在压力肌动描记术中，将一段完整的小血管段固定在两个微小套管上，并加压至适宜的管腔压力。本文中，我们描述了测定小鼠第3rd C57和sGCα中肠系膜动脉的排序1-/- 使用压力血管造影法的小鼠。
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摘要
摘要
压力肌动图系统在对小动脉进行功能评估时极为有用，可将血管加压至适宜的跨壁压。压力肌动图所达到的接近生理状态的条件，使得能够深入表征小动脉对药理学和生理学刺激的内在反应，这些反应可外推至 体内 血管床的功能特性。与传统的丝线肌动图仪相比，压力肌动图仪具有多项优势。例如，可在严格控制且符合生理条件的管腔内压力下，对更小的阻力血管进行研究。在此，我们研究了3rd 将肠系膜动脉（3-4 mm长）置于两根连接至加压密封系统的套管上，该系统维持在60 mmHg的恒定压力。肠系膜动脉预先用去氧肾上腺素（phenylephrine）进行收缩处理，随后观察其对乙酰胆碱（acetylcholine）引起的舒张反应。通过视频摄像机持续记录血管的管腔和外径变化，从而实时定量分析去氧肾上腺素引起的血管收缩和乙酰胆碱引起的血管舒张。
为了验证压力肌动图在研究心血管疾病病因学中的适用性，我们采用系统性高血压小鼠模型评估了内皮依赖性血管功能。在129S6（S6）遗传背景下缺乏可溶性鸟苷酸环化酶α1亚基（sGCα1-/-）的小鼠表现为高血压（sGCα1-/-S6），而在C57BL/6（B6）遗传背景下则不表现高血压（sGCα1-/-B6）。通过压力肌动图技术，我们证明sGCα1缺失会导致内皮依赖性血管舒张功能受损。血管功能障碍在sGCα1-/-S6小鼠中比在sGCα1-/-B6小鼠中更为显著，这可能是导致sGCα1-/-S6小鼠血压高于sGCα1-/-B6小鼠的原因之一。
压力肌动描记法是一种相对简单但灵敏且具有重要机制研究价值的技术，可用于评估各种刺激对血管收缩和舒张的影响，从而加深我们对心血管疾病潜在机制的理解。
引言
压力肌动图系统用于测量小动脉、小静脉及其他血管的生理功能与特性。将一段完整的小血管段固定在两根细玻璃插管上，并加压至适当的管腔压力，使血管保持其大部分原有特性 体内 特征（图1 和 2）。压力肌动图中的近生理条件反映了 体内 血管床的行为，从而允许研究其内在特性（例如 离体血管的肌源性张力。与通过直接机械耦合至力传感器来评估肌肉收缩的丝线肌动描记术相比，压力肌动描记术具有若干优势 1包括：(i) 可研究定义血管系统总体阻力的微小阻力血管，而钢丝肌动图仪仅限于较大的传导动脉；(ii) 由于无需将钢丝穿过血管腔，内皮损伤的风险降低；(iii) 血管的自然形态得以更好地维持；(iv) 可在较宽范围的压力或剪切应力下研究血管尺寸 2.
研究微血管可能比研究较大的传导动脉更具信息量，有助于理解高血压等心血管疾病中血管张力改变的病理生理学和分子机制。例如，小鼠喂食高脂饮食8周后内皮功能受损的情况可在2nd肠系膜动脉分支次序 3 但不在主动脉环中图3）。压力肌动图的另一个优点在于，加压血管的内在肌源性收缩得以保留，且可研究内皮细胞在此过程中的作用与功能。本文中，我们描述了使用压力肌动图研究小鼠肠系膜三级动脉血管反应性的方法。rd 在NO-cGMP信号传导受损的情况下，阻力动脉的排序。
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方案
1. 溶液的配制
- 500倍EDTA储备液：称取500 mg EDTA-Na2•2H2O，溶于50 ml去离子水中。室温保存。
- KCl去极化溶液。
- 配制K10X储备液：3.69 g NaCl、18.64 g KCl、0.36 g无水MgSO4、0.41 g KH2PO4、0.46 g CaCl2•2H2O，溶于250 ml去离子水中。室温保存。
- 配制100 ml终浓度为1X的KCl去极化溶液：将0.21 g NaHCO3和0.18 g葡萄糖溶于90 ml去离子水中，加入10 ml K10X储备液，再加入95 μl 500X EDTA溶液，充分混匀。4 °C保存，一周内使用完毕。
- 实验当天新鲜配制HEPES-PSS溶液（配制1升）。
- 6.96 g NaCl、0.35 g KCl、0.288 g MgSO4•7H2O、0.1605 g KH2PO4、2.38 g HEPES，溶于100 ml去离子水中，标记为A瓶。
