使用四种技术测量人类精子细胞内 Ca2+ 的变化：常规荧光测定法、停流荧光测定法、流式细胞术和单细胞成像

摘要

细胞内 Ca²⁺ 动态变化在精子生理学中具有重要意义，而 Ca²⁺ 敏感染料则为研究这些变化提供了多功能工具。通过群体实验（荧光测定法和停流荧光测定法）和单细胞实验（流式细胞术和单细胞成像），可用于追踪人精子细胞中时空性的 [Ca²⁺] 变化。

摘要

精子是雄性生殖细胞，其结构特别适应于到达、识别并融合卵子。为了完成这些任务，精子细胞必须能够应对持续变化的环境，并克服多种物理屏障。由于精子在本质上无转录和翻译活性，这些运动细胞高度依赖多种信号转导机制，以实现定向移动，并在寻找卵子的旅程中应对严苛的环境条件。其中，Ca²⁺介导的信号通路对多种精子功能至关重要：包括运动能力的激活、获能（使精子为顶体反应做好准备的复杂过程）以及顶体反应（一种促进精子-卵子融合的胞吐事件）。利用荧光染料追踪细胞内该离子浓度变化具有重要意义，因其操作简便、灵敏度高且检测方式多样。通过一种统一的染料负载方案，我们采用四种不同的荧光测定技术来监测精子内Ca²⁺动态变化。每种技术提供独特信息，可实现空间和/或时间分辨率，从而在单细胞水平及细胞群体水平上获取数据。

引言

Ca²⁺ 是真核细胞信号转导通路中一种通用的第二信使。细胞内 Ca²⁺ (Ca²⁺_i) 参与调控可兴奋细胞和非可兴奋细胞中多种基本的生理过程。Ca²⁺²⁺ 作为信号转导事件中的第二信使，其在细胞内信息传递中具有时空多效性。尽管 Ca²⁺ 无法合成 从头合成 或在细胞内降解，其细胞内浓度（[Ca²⁺]_i通过多种细胞机制，Ca²⁺的浓度被维持在极为严格的范围内，这些机制持续地对钙离子进行缓冲、螯合、区隔化和/或积累²⁺细胞内该离子浓度的变化可能发生在高度局部化的区域 ¹，解析这些波动对于深入理解（1）其在信号传导机制中的作用，（2）其生理学意义，以及（3）细胞信号传导的普遍机制至关重要。Ca²⁺介导的信号转导在精子生理学中具有特别重要的意义 ²精子活力是决定受精成功最重要的功能之一，事实上，多种精子活力缺陷可导致不育。 ^3-5钙的重要性²⁺ 在鞭毛运动中的作用早已被认识 ⁶；然而，Ca如何发挥其作用的机制²⁺ 鞭毛弯曲特定形态的调控机制尚未完全阐明。

在与卵子融合之前，精子必须经历获能过程，这是一种依赖于精子在雌性生....

方案

本文报道了使用上述四种技术来检测人精子细胞内[Ca²⁺]_i的变化。我们采用孕酮诱导Ca²⁺反应，因为已有充分证据表明，这种类固醇激素可引起精子细胞内[Ca²⁺]_i出现短暂性升高。特别是在人精子中，孕酮可直接激活一种仅表达于精子细胞质膜上的Ca²⁺通道（即CatSper）^10,11。此外，鉴于在精子获能过程中[Ca²⁺]_i升高已被广泛认可，我们还测定了精子获能前后静息状态下的[Ca²⁺]_i水平。对于需要设置阳性对照的技术，我们使用Ca²⁺离子载体——离子霉素（ionomycin）——以诱导细胞最大程度地摄取Ca²⁺，从而获得最大荧光信号；为获得最小荧光值，我们则使用Mn²⁺来淬灭荧光。

1. 精子样本的上游法制备（见图1）

仅使用符合世界卫生组织最新版《人类精液检查与处理实验室手册》所规定参数的射出精液样本（通过手淫方式获取），该手册可从以下网址获取：

结果

图1. 采用上游法进行精子样本制备的实验方案示意图。 图中展示了分离活动精子及调整其浓度的主要步骤。仅在需要进行获能处理时，才执行最后的孵育步骤。

讨论

细胞内信号转导对大多数细胞活动至关重要；Ca²⁺ 是一种普遍存在的信使分子，伴随哺乳动物细胞从受精时的起源直至生命周期结束。针对不同刺激，[Ca²⁺]i 升高、振荡并降低，具有时空编码特性；相应地，Ca²⁺ 激活、调节或终止多种生理过程²⁺编码的信息。细胞内Ca²⁺ 动力学在精子生理学中极为重要，因为该离子参与了信号转导过程的复杂协调。关于此类Ca²⁺ 波动有助于解析Ca的分子身份²⁺ 通道及其在不同信号级联中的特定作用。Ca²⁺-敏感型荧光染料是研究它们的有力工具，可实现高特异性和高灵敏度的Ca²⁺ 可用于追踪活细胞内浓度变化的测量方法。本文采用细胞群体实验（常规和停流荧光测定法）和单细胞实验（流式细胞术和单细胞成像）来监测时空[Ca²⁺] 孕酮刺激下人精子细胞的变化，或评估Ca²⁺ 干预前后的静息水平 体外 获能

传统的荧光测定法是一种广泛应.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Ham's F-10	Sigma-Aldrich	N-6013
牛血清白蛋白	Sigma-Aldrich	A-7906
二水氯化钙，纯度约 99%	Sigma-Aldrich	C-3881
Makler 计数板	SEFI Medical Instruments LTD	SEF-MAKL
Fluo-3 AM	Invitrogen	F-1242	20 小瓶，每瓶 50 μg
离子霉素	Alomone	I-700
孕酮	Sigma-Aldrich	P0130
氯化钠	Sigma-Aldrich	S-9888	人精子培养基（HSM）试剂
氯化钾	Sigma-Aldrich	P-3911	人精子培养基（HSM）试剂
碳酸氢钠	JT Baker	3506	人精子培养基（HSM）试剂
氯化镁	Sigma-Aldrich	M-2670	人精子培养基（HSM）试剂
无水氯化钙	Sigma-Aldrich	C-1016	人精子培养基（HSM）试剂
HEPES	Sigma-Aldrich	H-3125	人精子培养基（HSM）试剂
D-葡萄糖	JT Baker	1906-01	人精子培养基（HSM）试剂
丙酮酸钠	Sigma-Aldrich	P-2256	人精子培养基（HSM）试剂
L-乳酸钠（纯度约 99%）	Sigma-Aldrich	L- 7022	人精子培养基（HSM）试剂
碘化丙啶	Invitrogen	L-7011	组分 B
曲拉通 X-100（t-辛基苯氧基聚乙氧基乙醇）	Sigma-Aldrich	X-100	水中 2.4 mM 溶液
圆形盖玻片	VWR	48380 080	直径 25 mm
聚-L-赖氨酸溶液	Sigma-Aldrich	P8920
氯化锰	Sigma-Aldrich	M-3634
Attofluor 显微镜细胞培养腔室	Life technologies	A-7816
二甲基亚砜	Sigma-Aldrich	D2650	5×5 ml