利用血色素的顺磁性分离晚期阶段 恶性疟原虫-在培养中生长的感染红细胞。该方法简便快速，且不影响寄生虫后续的侵袭能力。
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本文内容
摘要
摘要
与其他疟原虫物种不同， P. falciparum 可在实验室中培养，便于对其进行研究 1. 虽然能达到的寄生虫血症水平可以达到 ≈40% 的上限时，研究者通常将比例维持在约 10%。在许多情况下，有必要将含有寄生虫的红细胞（RBCs）与未感染的红细胞分离，以富集培养物并推进特定实验。
当P. falciparum感染红细胞时，该寄生虫会降解血红蛋白并以其为营养来源2, 3。然而，寄生虫必须应对其中一种毒性极强的含铁血红素基团4, 5。寄生虫通过将血红素转化为一种惰性的晶体聚合物——疟色素（haemozoin），从而避免其毒性作用6, 7。这种含铁分子被储存在寄生虫的食物泡中，其所含金属的氧化状态与血红素中的不同8。疟色素中铁处于三价状态，使其具有顺磁性，而未感染的红细胞则无此性质。随着寄生虫在红细胞内逐渐成熟，疟色素的含量也随之增加9，使得红细胞内晚期阶段的P. falciparum顺磁性进一步增强。
基于这种顺磁性，可通过将培养物通过含有磁珠的色谱柱来分离恶性疟原虫（P. falciparum）感染的红细胞晚期阶段。当含有磁珠的色谱柱置于磁铁架上时，磁珠会被磁化。由于感染的红细胞具有顺磁性，它们将被截留在色谱柱内，而流出液则主要包含未感染的红细胞以及含有寄生虫早期阶段的红细胞。
本文介绍了使用磁性柱富集晚期阶段寄生虫群体的方法，该方法可保持寄生虫良好的活性10。完成此操作后，未结合的培养物可放回培养箱，使残留的寄生虫继续生长。
方案
除离心步骤外，本方案的所有操作均应在生物安全柜内进行，以保持样品无菌。
晚期阶段分离 P. falciparum感染的红细胞
由于疟原虫属的共有代谢产物——血红素（hemozoin）赋予了寄生虫顺磁性，因此利用该方法可以分离所有晚期阶段的疟原虫感染红细胞。建议在培养物中保持较高的寄生虫血症率（3-10%），以获得更好的分离产量，尽管典型的培养物通常含有2-4%的红细胞压积（红细胞体积百分比）和1-8%的寄生虫血症率（感染红细胞的百分比）。寄生虫的培养可参照Trager和Jansen1所述方法进行。
- 每次进行裂殖体分离操作时，都必须组装一个简单的多部件装置。为此，使用 Miltenyi BioTec 的 LS 柱、Magnetic MidiMACS 分离器和 MACS MultiStand（图1）。首先，将磁力分离器固定在金属支架上，然后将磁性柱置于分离器上。
- 在另一个离心管中（全程使用 50 ml 锥形管），混合 23.2 ml RPMI 1640 培养基与 750 μl 7.5% 碳酸氢钠，配制成工作液。另准备若干离心管，用于丢弃和收集寄生虫培养物的穿流液。
- 向柱中加入 3 ml 工作液以平衡柱子，并将穿流液弃入废液管中。
- 向柱中加入 8 ml 的 P. falciparum 培养物，确保当培养物即将完全推动工作液流出柱子时，立即用收集管替换废液管，以开始回收未结合的培养物。此步骤可避免进一步稀释培养物。
- 当培养物完全流经柱子后，加入 1 ml 工作液，将残留在柱内的红细胞完全推出。
- 洗涤步骤：向柱中再加入 3 ml 工作液，并将流出液体收集至“弃用”管中，以避免稀释另一管中作为穿流液保存的培养物。
- 洗脱步骤：当 3 ml 工作液完全通过柱子后，将柱子从支架上取下，并置于一个 15 ml 离心管上方。
- 再次向柱中加入 3 ml 工作液。此步骤可洗脱被柱内磁珠截留的晚期阶段寄生虫感染的红细胞。
注意： 此时，根据所需寄生虫的数量，可开始新一轮或多个轮次的收集，但显然受限于原始培养物中的寄生虫血症水平。只要流速保持稳定状态，该层析柱可重复使用。
- 收集寄生虫的浓缩：将含有洗脱液的15 ml离心管在室温下以150 × g离心5分钟，使被寄生的红细胞形成深色沉淀。
- 弃去上清液，保留足够液体以取少量样品，并通过显微镜检测确定浓度和总产量（见下文步骤2）。
- 此时，若晚期阶段寄生虫的分离与捕获已成功完成，可将收集的培养物再次与新鲜培养基共同孵育。