- 0.312 g CaCl2•2H2O，溶于100 ml去离子水中，标记为B瓶。
- 1.25 g NaHCO3、0.991 g葡萄糖，溶于98 ml去离子水中，标记为C瓶。
- 向C瓶中加入2 ml 500X EDTA溶液。取一个大烧杯，加入700 ml去离子水，将A、B、C三瓶溶液在持续涡旋混匀的条件下依次倒入大烧杯中，用NaOH调节pH至7.4。
2. 使用的药物
- 去甲肾上腺素（10-2 M）：将 20.37 mg 溶于 10 ml 去离子水中。分装 1 ml，于 -80 °C 保存。实验当天进行系列稀释，获得 10-3、10-4、10-5 和 10-6 mol/L 的溶液。
- 乙酰胆碱（10-2 M）：将 18.17 mg 溶于 10 ml 去离子水中。分装 1 ml，于 -80 °C 保存。实验当天进行系列稀释，获得 10-3、10-4、10-5 和 10-6 mol/L 的溶液。
3. 小鼠
在整个研究过程中，使用了S6和B6背景的雄性野生型（WT）和sGCα1-/-小鼠。sGCα1-/-小鼠的制备方法如前所述4,5。涉及实验动物（小鼠）的饲养和操作程序均经马萨诸塞州波士顿麻省总医院实验动物护理委员会批准。
4. 肠系膜动脉血管反应性的测量
- 使用戊巴比妥（200 mg/kg，腹腔注射）处死小鼠。打开腹腔，分离肠系膜组织。分离并取出一段直径约3 mm的肠系膜动脉rd 去除结缔组织和脂肪组织后，将动脉置于预先用95% O₂平衡的冰冻HEPES-PSS溶液中2 / 5% CO₂2 孵育15分钟。从肠系膜动脉上切取2-3 mm长、无分支的血管环。当血管内无血液时，在微血管水平区分动脉与静脉较为困难。因此，我们建议在将血管从动物体内解剖分离之前，先在其仍完整存在于动物体内时进行辨认。
- 在压力肌动图仪腔室（DMT Model 110P）中填充玻璃套管&11P 版本 1.31， 图2使用10 ml注射器通过进液阀和出液阀，用HEPES-PSS溶液灌注导管。灌注过程应轻柔谨慎，避免施加过大的压力，以防损坏与导管相连的脆弱传感器。导管灌注完成后，应紧密关闭进液阀和出液阀。
- 将血管一端套在右侧套管上，并用一根细尼龙缝线小心扎紧。借助注射器，通过入口阀用HEPES溶液冲洗并灌注血管。将左侧套管移近血管，将血管另一端套上并用尼龙缝线扎紧。向腔室中加入最多10 ml的HEPES溶液。使用注射器通过入口阀轻轻推动HEPES溶液，检查是否有泄漏。
- 将腔室安装到肌动描记仪上并置于视频显微镜下。启动腔室的供氧和加热（37 °C）。将进液阀通过管道P1连接至第一份HEPES溶液储液罐，此时保持阀门关闭。让液体和气泡流经管道，直至管道内无气泡残留。打开阀门。
- 将腔室的左侧阀门与来自压力调节器的P2管连接。再次检查是否存在气泡。整个系统中不应有任何气泡或泄漏。
- 进入 myo-interface 面板或软件中的压力菜单，开启泵并关闭流量。
- 打开程序并点击 COLLECT。此时容器应出现在屏幕上（图3通过显微镜上配备的相机观察血管，可实现对血管管腔、血管直径及血管壁厚度的监测与分析。
- 通过在肌张力界面面板或程序中选择 P1 压力，逐步调节 P1 阀以升高管腔内压力，并按如下顺序输入压力值：5 mmHg → 10 → 20 → 40 → 60 mmHg。在压力升高过程中，血管有时会出现扭曲或弯曲；此时应借助垂直或纵向微调定位器，相应调整张力或应变图2）。将血管在60 mmHg和37 °C条件下平衡至少45分钟。平衡期间，用预热的HEPES溶液更换一次浴槽液。
- 加入10 ml预热至37 °C的KCl去极化溶液至浴槽中，以充分去极化平滑肌细胞并达到最大收缩。在收缩稳定后，每隔10分钟用HEPES溶液冲洗浴槽3次。
- 通过去氧肾上腺素（10 μM）加入后产生稳定且可重复的反应，检测血管的活性及内皮完整性。-5 M）和乙酰胆碱（10-5 M）。每10分钟用HEPES溶液冲洗3次。
- 加入去氧肾上腺素（10-5 M）使血管预收缩，当获得稳定的收缩状态后，通过依次递增浓度地加入乙酰胆碱（10-9，3 × 10-9, 10-8，3 × 10-8, 10-7，3 × 10-7, 10-6，3 × 10-6，以及10-5 M）。末次给药后，每隔10分钟用HEPES溶液冲洗3次，然后开始新的CRC实验。
- 通过施加 Ca 确定被动管腔直径2+含2 mM EGTA的无钙PSS。根据记录的曲线，测量每个剂量反应的管腔直径图4），用于计算所有参数。
