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方法文章

人类皮肤活检样本中伤害性表皮内神经纤维的三维成像

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DOI：

10.3791/50331

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2013年4月29日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology, University of Michigan , 2Department of Internal Medicine, University of Michigan

本文内容

摘要

为了研究疼痛性神经病变（PN）中伤害性表皮内神经纤维（IENFs）的变化，我们建立了可直接观察伤害性IENFs三维形态变化的实验方案。对IENFs进行三维分析，有望评估PN中IENF的形态学改变。

摘要

皮肤 punch 活检常用于量化表皮内神经纤维密度（IENFD），以诊断周围性多发性神经病1,2。目前，通常从远端小腿（DL）和近端大腿（PT）采集 3 mm 的皮肤活检样本，用于评估长度依赖性多发性神经病3。然而，由于表皮内神经纤维（IENF）具有多向分布的特点，通过二维（2D）成像分析难以清晰观察重叠的神经结构。相比之下，三维（3D）成像可能为解决这一难题提供更优方案。

在本报告中，我们介绍了应用三维成像技术研究疼痛性神经病变（PN）的方法。为了识别表皮内神经纤维（IENF），皮肤样本经过免疫荧光染色，以检测蛋白基因产物9.5（PGP），后者是一种泛神经元标记物。目前，诊断小纤维神经病变的标准方法是通过明场显微镜下PGP免疫组织化学染色来测定IENF密度（IENFD）4。在本研究中，我们采用双重免疫荧光分析方法，利用PGP标记总IENF密度，并结合识别神经营养素受体酪氨酸激酶A（Trk A）的抗体来识别伤害性感受IENF，Trk A是神经生长因子的高亲和力受体5。通过PGP与Trk A抗体共染色，可特异性清晰地标记出PGP阳性且具有伤害感受功能的神经纤维，从而有利于PN的研究。这些荧光信号可被定量分析，以评估与PN相关的伤害性IENF密度及其形态学变化。荧光图像通过共聚焦显微镜采集，并进行三维分析处理。三维成像技术提供了多角度旋转观察的能力，有助于进一步分析与PN相关的形态学改变。综上所述，免疫荧光共染色、共聚焦成像与三维分析技术的结合，显著提升了对疼痛性神经病变的研究能力。

引言

目前，临床医生通常通过皮肤钻孔活检来定量表皮内神经纤维密度（IENFD），以诊断小纤维神经病变3, 6-8。活检取材部位为远端腿部（DL），即外踝上方10 cm处，以及近端大腿（PT），即前髂嵴下方20 cm处9。所有IENF均使用蛋白基因产物9.5（PGP）进行标记，PGP是一种泛神经元标记物10-12。目前，标准的诊断方法是通过明场显微镜下PGP染色测定IENFD来诊断小纤维神经病变6。此外，多个研究团队已采用免疫荧光法进行PGP免疫组织化学染色7-9。小纤维神经病变常与神经性疼痛相关。为了进一步理解在疼痛处理中起关键作用的IENF的功能，我们开发了一种共标记技术，可同时标记全部IENF和参与疼痛生成的神经纤维。伤害性感受IENF，特别是Aδ和C纤维，可通过共标记IENF（使用PGP）与伤害性感受标记物——原肌球蛋白受体激酶A（Trk A）进行研究5。Trk A是神经生长因子的高亲和力受体，在伤害性感受的发育过程中起关键作用。Trk A阳性的伤害性感受神经纤维属于肽能纤维，表达P物质（SP）和降钙素基因相关肽（CGRP）。此前，Lauria及其同事曾应用双标技术研究周围神经病变（PN），将PGP阳性的IENF与伤害性感受标记物共标记10。在我们之前的研究中，我们证明在疼痛性糖尿病神经病变的动物模型中，Trk A阳性的IENF表达上调，而Trk A阴性的IENF则无此变化5。该共标记技术使得研究人员能够比较伤害性感受IENFD与总IENFD的定量结果，并研究与PN相关的形态学改变。可视化伤害性感受IENF，并比较总IENFD与伤害性感受IENFD的定量数据，可能为疼痛的存在提供客观证据，并有助于了解PN相关疼痛的严重程度。该技术同样适用于动物模型的皮肤组织。与以往研究相比，本方案描述了三维图像分析的方法，从而避免二维图像分析中可能出现的误差。

