一种用于清醒小鼠肾小球滤过率高通量测定的方法

摘要

肾小球滤过率（GFR）的测定是评估肾功能的金标准。本文介绍一种高通量方法，通过单次团注荧光素异硫氰酸酯标记的菊粉（FITC-菊粉），在清醒小鼠中采集血浆样本测定FITC-菊粉浓度，并利用双相指数衰减模型计算GFR。

摘要

肾小球滤过率（GFR）的测定是评估肾功能的金标准。目前，研究人员通过检测内源性生物标志物肌酐的水平，或外源性施用的放射性标记菊粉（inulin）来确定GFR。³H 或 ¹⁴C）。肌酐的一个显著缺点是，近端小管分泌作用约占肾脏总肌酐排泄量的50%，因此肌酐并非可靠的肾小球滤过率（GFR）标志物。根据实验设计的不同，菊粉清除率可通过静脉单次推注或持续输注（静脉输注或渗透压微型泵）来测定。这两种方法分别需要采集血浆或同时采集血浆和尿液样本。放射性标记菊粉的其他缺点包括需使用同位素、动物手术准备耗时较长，以及必须进行终末性实验。本文介绍一种方法，采用单次静脉推注荧光素异硫氰酸酯（FITC）标记的菊粉，并通过检测稀释后血浆中1–2 μl样品的荧光强度来测定其浓度。结合双室模型，每只小鼠采集8次血液样本，利用特定的工作流程，每天可完成最多24只小鼠的GFR测定。该方法仅需短暂的异氟烷麻醉，所有血样均在小鼠无束缚且清醒状态下采集。另一优势在于，可在数月时间内对同一批小鼠进行纵向追踪，观察不同时间点或干预处理后的变化（即 进行配对实验时结合饮食改变或药物干预）。我们希望这种测量GFR的技术能为其他研究小鼠肾功能的研究人员所用，并取代以往估算肾功能的准确性较低的方法，如血浆肌酐和血尿素氮检测。

引言

肾小球处血浆超滤液的生成速率已成为评估肾功能（肾小球滤过率，GFR）的基础。理想的GFR标志物应能自由滤过，既不被分泌也不被重吸收，且不发生代谢。菊粉（inulin）的特性符合上述要求，因此菊粉清除率已成为测定GFR的金标准³。尽管肌酐清除率被广泛用于人和动物GFR的评估，但肌酐并不完全满足理想GFR标志物的要求。在人体中，约10–40%的肌酐清除率来源于肾小管的主动分泌^{1, 11}，且小鼠和大鼠中肌酐的肾分泌也较为显著^{4, 7, 9, 22}。已知肾功能障碍会增强肌酐的肾小管分泌，从而限制其作为GFR标志物的准确性^{1, 2}。我们先前已证实，有机阴离子转运体亚型3（OAT3）参与小鼠肾脏中肌酐的分泌过程²²。然而，菊粉清除率通常需使用放射性标记的菊粉（³H或¹⁴C）。放射性标记菊粉的测定既可用于麻醉状态也可用于清醒小鼠，但存在与放射性同位素使用相关的诸多安全规定和严格操作要求等缺点。此外，用于测定GFR的外科清除实验准备过程耗时，且本质上属于终末性实验。1999年，Lorenz et al. ¹²首次引入荧光素标记菊粉（FITC-inulin）作为麻醉小鼠单个肾单位GFR的标志物。五年后，Qi et al. ¹⁵利用FITC-inulin测定了清醒小鼠的全肾GFR。目前已有多种替代性方案采用FITC-inulin作为外源性标志物，用于测定清醒或麻醉小鼠的GFR。这些方案通过荧光检测保留了放射性菊粉的灵敏度，同时避免了使用放射性标记物所带来的不利因素。FITC-inulin检测法已被其他研究者^{7, 8}以及我们团队^{22, 23}进一步优化，以充分利用NanoDrop 3300荧光分光光度计的微体积检测能力。该改进使得每次GFR测定所需的总样本体积可减少至<100 μl血液。

