人类前列腺上皮细胞形成的使用鼠类泌尿生殖窦间质细胞和人类干细胞的组织重组

Summary

为了解开最早的分子机制启动前列腺癌，新颖创新的人体模型系统和方法是迫切需要的。诱导多能干细胞群形成的人类前列腺上皮细胞的潜力预前列腺泌尿生殖窦间充质（UGSM）是一个强大的实验工具，在前列腺研究。

Abstract

人源性和激素天真的模型系统，这限制了我们的能力，了解相关前列腺疾病引发的遗传和分子事件的可用性，在前列腺癌的研究进展受到严重限制。对发展更好的模型系统研究人类前列腺癌，我们和其他人利用胚胎鼠的前列腺基质亲前列腺独特的感应电势，被称为泌尿生殖窦间充质（UGSM）。当重组的目标，如胚胎干细胞的多能性的细胞群，UGSM睾酮依赖性诱导正常人类前列腺上皮细胞的形成。这种人体模型系统可用于调查和实验测试候选前列腺癌易感基因的能力比较典型的啮齿动物转基因研究加快。由于人类胚胎干细胞（胚胎）可以在全光照培养转基因克诱导基因表达或siRNA击倒向量组织重组之前，这样的模式有利于测试基因功能的后果，或基因组合，这被认为是促进或防止癌变的。

然而，分离纯人群的UGSM细胞，该技术的挑战和学习往往需要与以前的专业知识的人亲自教导。此外，肾包膜下的细胞混合物接种的免疫功能低下的主机可以是技术上的挑战。这里，我们勾勒，说明适当的隔离的UGSM从啮齿动物胚胎组织混合物形成人类前列腺上皮和肾囊的着床。这样的方法，在目前的阶段，需要在体内异种移植的胚胎干细胞，未来的应用程序可能会包括在体外腺形成或使用诱导式多能性干细胞群（iPS细胞）。

Introduction

为更好的人体模型系统对前列腺癌有一个巨大的需要。尤其是，相关的人体模型系统的正常，非恶性前列腺组织可以操纵基因直接辨别特定基因的作用在前列腺癌的启动将是令人难以置信的信息。基因组时代的来临已经确定了许多基因可能在癌症的形成有一定的作用。然而，缺乏人体实验模型系统严重损害我们的能力，功能测试和表征候选前列腺癌易感基因。一个理想的模型系统，将有利于迅速和更迅速的癌症易感基因组合与适当的转基因啮齿动物模型系统的功能分析。此外，这种人体模型系统将使前列腺癌变的信号机制向发现和验证新疗法的分子特征预防前列腺癌的形成。

人胚胎干细胞（人胚胎干细胞）是能够形成作为异种移植的人类前列腺组织。泰勒等人在2006年报道，人类胚胎干细胞可以诱导在体内与啮齿动物的泌尿生殖窦间充质（UGSM）在8-12周的时间段之内重新组合以形成前列腺上皮细胞^。1这些研究是基于以前的工作库尼亚实验室表明，啮齿类动物胚胎UGSM可以促进前列腺分化的干细胞和胚胎在体内的上皮细胞群^。2,3前列腺癌的发展从一个胚胎原基称为泌尿生殖窦（UGS），胚胎17天前（E17鼠标一天E18在大鼠）UGS可以删除，并在物理上分为上皮（UGSE）和间充质^（UGSM）4本组织重组方法已明显使我们进一步了解前列腺的发育和癌变，特别是光年生长因子和激素信号转导途径和前列腺基质和上皮细胞的分子之间的关系^。5-8

Protocol

这项研究进行了严格按照美国国立卫生研究院的实验室动物护理和使用指南的建议。该协议被批准大学芝加哥机构动物护理和使用委员会（IACUC，协议号码72066和72231）。所有的手术麻醉下进行，所有的努力都是为了最大限度地减少痛苦。收购WiCell（麦迪逊，威斯康星州）和培养人类胚胎干细胞系WA01（H1; NIH注册＃0043）使用独立的馈线协议使用mTeSR1媒体（干细胞技术;温哥华，不列颠哥伦比亚省）。胚胎干细胞被用来内10通道解冻。

1。从小鼠或大鼠胚胎的泌尿生殖窦分离

1. 安乐死定时孕鼠（17.5天）或大鼠吸入CO _2（18.5天）5分钟。也证实了在大鼠的生命体征停止死亡。然后打破它的脖子人道。在R在安乐死在这一点上。喷70％乙醇消毒腹部皮肤和侧面。切腹部的皮肤和肌肉层，然后切子宫，分离大鼠胚胎的羊膜囊，剪断脐带。胚胎转移到一个50毫升的Falcon管中含有冰冷的Hank氏平衡盐溶液（HBSS）中，并保持在冰上。胎儿安乐死斩首用手术剪刀。
2. 将胚胎在100毫米的培养皿。平分胚胎用剪刀在肚脐的水平（ 图1A）。取出胃和小肠。显示女性胚胎卵巢和睾丸在男性胚胎（ 图1B和1C）。 （卵巢位于尾侧磁极的肾脏，睾丸是大致水平的膀胱）。在这个发展阶段，UGSM隔离的主机的存在能够诱导前列腺上皮血统的男性和女性胚胎然而，这个发展的....