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方案

A 部分：免疫组织化学

96孔板的制备及背景染色的防止：从人体受试者获取 punch 皮肤活检样本，并按照先前所述方法在固定液（含2%多聚甲醛、0.75 M L-赖氨酸溶液（pH 7.4）和0.05 mM 过碘酸钠）中于4 °C孵育12–24小时8。随后将样本在含20%甘油的磷酸盐缓冲液（PBS）中于4 °C进行冷冻保护，最长可保存1周；接着将组织包埋于最佳切割温度（OCT）包埋介质中，并在恒冷切片机上切成50 μm厚的切片。以下所述方案适用于8个皮肤切片，即在一个96孔板中进行漂浮式免疫组织化学染色所能容纳的最大切片数量。

第1天：

1. 角质层中非特异性免疫反应的预防

  1. 按照图1所示标记96孔板。
  2. 向96孔板第1行的每个孔中加入150 μl Image-IT FX Signal（Image-IT），以有效阻断背景染色11,12。
  3. 向96孔板第2行和第3行的每个孔中加入150 μl 1X PBS。
  4. 每位患者获取两个50 μm厚的切片：一个来自DL处取得的活检组织，另一个来自PT处取得的活检组织。使用接种环（LeLoop）将切片从一个洗涤步骤转移至下一个步骤，以避免形态学损伤。用接种环轻柔地将每个50 μm切片转移至第1行含有Image-IT的单独孔中。将切片在Image-IT中于室温条件下在水平摇床上孵育30分钟。
  5. 用1X PBS（第2行和第3行）在室温下清洗切片两次，每次10分钟。每次清洗之间将孔板置于水平摇床上。

2. 5% BSA 封闭液和 1% 洗涤液的制备

  1. 当活检切片在 Image-IT 中孵育时，配制 5% 封闭液（5% BSA、0.3% TX-100、0.1 M PBS），涡旋振荡至 BSA 完全溶解。
  2. 向第 4 行的每个孔中加入 150 μl 的 5% BSA 封闭液。
  3. 使用接种环将切片分别转移至含有 5% BSA 封闭液的孔中，在室温下于水平摇床上孵育 1–2 小时。

3. 1% BSA 洗涤溶液的配制与一抗的稀释

  1. 当切片在5% BSA封闭液中孵育时，配制1%漂洗液（1% BSA、0.3% TX-100、0.1 M PBS），涡旋振荡至BSA完全溶解。
  2. 当切片在5% BSA封闭液中孵育时，用1%漂洗液稀释一抗。
    1. 对于八个切片（8 × 150 μl = 1,200 μl），共需1,200 μl。一抗溶液配制总量为1,500 μl（约多出20%体积）。
    2. 一抗稀释比例：PGP为1:500，Trk A为1:500，均用1% BSA漂洗液稀释。

4. 组织切片与一抗孵育

  1. 向96孔板的指定孔中（第5行）加入150 μl稀释的一抗溶液。
  2. 将组织切片从5%封闭液（第4行）转移至指定的一抗孔（第5行）中。
  3. 用封口膜和铝箔密封96孔板，防止干燥和光照。
  4. 将96孔板置于平摇床上，4 °C过夜孵育。

第2天：

5. 用1% BSA漂洗液漂洗活检组织

  1. 向第6、7、8行的每个孔中加入150 μl的1% BSA洗涤液。
  2. 用1% BSA洗涤液（第6、7、8行）洗涤切片，每次1小时，共洗涤三次，室温进行。每次洗涤之间用铝箔覆盖培养板，并置于水平摇床上。

6. 二抗的稀释

  1. 当切片在最后一次1% BSA洗涤液（第8行）中孵育时，用1% BSA洗涤液稀释二抗：
    1. 对于八个切片（8 × 150 μl = 1,200 μl），共需1,200 μl。二抗配制体积为1,500 μl（约多出20%）。
    2. 二抗稀释比例：PGP使用Alexa Fluor 488驴抗兔抗体（1:250），Trk A使用Alexa Fluor 647驴抗山羊抗体（1:250），均用1% BSA洗涤液稀释。