- 将收集的寄生虫稀释至后续实验所需的体积和溶液中。
2. 纯度与得率分析
- 使用血细胞计数板并在光学显微镜下计数，以确定所获得的寄生虫浓度。计数时，取10 μl收集的寄生虫与培养基的混合液，滴加到血细胞计数板盖玻片下方。计数血细胞计数板四个象限中的寄生虫数量，将总数除以4，再乘以104，即可得到每毫升感染红细胞的浓度。
注意事项： a) 混合液的浓度由用户在重悬沉淀时通过添加较多或较少的培养基来决定。建议工作浓度为 5.5 × 104 裂殖体每 μ升（通常通过加入100-300） μl 加入收集的寄生虫中）。如果 20 μ该浓度的溶液加入至终体积100 μL中 μ将培养基与红细胞混合后，在典型的4%红细胞压积培养物中可获得约1%的寄生率。b) 在血细胞计数板下计数时需迅速完成，因为随着样品在计数室中干燥，红细胞会开始裂解。被感染的红细胞（应占多数）内部可见一个深色斑点，可借此与未感染的红细胞区分。
- 进行薄层吉姆萨染色，以评估收集物的纯度：将载玻片在10%甲醇中迅速固定，干燥后浸入用蒸馏水稀释的20%吉姆萨染色液中。染色10分钟，随后可自然晾干并在显微镜下观察。寄生率应可达到70%以上。
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结果
在图2中显示了培养物通过磁性柱前(A)和操作后(B)的情况。通常在100倍放大视野下可见1至2个被感染的红细胞，如图2所示，箭头指向图2A中的被感染红细胞。在典型操作中，起始培养物的寄生率约为5%（图2A），经此操作后通常可获得寄生率为97%–100%的红细胞（图2B）。寄生率富集达20倍左右易于实现，根据需要或预期，多次让培养物通过磁柱可高效获得大量晚期阶段感染的P. falciparum红细胞。
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讨论
疟原虫（P. falciparum）的体外培养物寄生率有限，在培养增殖达到高峰时，仍有超过一半的红细胞未被感染。大多数科研实验希望仅使用被感染的红细胞进行研究。为此，有必要采用一种分离技术，根据感染状态将培养物分离开来。有效的方法包括使用链球菌溶血素 O（streptolysin O）选择性通透并裂解未感染的红细胞11，以及一系列利用两类细胞密度差异的差速离心法。其中一些方法包括明胶漂浮法12和使用Plasmion的方法13，但最常用的介质是密度梯度介质Percoll，它可通过形成不同密度的分层来分离不同类型的红细胞，但可能对疟原虫具有一定的毒性14。
我们采用了一种最初由 Paul 描述并由 Trang 进一步分析的技术15, 16，该技术基于疟色素（haemozoin）的顺磁性。疟色素是寄生虫在消化血红蛋白过程中产生的一种惰性晶体。正如我们课题组在其他文献中所报道的，该方法具有非侵入性，且似乎不会影响寄生虫的生物学活性，这一点可通过治...
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披露
我们无任何披露事项。
致谢
本工作由巴拿马国家科学技术秘书处（SENACYT）资助，授予CS的PRB-009项目基金以及授予LC的博士奖学金。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| RPMI 1640 Hepes 改良型 | Sigma-Aldrich | R4130 | 添加 10% 人血清、2% 葡萄糖和 0.2% 碳酸氢钠 |
| MidiMACS 分离器 | MACS Miltenyi BioTec | 130-042-302 | |
| MACS MultiStand 支架 | MACS Miltenyi BioTec | 130-042-303 | |
| LS 分离柱 | MACS Miltenyi BioTec | 130-042-401 | |
| 血细胞计数板 | Grafco | Grafco Neubauer Chamber | 可通过其他多个供应商获得 |
参考文献
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重印与许可