通过本出版物提供的方法和高通量实验方案，我们证明了每天可对多达24只清醒小鼠进行肾小球滤过率（GFR）测定的可行性。该技术可能对其他研究小鼠GFR的研究人员具有参考价值，我们希望其能够取代肌酐和血尿素氮等准确性较低的指标，成为评估肾功能的新方法。

方案

1. 溶液

1. 0.85% NaCl：将 8.5 g NaCl 溶于 1 L ddH₂O 中（8.5 g/L）。
2. 0.5 mol/L HEPES，pH 7.4（将 59.6 g HEPES 溶于 0.5 L ddH₂O 中，用 10 N NaOH 调节 pH 至 7.4）。

2. FITC-菊粉注射液的制备

1. 称取FITC-菊粉配制5%溶液，溶于0.85% NaCl中（通常为100 mg/2 ml 0.85% NaCl），加热至90 °C直至完全溶解。
2. 称量溶解的FITC-菊粉溶液并记录重量。
3. 剪取一段20 cm长的透析膜（分子量截留值：1,000），放入ddH₂O中₂O 培养 30 分钟以去除残留的 NaN₃ 从膜上洗脱，并在之后冲洗数次。
4. 将溶解的FITC-菊粉注入透析膜中，并使用夹子妥善封口。
5. 称量整个透析膜。
6. 将透析膜置于1 L 0.85% NaCl溶液中，室温下避光缓慢搅拌24小时。
7. 再次称量整个透析膜，并计算新的浓度（水会通过渗透作用进入膜内，未结合的FITC或结合的FITC-菊粉） <分子量为1,000的物质将从膜中移出；因此，FITC-菊粉的浓度将显著降低。
8. 新的FITC-菊粉浓度（c）通过以下公式计算：c = n/V，其中n = 初始FITC-菊粉量，V = 新体积（透析前后透析管重量之差） 加 初始FITC-菊粉溶液的体积）。
9. 使用前，将透析后的FITC-标记菊粉溶液通过0.22 μm针头滤器过滤灭菌。
10. 将FITC-菊粉置于4 °C避光保存（用铝箔包裹）。透析并灭菌后的FITC-菊粉可保存使用不超过2周。若出现沉淀，可通过90 °C加热数分钟重新溶解。

注意：如果使用无需透析的 FITC-sinistrin ^16-18，则可跳过所有与透析相关的步骤。

3. 注射与采血

1. 实验前测量小鼠的体重（bw）。
2. 用异氟烷短暂麻醉小鼠。
3. 若需同时处理6只小鼠以实现高通量，请遵循图3中提供的操作流程。
4. 使用G30 ½英寸针头，向眶后静脉丛注射每克体重2 μl的透析FITC-菊粉²⁴（先用G26 ½英寸针头排出100 μl Hamilton注射器中的气泡，然后换用G30 ½英寸针头进行注射）。
5. 用剪刀一次性剪取约1 mm的小鼠尾尖，在注射后3、5、7、10、15、35、56和75分钟时采集血液至含钠-肝素的微量毛细管中。采血后立即用Châ-seal封口剂封闭毛细管。
6. 将样品避光保存。
7. 将已封口的微量毛细管插入血细胞比容毛细管中，离心5分钟。
8. 使用金刚石切割器将微量毛细管折断，用移液器吸取全部血浆转移至0.2 ml离心管中。
9. 在新的0.2 ml离心管中，取2 μl血浆与18 μl 0.5 mol/L HEPES缓冲液（pH 7.4）混合，制成1:10稀释液（样品可在4 °C避光保存过夜，用于后续荧光检测）。
10. 使用NanoDrop 3300仪器，对稀释后的样品取2 μl进行双份检测。该仪器的说明与操作方法详见文献⁵。