7. 组织切片与二抗孵育

  1. 将150 μl稀释后的二抗加入96孔板指定的孔中（第9行）。
  2. 将组织切片从1% BSA封闭液（第8行）转移至二抗孔（第9行）。
  3. 用封口膜和铝箔密封96孔板，防止干燥和光照。
  4. 将组织切片在4 °C平板摇床上与指定的二抗避光孵育过夜（O/N）。

8. 用 1% BSA 洗涤液洗涤组织活检样本

  1. 向第10、11和12行的每个孔中加入150 μl 1% BSA洗涤液。
  2. 用1% BSA洗涤液（第10、11和12行）洗涤切片三次，每次1小时，室温进行。每次洗涤之间用铝箔覆盖培养板，并将其置于水平摇床上。

9. 显微镜载玻片的制备与切片活检组织的封片

  1. 当活检切片在第12行的1% BSA漂洗液中进行最后一次漂洗孵育时，准备显微镜载玻片。
  2. 每次在一张载玻片上放置50 μl的1% BSA漂洗液。
  3. 将切片从第12行的1% BSA漂洗液中取出，放入指定显微镜载玻片上的50 μl 1% BSA漂洗液液滴中。调整切片位置至最佳后，用带橡胶头的玻璃移液管小心吸除多余的1% BSA漂洗液，注意避免触碰样本。

注意：确保切片没有折叠；样本应平整地贴附在显微镜载玻片的表面。

  1. 在载玻片上的组织活检样本附近滴加一滴含DAPI的Prolong Gold抗荧光淬灭封片剂。取一块22×22 mm的显微镜盖玻片，轻轻覆盖在活检组织及含DAPI的Prolong Gold抗荧光淬灭封片剂液滴上。每张切片均重复此步骤。
  2. 将载玻片置于室温避光条件下过夜干燥。

注意：使用移液枪头去除气泡。擦去多余的Prolong Gold抗荧光淬灭试剂。

B 部分：共聚焦成像

10. 共聚焦成像

  1. 使用 Olympus FluoView 500 激光扫描共聚焦显微镜，配备 40 倍油镜（1.3 NA）物镜，放大两倍，并通过 FluoView 5.0 软件采集荧光信号图像。
  2. 分别使用 Alexa Fluor 488 和 Alexa Fluor 647 激发 543 nm HeNe 绿色激光和 633 nm HeNe 红色激光。Alexa Fluor 488 信号采用绿色查找表（LUT）显示，Alexa Fluor 647 信号采用红色 LUT 显示。
  3. 将每个检测器的共聚焦针孔设置为 400 μm 以增强信号。应以 1,024 × 1,024 的分辨率进行连续扫描，以最大化信号分离效果。
  4. 采用 1.2 μm 的 z 轴步进间隔（依据 FluoView 软件计算的最佳扫描单位）进行三维 z 系列图像采集，并应用 Kalman 平均法（两帧）。

第三部分：三维可视化与动画

11. 三维（3D）可视化与动画

  1. 在 Imaris x64 软件（版本 7.3，Bitplane AG）中打开 Fluoview 文件，以可视化三维图像集。
  2. 根据需要调整显示效果，以增强神经特异性信号的对比度。
  3. 创建一个表面以可视化真皮-表皮交界。使用轮廓工具在绘制模式下勾画该边界。
  4. 为该边界分配一个半透明的表面，以便观察其下方的荧光信号。
  5. 捕获三维荧光信号的静态图像，以生成三维动画的快照图像。
  6. 使用动画功能创建三维动画。图像可多次旋转 360 度，分别显示每个信号及其合并效果（图 2、图 3 和图 4）。设置动画生成包含 200 帧、每秒 15 帧的动画视频。将每个动画保存为原始 AVI 文件。
  7. 使用 VirtualDub 软件（版本 1.9.4）压缩最终的 AVI 动画。

