微流控芯片的制备及流感检测方法

摘要

已开发出一种用于分子诊断的集成化微流控热塑芯片。该芯片可进行核酸提取、逆转录和聚合酶链式反应（PCR）。文中描述了该芯片的制备与运行方法。

摘要

快速且有效的诊断在控制传染病方面发挥着重要作用，能够实现对患者的高效管理和治疗。在此，我们介绍一种集成化的微流控热塑性芯片，可对患者鼻咽（NP）拭子和吸出物中的甲型流感病毒进行扩增。在加载患者样本后，该微流控装置依次在固相萃取（SPE）单元中完成细胞裂解、RNA纯化与富集，随后在逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）腔室中进行逆转录（RT）和聚合酶链式反应（PCR）。终点检测通过芯片外的生物分析仪（Bioanalyzer，Agilent Technologies，Santa Clara，CA）完成。在外围设备方面，我们使用单个注射泵驱动试剂和样本，同时采用两个薄膜加热器分别为RT和PCR腔室提供热源。该芯片设计为单层结构，适用于高通量制造，可缩短 fabrication 时间并降低成本。该微流控芯片为多种病毒和细菌的分析提供了平台，其应用范围仅受限于为检测新病原体所需调整的试剂设计。

引言

20世纪的三次流感大流行已报告数百万例死亡¹。此外，世界卫生组织（WHO）于2009年宣布了最近一次流感大流行²，截至2010年8月1日，世界卫生组织报告了18,449例死亡³。此次大流行再次表明传染病带来的沉重负担，以及快速、准确检测流感以实现疾病快速确诊、采取适当的公共卫生应对措施和有效治疗的必要性⁴。

目前有多种方法被广泛用于流感的诊断，包括快速免疫检测、直接荧光抗原检测（DFA）和病毒培养法。快速免疫检测的灵敏度明显不足^5-8，而另外两种方法则费时且劳动强度大⁹。分子检测具有多项优势，包括检测周期短、灵敏度高以及特异性更强。多家商业机构正在致力于开发针对传染病的快速分子检测方法（也称为核酸检测试剂或NATs），其中多家公司已有流感检测试剂处于研发管线中。然而，其中大多数方法仍需要在芯片外进行样本前处理。目前尚无任何获得临床实验室改进修正案（CLIA）豁免的分子检测方法将样本前处理步骤整合到检测试剂盒或检测模块中。

芯片实验室技术在即时检测设备的发展中起着重要作用。自从1993年首次提出PCR芯片以来¹⁰，人们已投入大量努力用于开发核酸检测试芯片。然而，其中仅有少数实现了将粗制样本的前处理与下游扩增过程整合于一体。

我们此前已展示了将固相萃取柱（SPE）微型化并集成到塑料微流控芯片中的方法¹¹，以及连续流动PCR芯片的开发与优化¹²。在此，我们在前期工作基础上进一步将SPE与逆转录（RT）和PCR步骤集成于单一芯片中，用于临床诊断，并验证其从患者鼻咽（NP）拭子和抽吸物中扩增核酸的能力。

方案

1. 芯片制备¹²

1. 使用Zeonex 690R颗粒制备两块板材：将8–9克Zeonex颗粒均匀分布在金属板中央，置于加热压机中于198 °C预热5分钟，然后缓慢加压至2,500 psi，持续5分钟。本步骤使用Carver热压机完成。
2. 使用环氧树脂模具在板材上压印微流控通道。模具制备细节见其他文献¹²（通道设计见图2b）：将一块板材置于环氧模具上，在加热压机中于157 °C预热10分钟，然后缓慢加压至1,000 psi，持续10分钟。在板材冷却前用手或镊子将其从模具中取出。（注意：此步骤需佩戴耐热手套。）
3. 在压印后的芯片上钻孔，位置分别为微流控通道的入口、废液口和出口。我们使用直径为1.25 mm的钻头钻出这三个孔。
4. 将压印后的芯片与另一块板材（上层）键合：依次用异丙醇（IPA）、RNAse Away和去离子水清洗芯片；风干后在加热压机中于131 °C预热10分钟，然后在350 psi压力下压合10分钟。
5. 使用J-B Weld环氧树脂将Nanoport分别安装在入口、废液口和出口端口；根据制造商说明固化15至24小时。
6. 用50 μl RNAse Away冲洗SPE通道，随后用100 μl无核酸酶水冲洗。
7. 向SPE通道中加载4 μl接枝溶液（含3% w/v苯甲酮的甲基丙烯酸甲酯），然后在365 nm紫外光、2,000 mJ/cm²条件下于紫外烘箱中孵育10分钟，使甲基丙烯酸酯交联。用真空泵去除残留的接枝溶液。我们使用壁式真空泵。为获得最佳效果，应使用新鲜配制的溶液。然而，通常可将配制好的溶液在4 °C保存最多一周。
8. 配制SPE柱溶液（均为体积百分比v/v %）：16% 二甲基丙烯酸乙二醇酯、24% 丁基丙烯酸甲酯、42% 1-十二醇、18% 环己醇，并加入1% 2-二甲氨基-4-(甲基-苯基氨基)-苯酚作为光引发剂。
9. 取与SPE柱溶液体积相等的二氧化硅微球溶液（以形成1:1混合物），在真空烘箱中70 °C下过夜完全干燥。盖紧管盖后轻敲管壁使颗粒松散。将SPE柱溶液加入干燥的二氧化硅微球管中，涡旋混匀。
10. 将4 μl SPE溶液加载至同一通道中，然后在紫外光下照射2.5分钟进行交联。随后将芯片翻转，再照射2.5分钟。聚合后的SPE柱应呈不透明白色固体。
11. 用500 μl 100%甲醇冲洗通道，以去除过量反应物。该冲洗步骤还可去除聚合物内部的致孔溶剂，从而使SPE柱在常温干燥后形成开放的孔隙结构。
12. 使用导热胶带将两个薄膜加热器固定在芯片底部。加热器的两侧需分别与用于变性和退火的宽通道边缘对齐（见图1）。
13. 通过每个芯片末端封闭的侧通道插入五根热电偶（见图2b）。热电偶通过过盈配合固定在这些通道中，并使用胶带进一步固定其位置。