4. 标准品的制备

1. 从相同背景品系的小鼠中采集血液至肝素包被的血细胞比容毛细管中，离心后用0.5 mol/L HEPES（pH 7.4）按1:10比例稀释；通常为80 μl血浆加720 μl HEPES。
2. 用稀释的小鼠血浆将FITC-标记的菊粉注射液稀释，得到以下标准稀释浓度：
   1:10：10 μl 未稀释的 FITC-菊粉溶液 + 90 μl 稀释小鼠血浆
   1:100：10 μl (1:10) 溶液 + 90 μl 稀释小鼠血浆
   1:1,000：10 μl（1:100）溶液 + 90 μl 稀释的小鼠血浆
   1:2,000：30 μl (1:1) 溶液 + 30 μl 稀释的小鼠血浆
   1:10,000：10 μl (1:5) 溶液 + 40 μl 稀释的小鼠血浆
   1:20,000：20 μl（1:1）溶液 + 20 μl 稀释的小鼠血浆
   1:100,000：10 μl (1:5) 溶液 + 40 μl 稀释的小鼠血浆
   标准品的浓度取决于透析情况，每次制备FITC-葡聚糖时其浓度都会有所不同。每次必须重新输入标准曲线的标准品浓度。
3. 使用适当的软件分析数据以计算肾小球滤过率（GFR）例如 GraphPad Prism）使用此处所述的双相指数衰减函数 ^{15, 20} 并如图所示 代表性结果 部分。

结果

肾小球滤过率将使用以下公式进行计算：

GFR = n/(A/K1 + B/K2)，其中

n = 注射量（n = c•V，其中 c = FITC-菊粉浓度，V = 注射体积）
A = 分布相截距（Span1）
K1 = 消除相衰变常数
B = 消除相截距（Span2）
K2 = 分布相衰变常数

注意：A、K1、B 和 K2 是 GraphPad Prism 软件给出的缩写，任何能够分析双相指数衰减的软件均可使用，但其他科学软件可能会使用不同的缩写。

通过采用基于血浆FITC-菊粉浓度的双相指数衰减曲线拟合，应获得一条与图1所示相似的曲线。利用上述公式（如文献²⁰所述）计算肾小球滤过率（GFR），可检测到肾功能损害¹⁵或肾小球高滤过状态^{8, 23}，后者见于1型糖尿病小鼠模型（图2）。

图 1. 通过单次静脉注射后FITC-菊粉的血浆动力学来测定清醒小鼠的肾小球滤过率（GFR）。 在计算GFR时，采用双室模型。在双室模型中，初始的快速衰减阶段代表FITC-菊粉从血管内腔室向细胞外液的重新分布；而后期较慢的衰减阶段则主要反映FITC-菊粉从血浆中的系统性清除。

图 2. 在野生型小鼠中检测糖尿病性高滤过状态。 通过腹腔注射链脲佐菌素（STZ，50 mg/kg，连续5天）诱导1型糖尿病。在糖尿病诱导前（基础状态）及诱导后5周测定肾小球滤过率（GFR）。由于肾小管-肾小球反馈机制，近端重吸收的初始增加可导致早期糖尿病性高滤过²¹，该现象在野生型小鼠中可重复出现（n=10，p<0.01，与同一只小鼠的基础状态相比）。

图3. 在6只小鼠中测量肾小球滤过率（GFR）的流程图。 采用单次团注法测定全肾GFR时，需在注射FITC-菊粉后3、5、7、10、15、35、56和75分钟采集8个血液样本。数字表示采血时间点，括号内的数字表示样本编号。垂直红线左侧的时间点表示注射时间点（分别为0、11、22、33、44和55分钟）。每只小鼠用不同颜色标记。按箭头指示顺序进行连续血液采集。灰色方框表示需在注射前用异氟烷麻醉准备下一只小鼠的时间点。采用本方案时，从不同小鼠采集两次血液样本之间的最短间隔时间为1分钟。