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结果

我们采用本方案研究了周围神经病变（PN）患者胫前（PT）和远端腿（DL）皮肤活检中表皮内神经纤维（IENF）的形态学特征。皮肤样本来自三位受试者，由犹他大学采集，用于展示与周围神经病变相关的病理形态学表现。受试者信息如下：病例1：一名51岁男性，患有2型糖尿病相关的周围神经病变（病程：14个月；疼痛评分：51）；病例2：一名56岁男性，患有2型糖尿病相关的周围神经病变（病程：108个月；疼痛评分：47）；病例3：一名66岁男性，患有2型糖尿病相关的周围神经病变（病程：42个月；疼痛评分：46）。通过神经系统病史采集和体格检查，包括定量感觉检测和神经传导研究，评估周围神经病变情况。疼痛评分依据0-100视觉模拟疼痛量表确定。

利用本方案，我们能够研究人皮肤中IENF的三维结构图2）。在 图2PGP阳性的IENF通过绿色信号识别，Trk A阳性的IENF通过红色信号标记。所有Trk A阳性的IENF也均呈PGP阳性，重叠信号显示为黄色。除了可用于检测IENF外，这些方法还可用于研究IENF中的轴突肿胀图...

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讨论

表皮内神经纤维密度（IENFD）的测量已广泛用于确定周围神经病变的程度13,14。目前最常用的方案仅测量穿透表皮基底膜的神经纤维密度；并未考虑轴突分支和/或神经形态学变化。此外，现有的IENFD分析尚未证实IENFD与周围神经病变（PN）中疼痛的存在具有相关性15。

我们先前报道过，在db/db小鼠（2型糖尿病小鼠模型）中，伤害性神经末梢表皮内神经纤维密度（IENFD）的增加与疼痛行为相关5。在该研究中，我们首次采用双重免疫荧光技术来研究伤害性表皮内神经纤维（IENF）。在本研究中，我们将该技术扩展应用于神经病变（PN）患者的人类皮肤组织。双重免疫荧光分析可同时测定总IENF和介导疼痛的IENF亚群（即伤害性IENF）的数量。这些伤害性IENF大多表达Trk A及其他伤害性神经肽5。Lauria及其同事也曾报道过针对疼痛性神经病变的类似双重免疫荧光分析方法10，他们发现疼痛性神经病变患者瞬时受体电位阳离子通道亚家族V成员1（TRPV1）的IENFD降低。基于我们的动物实验...

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披露

无任何利益冲突需要声明。

致谢

本研究工作得到了美国国立卫生研究院资助项目 K08 NS061039-01A2、神经病学研究与发现计划以及密歇根大学 A. Alfred Taubman 医学研究所的支持。本研究使用了密歇根糖尿病研究与培训中心的形态学与图像分析核心设施，该设施由美国国家糖尿病、消化与肾脏疾病研究所资助的美国国立卫生研究院项目 5P90 DK-20572 提供资金支持。作者谨此感谢 Robinson Singleton 和 Gordon Smith（犹他大学）慷慨捐赠人皮肤样本，以支持伤害感受生物标志物免疫组织化学技术的初步开发工作。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
10X PBSFisher ScientificBP399-4用于配制 1X PBS
Image-IT FX SignalInvitrogenI36933Image-IT
蛋白基因产物 9.5（多克隆兔抗体）AbD Serotec7863-0504PGP
原肌球蛋白相关激酶 A（多克隆山羊抗体）R&D SystemsAF1056Trk A
Alexa Fluor 488 驴抗α-兔InvitrogenA21206AF488 驴抗α-山羊
Alexa Fluor 647 驴抗α-山羊InvitrogenA21447AF647 驴抗α-山羊
牛血清白蛋白Sigma-AldrichA7906-100BSA
Triton X-100Sigma-AldrichT9284TX-100
非校准接种环LeLoopMP 199025接种环
96 孔检测板Corning Incorporated3603孔板
含 DAPI 的 Prolong Gold 抗荧光淬灭试剂InvitrogenP36931DAPI
22×22 mm 显微镜盖玻片Fisher Scientific12-541-B盖玻片
Superfrost Plus 显微镜载玻片Fisher Scientific12-550-15显微镜载玻片
Olympus Fluoview 激光扫描共聚焦显微镜OlympusFV500共聚焦显微镜
最佳切割温度包埋剂Sakura4583OCT
Leica 冷冻切片机LeicaCM1850冷冻切片机

参考文献

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