人类皮肤活检样本中伤害性表皮内神经纤维的三维成像

摘要

为了研究疼痛性神经病变（PN）中伤害性表皮内神经纤维（IENFs）的变化，我们建立了可直接观察伤害性IENFs三维形态变化的实验方案。对IENFs进行三维分析，有望评估PN中IENF的形态学改变。

摘要

皮肤 punch 活检常用于量化表皮内神经纤维密度（IENFD），以诊断周围性多发性神经病^1,2。目前，通常从远端小腿（DL）和近端大腿（PT）采集 3 mm 的皮肤活检样本，用于评估长度依赖性多发性神经病³。然而，由于表皮内神经纤维（IENF）具有多向分布的特点，通过二维（2D）成像分析难以清晰观察重叠的神经结构。相比之下，三维（3D）成像可能为解决这一难题提供更优方案。

在本报告中，我们介绍了应用三维成像技术研究疼痛性神经病变（PN）的方法。为了识别表皮内神经纤维（IENF），皮肤样本经过免疫荧光染色，以检测蛋白基因产物9.5（PGP），后者是一种泛神经元标记物。目前，诊断小纤维神经病变的标准方法是通过明场显微镜下PGP免疫组织化学染色来测定IENF密度（IENFD）⁴。在本研究中，我们采用双重免疫荧光分析方法，利用PGP标记总IENF密度，并结合识别神经营养素受体酪氨酸激酶A（Trk A）的抗体来识别伤害性感受IENF，Trk A是神经生长因子的高亲和力受体⁵。通过PGP与Trk A抗体共染色，可特异性清晰地标记出PGP阳性且具有伤害感受功能的神经纤维，从而有利于PN的研究。这些荧光信号可被定量分析，以评估与PN相关的伤害性IENF密度及其形态学变化。荧光图像通过共聚焦显微镜采集，并进行三维分析处理。三维成像技术提供了多角度旋转观察的能力，有助于进一步分析与PN相关的形态学改变。综上所述，免疫荧光共染色、共聚焦成像与三维分析技术的结合，显著提升了对疼痛性神经病变的研究能力。

引言

目前，临床医生通常通过皮肤钻孔活检来定量表皮内神经纤维密度（IENFD），以诊断小纤维神经病变^{3, 6-8}。活检取材部位为远端腿部（DL），即外踝上方10 cm处，以及近端大腿（PT），即前髂嵴下方20 cm处⁹。所有IENF均使用蛋白基因产物9.5（PGP）进行标记，PGP是一种泛神经元标记物^10-12。目前，标准的诊断方法是通过明场显微镜下PGP染色测定IENFD来诊断小纤维神经病变⁶。此外，多个研究团队已采用免疫荧光法进行PGP免疫组织化学染色^7-9。小纤维神经病变常与神经性疼痛相关。为了进一步理解在疼痛处理中起关键作用的IENF的功能，我们开发了一种共标记技术，可同时标记全部IENF和参与疼痛生成的神经纤维。伤害性感受IENF，特别是Aδ和C纤维，可通过共标记IENF（使用PGP）与伤害性感受标记物——原肌球蛋白受体激酶A（Trk A）进行研究⁵。Trk A是神经生长因子的高亲和力受体，在伤害性感受的发育过程中起关键作用。Trk A阳性的伤害性感受神经纤维属于肽能纤维，表达P物质（SP）和降钙素基因相关肽（CGRP）。此前，Lauria及其同事曾应用双标技术研究周围神经病变（PN），将PGP阳性的IENF与伤害性感受标记物共标记¹⁰。在我们之前的研究中，我们证明在疼痛性糖尿病神经病变的动物模型中，Trk A阳性的IENF表达上调，而Trk A阴性的IENF则无此变化

方案

A 部分：免疫组织化学

96孔板的制备及背景染色的防止：从人体受试者获取 punch 皮肤活检样本，并按照先前所述方法在固定液（含2%多聚甲醛、0.75 M L-赖氨酸溶液（pH 7.4）和0.05 mM 过碘酸钠）中于4 °C孵育12–24小时⁸。随后将样本在含20%甘油的磷酸盐缓冲液（PBS）中于4 °C进行冷冻保护，最长可保存1周；接着将组织包埋于最佳切割温度（OCT）包埋介质中，并在恒冷切片机上切成50 μm厚的切片。以下所述方案适用于8个皮肤切片，即在一个96孔板中进行漂浮式免疫组织化学染色所能容纳的最大切片数量。

第1天：

1. 角质层中非特异性免疫反应的预防

1. 按照图1所示标记96孔板。
2. 向96孔板第1行的每个孔中加入150 μl Image-IT FX Signal（Image-IT），以有效阻断背景染色^11,12。
3. 向96孔板第2行和第3行的每个孔中加入150 μl 1X PBS。
4. 每位患者获取两个50 μm厚的切片：一个来自DL处取得的活检组织，另一个来自PT处取得的活检组织。使用接种环（LeLoop）将切片从一个洗涤步骤转移至下一个步骤，以避免形态学损伤。用接种环轻柔地将每个50 μm切片转移至第1....

