 100）。OXT mRNA表达水平以三个内参基因（β-actin、次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶（HPRT）和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH））的均值进行标准化。各脑区中每种肽或受体的相对OXT mRNA表达水平采用独立t检验进行比较。所有图表结果均以组均值 ± 标准误（SEM）表示，统计学显著性水平设定为p ≤ 0.05。

结果

暴露于慢性社会应激（CSS）的哺乳期母鼠在哺乳第9天的30分钟视频记录中，其对幼鼠的理毛持续时间及总体母性照料行为均减少（Nephew and Bridges 2011， 图2。在哺乳的第16天，攻击行为和自我理毛行为（焦虑的指标）增加（Nephew 和 Bridges 2011， 图3). CSS 亲代母鼠的幼鼠在哺乳期第 9 天和第 16 天的乳汁摄入量比对照组母鼠的幼鼠减少 40%（图4），且在这两天幼崽的生长受到抑制（Nephew 和 Bridges，2011）。 图5。在第16天，经CSS处理的母鼠对糖精的偏好降低（图6).

在经CSS处理的母鼠所产的成年F1代雌性子代中，第2天和第16天的乳汁摄入量（图7）和糖精偏好（图8）均下降。这些母鼠的视上核中催产素基因表达降低（图9），在室旁核、中央杏仁核和内侧杏仁核中也观察到类似结果（Murgatroyd 和 Nephew，2012）。

行为	描述
retrieval（取回）	将幼崽叼回巢中
Full Retrieval（完全取回）	取回全部8只幼崽所需的时间
Nesting（筑巢）	用口或爪子在巢区整理垫料
Pup Grooming（幼崽理毛）	舔舐或用爪子整理幼崽毛发
Nursing（哺乳）	母鼠呈蹲伏或俯卧姿势进行哺乳时
Total Maternal Care（总育幼行为）	Nesting（筑巢）、Pup Grooming（幼崽理毛）和 Nursing（哺乳）的总持续时间
Self Grooming（自我理毛）	母鼠用口或爪子整理自身毛发
Activity（活动）	与上述行为无关的任何运动行为

表1. 母体护理。

行为	描述
攻击	对入侵雄性进行拳击或扑击
啃咬	使用牙齿攻击入侵雄性
踢击	使用足部击打入侵雄性，类似于兔子的踢腿动作
按压固定	母性雌性用肢体或身体将雄性压住使其无法动弹
总攻击行为	攻击、啃咬、踢击和按压固定持续时间的总和

表2. 母性攻击行为。

图1. 慢性社会应激实验方案的时间安排。

图2. 慢性社会应激在泌乳第9天减少母体护理行为。 在连续7天内，每天将泌乳期母鼠暴露于一只新的雄性入侵者面前一小时，导致其在30分钟母体行为录像期间用于幼崽理毛及总体母体护理（包括幼崽理毛、哺乳和筑巢行为）的时间减少（Nephew 和 Bridges，2011年）。* 表示对照组与应激组之间存在显著差异，p<0.05，n = 9–10。

图3. 慢性社会应激在哺乳第16天增加母性攻击行为和焦虑水平。 在14天内，每天将哺乳期母鼠暴露于一只新的雄性入侵者面前一小时，可增加攻击行为和自我理毛行为的持续时间 (A) 和频率 (B)，并在30分钟的母性攻击行为视频记录中降低运动活性（Nephew 和 Bridges，2011）。* 表示对照组与应激组之间存在显著差异，p<0.05，n = 9–10。

图4. 慢性社会应激降低子代的乳汁摄入量。 在哺乳第9天和第16天，经历应激的母鼠所产幼崽在两小时哺乳期内的总乳汁摄入量减少。* 表示对照组与应激组之间存在显著差异，p<0.05，n = 12–14。

图5. 哺乳期第9天和第16天，慢性社会应激减弱幼鼠生长。 在哺乳期连续15天使母鼠暴露于慢性社会应激，会导致幼鼠生长减缓（Nephew 和 Bridges，2011）。* 表示对照组与应激组之间存在显著差异，p<0.05，n = 9–10。

图6. 慢性社交应激导致哺乳第16天糖精摄入量减少。 持续15天的社交应激降低了在17小时时间内糖精相对于水的摄入百分比。* 表示对照组与应激组之间存在显著差异，p<0.05，n = 9–10。

图7. 慢性早期生活社交应激降低F1代母鼠后代的乳汁摄入量。 F1代母鼠后代（每窝8-10只幼鼠）在2小时哺乳间隔内的总乳汁摄入量在哺乳第2天和第16天均有所减少。*表示对照组与应激组之间差异显著，p<0.05，n = 12-14。

图8. 慢性早期生活社会应激导致哺乳期第2天和第16天糖精摄入量减少。 持续15天的社会应激降低了在17小时期间内糖精相对于水的摄入百分比。* 表示对照组与应激组之间存在显著差异，p<0.05，n = 12–14。