2. 固相萃取方法

1. 使用经DEPC处理并高压灭菌的水（去离子水或Millipore过滤水）配制96 μl的70%乙醇。
2. 在一个离心管中，将4 μl的25X RNA Secure加入96 μl的70%乙醇中；在另一个离心管中，用100%乙醇配制相同的混合液。
3. 通过混合以下组分配制300 μl通道缓冲液：75 μl的6 M硫氰酸胍（GuSCN）、150 μl的2-丙醇、63 μl无核酸酶水以及12 μl的25X RNA Secure。
4. 通过混合以下组分配制312 μl裂解缓冲液：100 μl的6 M硫氰酸胍（GuSCN）、200 μl的2-丙醇以及12 μl的25X RNA Secure。
5. 将70%乙醇、100%乙醇、通道缓冲液和裂解缓冲液在60 °C下加热10–20分钟，以激活RNA Secure。
6. 为平衡微流控通道，以0.8 ml/hr的流速将通道缓冲液通过固相萃取（SPE）通道。
7. 将VTM中的待测样本在37 °C水浴中快速解冻，一旦完全解冻立即从水浴中取出样本。
8. 以13,000 rpm离心样本10分钟，转移100 μl上清液至300 μl裂解缓冲液中，并加入6 μl浓度为1 μg/μl的载体RNA，混匀。
9. 涡旋混匀后，短暂离心5秒，将全部裂解物加载至一支Luer-lok 1 cc注射器中。
10. 以0.8 ml/hr的流速将裂解物通过SPE通道。
11. 以1 ml/hr的流速先用100 μl的70%乙醇洗涤SPE通道，再用100 μl的100%乙醇洗涤。（由于注射器尖端存在50 μl的死体积，无法完全推出液体，因此实际通过通道的液体仅为50 μl。）
12. 将一个空注射器置于0.5 ml刻度位置，以1 ml/hr的流速向通道中推入空气，以干燥通道。
13. 以0.5 ml/hr的流速将67.5 μl无核酸酶水通过通道，以洗脱结合的核酸，并从废液端的nanoport处收集13.5 μl洗脱液。（液体损失是由于注射器尖端和SPE通道中共有54 μl的死体积所致。）

3. 逆转录 PCR

1. 在空气干燥步骤（2.12）期间，使用Qiagen OneStep RT-PCR试剂盒中的试剂配制36.5 μl的RT-PCR预混液。
2. 将RT-PCR试剂加载至废液端口的nanoport中，并与RNA混合，配制成以下50 μl RT-PCR反应体系：13.5 μl无核酸酶水中的洗脱RNA，4 μl RT-PCR酶混合液，10 μl Q溶液，10 μl 1X OneStep缓冲液，2 μl 25 mM MgCl₂，1 μl 50 μM 正向引物 5'-GAC CRA TCC TGT CAC CTC TGA C-3'，1 μl 50 μM 反向引物 5'-AGG GCA TTY TGG ACA AAK CGT CTA-3'，2 μl dNTP，0.75 μl 1.0% w/v BSA，0.73 μl PEG8000，以及5.02 μl无核酸酶水。
3. 通过轻柔抽吸（我们使用壁式真空泵）将RT-PCR混合液加载至RT通道中，并用封闭接头密封Nanoport。
4. 向加热器1施加35 V电压。当加热器1在50 °C达到平衡后，使试剂在RT通道中保持30分钟。当加热器1在95 °C达到平衡后，使试剂在RT通道中再保持15分钟。
5. 向加热器1施加27 V电压，向加热器2施加50 V电压，等待约三分钟，或直至加热器1在60 °C达到平衡且加热器2在95 °C达到平衡。
6. 以0.5 μl/min的流速将试剂推入PCR通道。试剂流经蛇形通道约需20分钟。
7. 当样品到达蛇形通道末端时，使用适当规格的移液器和吸头从出口处收集PCR产物。