结果

我们采用本方案研究了周围神经病变（PN）患者胫前（PT）和远端腿（DL）皮肤活检中表皮内神经纤维（IENF）的形态学特征。皮肤样本来自三位受试者，由犹他大学采集，用于展示与周围神经病变相关的病理形态学表现。受试者信息如下：病例1：一名51岁男性，患有2型糖尿病相关的周围神经病变（病程：14个月；疼痛评分：51）；病例2：一名56岁男性，患有2型糖尿病相关的周围神经病变（病程：108个月；疼痛评分：47）；病例3：一名66岁男性，患有2型糖尿病相关的周围神经病变（病程：42个月；疼痛评分：46）。通过神经系统病史采集和体格检查，包括定量感觉检测和神经传导研究，评估周围神经病变情况。疼痛评分依据0-100视觉模拟疼痛量表确定。

利用本方案，我们能够研究人皮肤中IENF的三维结构图2）。在 图2PGP阳性的IENF通过绿色信号识别，Trk A阳性的IENF通过红色信号标记。所有Trk A阳性的IENF也均呈PGP阳性，重叠信号显示为黄色。除了可用于检测IENF外，这些方法还可用于研究IENF中的轴突肿胀图.......

讨论

表皮内神经纤维密度（IENFD）的测量已广泛用于确定周围神经病变的程度^13,14。目前最常用的方案仅测量穿透表皮基底膜的神经纤维密度；并未考虑轴突分支和/或神经形态学变化。此外，现有的IENFD分析尚未证实IENFD与周围神经病变（PN）中疼痛的存在具有相关性¹⁵。

我们先前报道过，在db/db小鼠（2型糖尿病小鼠模型）中，伤害性神经末梢表皮内神经纤维密度（IENFD）的增加与疼痛行为相关⁵。在该研究中，我们首次采用双重免疫荧光技术来研究伤害性表皮内神经纤维（IENF）。在本研究中，我们将该技术扩展应用于神经病变（PN）患者的人类皮肤组织。双重免疫荧光分析可同时测定总IENF和介导疼痛的IENF亚群（即伤害性IENF）的数量。这些伤害性IENF大多表达Trk A及其他伤害性神经肽⁵。Lauria及其同事也曾报道过针对疼痛性神经病变的类似双重免疫荧光分析方法¹⁰，他们发现疼痛性神经病变患者瞬时受体电位阳离子通道亚家族V成员1（TRPV1）的IENFD降低。基于我们的动物实验.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10X PBS	Fisher Scientific	BP399-4	用于配制 1X PBS
Image-IT FX Signal	Invitrogen	I36933	Image-IT
蛋白基因产物 9.5（多克隆兔抗体）	AbD Serotec	7863-0504	PGP
原肌球蛋白相关激酶 A（多克隆山羊抗体）	R&D Systems	AF1056	Trk A
Alexa Fluor 488 驴抗α-兔	Invitrogen	A21206	AF488 驴抗α-山羊
Alexa Fluor 647 驴抗α-山羊	Invitrogen	A21447	AF647 驴抗α-山羊
牛血清白蛋白	Sigma-Aldrich	A7906-100	BSA
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284	TX-100
非校准接种环	LeLoop	MP 199025	接种环
96 孔检测板	Corning Incorporated	3603	孔板
含 DAPI 的 Prolong Gold 抗荧光淬灭试剂	Invitrogen	P36931	DAPI
22×22 mm 显微镜盖玻片	Fisher Scientific	12-541-B	盖玻片
Superfrost Plus 显微镜载玻片	Fisher Scientific	12-550-15	显微镜载玻片
Olympus Fluoview 激光扫描共聚焦显微镜	Olympus	FV500	共聚焦显微镜
最佳切割温度包埋剂	Sakura	4583	OCT
Leica 冷冻切片机	Leica	CM1850	冷冻切片机