图9. 慢性早期生活社会应激降低视上核中催产素mRNA的表达水平。 暴露于慢性社会应激的母鼠所产的成年雌性子代，其中枢催产素活性减弱，且与哺乳效率下降相关（Murgatroyd 和 Nephew，2012）。OXT mRNA 的表达水平以三个内参基因（β-actin、次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶（HPRT）和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH））的均值进行标准化。* 表示对照组与应激组之间存在显著差异，p<0.05，n = 16–18。

讨论

在稳定的行为学研究环境中，采用CSS范式获得的数据最有可能具有一致性和可重复性。有观点认为，在各类研究中，尤其是行为学研究中，实验动物的饲养和管理是需要更加仔细考虑的一个组成部分。可能引入混杂因素的饲养和管理操作包括：使用从供应商处运输来的怀孕母鼠作为起始动物、在行为学测试期间每天将母鼠在不同房间之间转移、行为学测试时间在一天中的不一致、母鼠过度暴露于新的视觉、听觉或嗅觉刺激、未使用饲养笼进行行为学测试、筑巢材料缺乏或不一致，以及日常动物护理不良（例如，长期接触潮湿或被污染的垫料）。此外，在哺乳期间加入其他行为学测试（例如，强迫游泳测试或高架十字迷宫）也可能引入混杂因素。然而，使用新的笼具环境或其他急性应激源可能有助于揭示在饲养笼测试中不明显的行为差异，这可能是由于慢性应激、急性应激与行为之间潜在的相互作用所致。

目前描述的方案适用于 Sprague Dawley 大鼠，但其他品系或物种可能需要对该方案进行修改。例如，必须使用屏障保护幼仔，防止具有高度攻击性的 Long Evans 雄性个体造成伤害。实施社会应激的关键操作包括：使用体型较小或体型相近的雄性个体，并让雄性入侵者在第 2 天与具有高度攻击性的哺乳期雌性首次接触，以确保雄性被击败并表现出持续的顺从行为。如果雄性攻击了幼仔，应将其从实验中剔除，因为其很可能继续攻击后续的幼仔。为降低雄性过度攻击的可能性，一种可选方法是在研究开始前使其被体型更大的雄性击败。在行为评分方面，必须对大多数行为的发生频率和持续时间进行记录和分析，以全面反映行为特征；若采用较短的记录间隔或瞬时观察法，可能无法收集到足够数据，难以充分验证假设。评分人员可通过观看先前已评分的行为视频进行系统且一致的培训。

CSS模型的主要应用是测试当前和新型药物对产后抑郁和焦虑的治疗效果。该模型的另一个用途是研究常见实践和操作对母体护理行为的影响，例如剖宫产、引产以及各种哺乳时间表。鉴于目前关于压力对哺乳影响的研究较少，进一步探究压力对哺乳的潜在影响将具有重要价值。尽管采集母鼠乳汁样本可能有用，但样本采集过程中需要使用麻醉剂和外源性催产素（OXT），这会引入多种行为和生理上的混杂因素，因此关于压力对哺乳影响的研究可能难以同时进行行为学分析。利用CSS模型开展跨代研究具有广阔前景，这些研究还可包括对成年后代施加各种应激处理，以探讨生命早期应激与后期应激暴露之间可能存在的相互作用。

CSS 模型及相关行为测试的重要性在于其在动物行为学和转化研究中的相关性。目前认为，现有抑郁症和焦虑症治疗方法效果不佳，原因在于动物研究与人类研究之间缺乏行为学上的重叠。动物的抑郁和焦虑模型通常依赖强烈的物理应激源或高度筛选的品系，这或许可以解释为何当前的抗抑郁治疗对重度抑郁最为有效。诸如束缚以及暴露于多种随机应激源等物理应激方式，并不能模拟人类常见的生活经历。慢性轻度应激范式中采用随机暴露的原理是为了防止动物产生适应。尽管这是一个重要的考虑因素，但更理想的情况是采用一种动物不会适应且更接近人类抑郁和焦虑病因的实验方案，例如社会性应激。除了推动使用更具行为学相关性的应激源外，CSS 模型的另一优势在于采用了一项与快感缺失相关的有意义测量指标——母性行为。这是一种由强烈奖赏介导的行为，可直接反映抑郁母亲对后代产生的不良影响。在抑郁与焦虑研究中，同时结合行为学相关的应激源和对快感缺失的测量，将特别有助于识别安全有效的预防措施和治疗方法。

社会应激模型在雄性及未产雌性动物中已成功应用多年，将该研究拓展至哺乳期雌性动物，有望为产后抑郁症以及与早期生活应激相关的疾病（在雄性和雌性中均存在）提供大量新颖的数据。人们推测，在抑郁和焦虑研究中更多地采用行为学动物模型，将有助于收集到更具行为学意义和转化价值、变异性更小且可重复性更高的行为学数据，从而推动更有效治疗方法的开发。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
ODlog 视频分析	Macropod 软件	版本 2.7.2	适用于 PC 或 Mac
录像设备	Sony	HDR-CX130