4. PCR 产物检测

1. 我们使用安捷伦高灵敏度DNA检测试剂盒检测产物。进行检测前30分钟，从冰箱中取出安捷伦高灵敏度DNA试剂盒。
2. 打开生物分析仪并启动2100 Expert软件。
3. 将1 μl的PCR产物加入检测卡中，并按照安捷伦操作指南（http://gcf.pbrc.edu/docs/Agilent/Agilent%20Manual.pdf）进行操作。
4. 分析并记录数据。

结果

一个典型结果如图所示 图3 用于流感病毒A型感染的鼻咽冲洗样本。由于不同患者的样本中流感病毒含量存在差异，PCR产物的最终浓度也会有所不同。理想结果应表现为背景噪音低，出现两个清晰的阶梯峰（35 bp和10380 bp），阳性样本在预期产物大小（107 bp）处出现单一产物峰。理论上阴性对照不应出现产物峰，但在部分样本中，由于引物二聚体的形成，我们在流感特异性位点附近观察到非特异性PCR峰。多个产物峰可能提示检测过程中存在污染。若出现该情况，应重新取样并使用另一 aliquot 样本进行复检。凝胶电泳可用于进一步验证检测结果。¹³.

讨论

本文介绍的诊断方法展示了集成式微流控塑料芯片能够以高特异性和低检测限从患者样本中扩增甲型流感病毒RNA。¹³ 我们设计该芯片旨在用于潜在的即时检测：（a）简化了温度与流体控制，（b）芯片成本低，适用于通过注塑成型进行高通量制造，（c）芯片为一次性使用，可弃置，从而降低样本交叉污染的风险。

尽管我们目前的芯片运行时间为3小时，但我们的提取平台在流程优化方面仍有很大空间。例如，可在洗脱前通过提高流速和减少洗涤体积相结合的方式，缩短洗涤和干燥时间。此外，通过简化芯片制造工艺，并用一次性注射泵和小型电池组等替代品取代昂贵或笨重的外设（如注射泵和电源），可进一步降低成本。扩大固相萃取柱的几何结构和孔隙率，将显著降低对泵送设备的要求。同时，一旦芯片设计标准化并适用于大规模生产，设备研发过程中使用的许多热电偶也将被取消。

与其他因素相比，芯片上流感检测模块的稳健性更依赖于良好的温度控制和适当的样本处理。芯片上温度轻微偏离设定值，以及流感样本意外经历多次冻融循环，均可能导致最终PCR扩增产量降低。除上述因素外，不同患者样...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1-十二醇	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	443816-500G
2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	196118-50G
2100 生物分析仪	Agilent Technologies, Santa Clara, CA	G2943CA
2-丙醇	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	19516
二苯甲酮	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	239852-50G
BSA	Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA	A7979-50ML
甲基丙烯酸丁酯	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	235865-100 ml
载体RNA	Qiagen, Valencia, CA	1017647
环己醇	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	105899-1L
乙醇	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	E7023
乙烯二甲基丙烯酸酯	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	335861
乙二醇二甲基丙烯酸酯	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	335681-100ML
玻璃注射器 250 μl	Hamilton, Reno, NV	81127
硫氰酸胍	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	50981
高灵敏度DNA检测试剂盒	Agilent Technologies, Santa Clara, CA	5067-4626
热压机	Carver, Wabash, IN	4386
J-B Weld环氧树脂	McMaster-Carr, Elmhurst, IL	7605A11
鲁尔锁式注射器	BD-Medical, Franklin Lakes, NJ	309628
氯化镁	Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA	AB-0359
甲醇	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	494437
甲基丙烯酸甲酯	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	M55909
Nanoport	Upchurch Scientific	N-333-01
Nanoport接头	Upchurch Scientific	F-120x
无核酸酶水	Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA	PR-P1193
OneStep RT-PCR试剂盒	Qiagen, Valencia, CA	210210
PEG8000	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	41009
电源	VWR, Radnor, PA	300V
RNA酶清除剂	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	83931-250ML
RNASecure	Applied Biosystems, Foster City, CA	AM7005
二氧化硅微球	Polysciences, Warrington, PA	24324-15
注射泵	Harvard Apparatus, Holliston, MA	HA2000P/10
导热胶带	McMaster-Carr, Elmhurst, IL	6838A11
热电偶	Omega Engineering, Stamford, CT	5SRTC-TT-J-40-36
薄膜加热器	Minco, Minneapolis, MN	HK5166R529L12A
紫外交联仪	UPV, Upland, CA	CL-1000
Zeonex	Zeon Chemicals, Louisville, KY	690R