讨论

本研究描述了一种通过单次团注法注射示踪剂，并采集8份血液样本利用双相指数衰减模型分析荧光信号，从而在清醒小鼠中测定肾小球滤过率（GFR）的技术。对1只小鼠进行一次GFR测定需耗时75分钟。通过使用特定的流程图，可在130分钟内完成6只小鼠的GFR测定。该流程图方案每天最多可重复4次，从而实现对24只小鼠的GFR测量。我们对该方法进行了改进，使采血方式可采用尾尖小切口取血，而非尾静脉穿刺，操作更为快速简便。通过使用10 μl血细胞比容毛细管并进行1:10稀释，可将所需总血量减少至<100 μl。最后，采用NanoDrop 3300荧光分光光度计测定荧光强度，仅需1–2 μl稀释后的样本即可完成检测。该方法可为研究者提供真实的GFR数值。相比之下，小鼠中肌酐测定存在多个局限性，包括“肌酐盲区”以及在特异性和灵敏度方面的检测困难。“肌酐盲区”限制了其作为GFR标志物的功能，因为血清肌酐水平在肾功能丧失达50%之前仍可维持在正常范围内¹⁹。由于许多研究者在肾脏生理学与病理生理学研究中使用基因修饰小鼠，这带来如下问题：假设某基因X的敲除小鼠相较于野生型小鼠GFR显著降低（达40%），仅通过血浆肌酐水平进行简单筛查将无法检出该差异。当GFR差异越小时，对一种准确可靠的GFR测定方法的需求就越发迫切。

小鼠血浆和尿液中含有高浓度的非肌酐色原物质，这些物质会干扰市售的肌酐检测方法。因此，基于碱性苦味酸Jaffé反应的检测方法与高效液相色谱法（HPLC）测定结果相比，会高估血浆中的肌酐浓度^{6, 13}。另一个局限性是，与HPLC测定相比，多种市售检测方法对血清肌酐的检测限以下水平无法检出。然而，研究人员通过使用酶法反应成功测定了小鼠血浆中的肌酐含量^{10, 22}。

使用类似的单次团注方法以及尿液中FITC-菊粉清除率，在清醒小鼠中也检测到了相似范围的肾小球滤过率（GFR）¹⁴。与他们的方案相比，我们采用尾尖采血的方案无需像尾静脉或隐静脉穿刺那样采取特殊措施来维持血管完整性。对于基于尿液/血浆的FITC-菊粉清除率测定，需要手术植入两个渗透压微型泵。必须使用两个泵才能达到足够高的稳态血浆FITC-菊粉浓度，使其明显区别于背景信号。该方法还需要使用代谢笼进行完整且定时的尿液收集。代谢笼需要冲洗，以弥补不冲洗时会发生的25–37%的FITC-菊粉损失。

使用本FITC-菊粉方法的局限性较少。研究人员应注意以下几点：（i）确保用于注射FITC溶液的注射器中无气泡；（ii）必须完成完整的眶后静脉注射，因为注射量直接影响计算所得的肾小球滤过率（GFR）；（iii）小鼠在75分钟GFR实验过程中极有可能排尿，因此应避免尿液污染血液样本，否则由于肾脏的浓缩能力，尿液中FITC-菊粉浓度极高，将干扰检测结果。

该FITC-菊粉方法的主要优点包括：（i）非放射性技术；（ii）可在同一只小鼠中多次重复测量；（iii）可在清醒小鼠中进行检测；（iv）无需收集尿液；（v）可采用高通量检测方案。单次推注给药方式的缺点在于需要对FITC-菊粉进行透析，但该问题可通过使用更优的FITC标记物——FITC-肾胺素（FITC-sinistrin）来克服，后者目前已可获得，并可通过特制的微型化设备经皮检测¹⁸。尽管该方法可用于测量肾小球滤过率（GFR），但无法利用此方法测定液体或离子的分数排泄率。

综上所述，该方法为在清醒小鼠中高通量测定肾小球滤过率（GFR）提供了可行性。因此，该技术可能对其他希望评估小鼠肾功能的研究人员具有参考价值。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653
FITC-菊粉	Sigma-Aldrich	F3272
HEPES	Sigma-Aldrich	H7706
异氟烷	Webster Veterinary	78366551
透析膜（截留分子量 1000）	Spectrum Laboratories	132636
膜封口器	Spectrum Laboratories	132736
80 μl 血细胞比容毛细管	Drummond Scientific	22362566
血细胞比容离心机	IEC	Micro-MB
10 μl Na+-肝素微型管	Hirschmann	9000210
注射器（100 μl）	Hamilton	80601
荧光分光光度计	Thermo-Fisher Scientific	NanoDrop 3300
滤器（0.22 μm）	Spectrum Laboratories	880-26464-UE
密封剂	Châ-seal	510
针头（G26 ½ 和 G30 ½）	Becton Dickinson	305111 & 305106