Results

泰勒等人的精彩的 ​​报告基础上，我们的实验室已研制出一种嫁接协议使用常用的H1（NIH-WA01指定，男性基因）人类胚胎干细胞系^。1这行已经严格测试，质量控制和核型正常的^13，当适当的培养，胚胎干细胞可以保持，扩大，并使用无饲养层培养方法（馈线系统通过干细胞技术市售温哥华BC），冷冻保存在一个未分化和多能状态^。14我们协议采用结合与单细胞悬液E18大鼠UGSM的和成年男性免疫功能低下小鼠肾包膜下注入的人类胚胎干细胞的单细胞悬液。作为重要的控制，USGM植入单独产生没有明显的增长，而没有UGSM形成大的畸胎瘤（ 图2B）人类胚胎干细胞植入。根据我们的经验，植入¹⁵而从未污染大鼠上皮细胞组织生长，结果，同时通报BULLETIN UGSM重组UGSM加上强劲的增长超过80％的时间（8周后的尺寸范围从1毫米到5毫米，超过80％的组织在人类胚胎干细胞的结果含腺上皮）。在重组体同时包含人类胚胎干细胞和UGSM，早期腺形成4周后观察，8周后完全形成，前列腺特异性抗原（PSA）阳性的人前列腺上皮细胞的形成（

Discussion

组织重组使用UGSM是一个非常有用的技术来探讨前列腺，导致前列腺癌症的发生的分子事件的发展。已被用于众多应用在前列腺研究中的感应电势UGSM，其中包括提高肿瘤的前列腺细胞系和肿瘤研究上皮间质的相互作用，并形成跨物种前列腺重组体^。7,17-20适当的准备UGSM然而，实验成功，将导致污染啮齿动物上皮腺腔形成，可以混淆结果是至关重要的。因此，分离的UGSM从UGSE中（步骤2.4）是迄今为止在协议中最关键和最棘手的步骤。为了控制这种污染，大力鼓励使用技术来辨别物种之间，以及一个额外的实验组单独使用UGSM记录没有腺体形成从cellulaŗ污染物。

无饲养层的胚胎干培养试剂和方法的最新发展，允许纯人群胚胎干细胞培养，扩大和冻存^{。21,22 14}此外，扩大使用慢病毒基因传递允许的稳定基因组的成立和利益的基因的表达。这些组合的进步允许纯的胚胎干培养遗传操作，感应电势前列腺胚胎UGSM的结合时，将允许在体内代人前列腺腺体的表达感兴趣的特定基因的。此外，这种技术将可以诱导多能干细胞系（iPS细胞）来自成年主机和从基因改造的细胞

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
汉克s 平衡盐溶液 （HBSS）	GIBCO	14170
DMEM/F12	GIBCO	11330
R1881	Sigma	965-93-5	在乙醇中混合至 1 ug/ml（1,000x 原液）
NEAA	GIBCO	11140
笔-链球菌溶液	GIBCO	15070	100x 原液
Matrigel	BD Biosciences	354230
KETASET（盐酸氯胺酮）	Fort Dodge Animal Health	NDC 0856-2013-01	100 mg/ml;在无菌盐水
AnaSed（甲苯噻嗪）	VET-A-MIX， Inc.	NADA 139-236	20 mg/ml;在无菌盐水中以 1：10 稀释
蛋白酶	BD Biosciences	215240
胶原酶	Sigma	C2014
酮洛芬	Fort Dodge	NDC 0856-4396-01	100 mg/ml;在无菌盐水 Altalube 眼膏中以 1：1,000 稀释
Altaire	Pharmaceuticals， Inc.	NLC 56641-19850
Leica MZ16 F 立体显微镜	Leica		任何好的解剖镜都可以使用。
Vannas弹簧剪刀	精细科学工具	15001-08
注射器	汉密尔顿	84855
汉密尔顿针头，小RN，28号，0.5英寸，点式#3（钝）	密尔顿	7803-02	定制针头
乙醇制备垫	Fisher Scientific	06-669-62
无菌纱布垫	Fisher Scientific	22-415-469
Ethicon Vicryl 缝合线 （4-0 FS-2）	MedVet International	J392H	穿刺式、可溶解缝合线
自动夹 9 毫米伤口夹	Becton Dickenson	427631
PVP 碘制备垫	Fisher Scientific	06-669-98
带钝端的解剖剪刀	Fine Science Tools	14072-10
Dumont 细尖镊子	Fine Science Tools科学工具	11252-50
带剪刀的针架	精细科学工具	12002-14