- 将乙酰胆碱舒张反应表示为与去钙状态下的管腔直径和去甲肾上腺素收缩后的直径之差相比，去甲肾上腺素预收缩后管腔直径变化的百分比，计算公式如下：
- 百分比扩张 = 100% × [(Dx - Di)/(D无钙 - Di)]，其中 D 为测得的管腔直径，x、i 和 Ca-free 分别表示在激动剂各剂量（x）下、去氧肾上腺素收缩后的初始直径（i）以及无钙条件下动脉的直径2+无钙缓冲液（Ca-free）。
5. 统计学分析
所有连续性测量数据均以均值 ± 标准误（SEM）表示。肠系膜动脉的血管反应性采用重复测量双因素方差分析（two-way ANOVA）进行分析。在所有情况下，P < 0.05 被认为具有统计学显著性。
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结果
一氧化氮（NO）在人体血压稳态的维持中起着核心作用 6 在动物模型中 7一氧化氮（NO）调控血管平滑肌松弛的能力由可溶性鸟苷酸环化酶（sGC）介导，sGC 是一种含血红素的异源二聚体酶，可生成 cGMP 8. 近期，在包含 sGCα 的基因座中发现了一种可调节血压的遗传变异1 和 sGCβ1 基因，阐明了sGC在调节人类血压中的相关性 9有趣的是，缺乏α的雄性小鼠1 sGC 的亚基（sGCα）1-/-) 在 129S6 (S6) 背景下具有高血压表型（sGCα1-/-S6) 5 但不在C57BL/6（B6）背景下时1-/-B6) 4我们采用压力肌动图技术研究了从野生型（WT）和sGCα基因敲除小鼠分离出的肠系膜阻力动脉对乙酰胆碱诱导的血管舒张反应。1-/- S6和B6背...
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讨论
小鼠是许多研究者首选的实验模型，部分原因在于可以对其进行遗传修饰，从而构建人类病理生理学的小鼠模型。小阻力血管（而非较大的传导血管）的血管活性状态在很大程度上决定了整个血管系统中血流的调节11。由于小动物（如小鼠）的阻力动脉尺寸较小，无法使用导丝肌动图仪来研究微血管功能。压力肌动图仪不仅克服了这一限制，还可实现接近生理条件下的血管功能测定。
我们先前报道过，缺乏 sGCα 的雄性小鼠1 在129S6（S6）背景下具有高血压（sGCα1-/-S6) 5 但在C57BL/6（B6）背景下则不出现（sGCα1-/-B6) 4我们假设，这种品系间血压的差异是由于sGCα之间血管反应性的不同所致1-/- B6和S6背景小鼠。利用压力肌动图，我们研究了3种内皮依赖性血管舒张反应rd 肠系膜动脉。乙酰胆碱是一种毒蕈碱受体激动剂，可结合内皮细胞上的受体，通过...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢 Paul Huang 和 Dmitriy Atochin 博士提供 DMT 压力气动显微镜的使用，以及 Binglan Yu 和 Chong Lei 博士提供喂食高脂饮食或标准饮食的小鼠。
资金来源
本研究得到了美国心脏协会的科学家发展资助（10SDG2610313，授予 E. S. Buys）以及哈佛医学院 Eleanor 和 Miles Shore 医学学者50周年奖学金项目（授予 E. S. Buys）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| NaCl | 费舍尔科技 | BP358 | |
| CaCl2 (2H2O) | 费舍尔科技 | C79-500 | |
| KCl | 西格玛 | P9333 | |
| MgSO4 | 费舍尔科技 | M65-500 | |
| KH2PO4 | 西格玛 | P3786 | |
| NaHCO3 | 费舍尔科技 | BP328 | |
| NaOH | 费舍尔科技 | S318 | |
| D-葡萄糖 | 西格玛 | G8270 | |
| EDTA | 费舍尔科技 | BP121 | |
| HEPES | 西格玛 | H3375 | |
| 去氧肾上腺素 | 艾克罗斯有机 | AC20724 | |
| 乙酰胆碱 | 西格玛 | A6625 | |
| 压力肌动图系统 | DMT |
参考文献
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