测量细胞内Ca +

Summary

细胞内Ca ⁺动力学是非常重要的，在精子生理学和Ca ⁺敏感的荧光染料构成一个多功能的工具来研究它们。人口实验（荧光和停流荧光）和单细胞实验（流式细胞仪和单细胞成像）是用来跟踪时空的[Ca ⁺]在人类精子细胞中的变化。

Abstract

精子是男性生殖细胞特别设计，以达到与卵子结合，识别和融合。要执行这些任务，精子细胞必须准备好面对不断变化的环境和来克服一些物理障碍。在本质上转录和翻译默默的，这些运动细胞的深刻依赖不同的信号机制，将自己定位和定向的方式游泳，具有挑战性的环境条件，在旅途中找到鸡蛋抗衡。特别的Ca ^{2 +}介导的信号是关键的几个精子功能:激活的运动，获能和顶体反应（胞吐的事件，使精卵融合）（一个复杂的过程，精子顶体反应准备）。使用荧光染料来跟踪该离子的细胞内波动是由于它们易于应用，灵敏度显着的重要性，和多功能性DET挠度。使用单一染料加载协议，我们使用四种不同的荧光技术监测精子的Ca ^{2 +}的动态。每种技术都提供了不同的信息，使空间和/或时间分辨率，在单细胞和细胞种群水平产生数据。

Introduction

的Ca ^{2 +}是一种通用的第二信使，在真核细胞中的信号转导通路。细胞内^钙离子（Ca ^{2 +}的_一）参与许多基本的生理过程的调节兴奋和非兴奋性细胞。的重要性和普遍性的Ca ^{2 +}作为第二信使的信号转导过程中的事件是来自于细胞内的信息在传输及其时空通用性。虽然的Ca ^{2 +}可以不被合成的新生或退化内的细胞，其细胞内浓度（[钙^{2 _+]} i _的 ）是保持非常严格的限制内通过不同的细胞机制，不断缓冲，死骨，区域化，和/或累积的Ca ^{2 +。}在该离子的浓度的变化可以发生在高度局部化区域内的电池^1，解密这种波动是必不可少的获得解EPER（1）中的作用中的信令机制，（2）的生理意义，和（3）一般的细胞信号转导机制的理解。的Ca ^{2 +}介导的信号转导是在^第2精子生理特别重要的。精子活力受精成功的最重要的功能之一，而事实上，一些精子活动力缺陷可导致不育^3-5。中的Ca ^{2 +}鞭毛运动的重要性已确认^6，但是如何的Ca ^{2 +}鞭毛弯曲控制的具体形式，该机制尚不完全清楚。

在融合与卵子结合之前，精子必须经过获能，精子内....

Protocol

在本文中，我们报道了使用上述四个技术来衡量的[Ca 2 +] i的变化在人类精子细胞。我们用孕激素引发的Ca 2 +响应，因为它是公认的，这种类固醇产生一个短暂的[的Ca 2 +] i的增加精子。特别是，在人精子，孕激素直接激活的Ca 2 +通道（即CatSper）表达于精子细胞的质膜10,11。我们还测量了休息的[Ca 2 +] i的前，后获能，它也被广泛接受，增加的[Ca 2 +] i的出现能过程。对于阳性对照的技术要求中，我们使用的Ca 2 +离子载体离子霉素诱导最大的Ca 2 +摄取进入细胞内，从而，最大荧光响应，最小荧光值，我们使用了锰2 +淬灭荧光。

1。精子样品制备水池方法（见图1）

仅使用射精样本（通过自慰获得），其特征履行世界卫生组织实验室手册（在

Results

图1。示意图实验的协议精子样品制备游泳方法。活动精子分离，并调整其浓度的主要步骤进行了说明。最后孵化步骤只获能需要时执行。

图2。黄体酮导致增加的[Ca 2 +] i的.......

Discussion

细胞内的信号是至关重要的大多数细胞活动的Ca ^{2 +}是一个无处不在的使者，伴随着哺乳动物细胞在其整个生命周期，从他们的起源在受精时，其生命周期结束。针对不同的刺激的[Ca ^{2 +]} i的增加，振荡和录时空编纂;因此，多元化的进程被激活，调制或终止的Ca ^{2 +}编码的消息。细胞内Ca ^{2 +}动力学精子生理学是非常重要的，因为这涉及离子的信号转导过程中在一个复杂的业务流程。这样的Ca ^{2 +}波动知识可以帮助破译的Ca ^{2 +}通道参与，其具体的作用在不同的信号通路分子的身份。的Ca ^{2 +}敏感的荧光染料，构成了一个强大的工具来研究他们，使高度特异性和敏感性的Ca ^{2 + M}easurements可能被用来跟踪在活细胞中的浓度的变化。在本文中，细胞群体的实验（传统和停止流荧光）和单细胞实验（流式细胞仪和单细胞成像）使用，也可以按照时空的[Ca ^{2 +]}在人类精子细胞中的变化，孕激素刺激后，或估计的Ca ^{2 +}休息前的水平，

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ham's F-10	Sigma-Aldrich	N-6013
牛血清白蛋白	Sigma-Aldrich	A-7906
氯化钙二水合物约 99%	Sigma-Aldrich	C-3881
Makler 计数室	SEFI Medical Insruments LTD	SEF-MAKL
Fluo-3 AM	Invitrogen	F-1242	20 vials/50 μg 每个
离子霉素	Alomone	I-700
孕酮	Sigma-Aldrich	P0130
氯化钠	Sigma-Aldrich	S-9888	人精子培养基 （HSM） 试剂
钾	Sigma-Aldrich	P-3911	人精子培养基 （HSM） 试剂碳酸
氢钠	JT Baker	3506	试剂人精子培养基 （HSM）
氯化镁	Sigma-Aldrich	M-2670	人精子培养基 （HSM） 试剂无
水氯化钙	Sigma-Aldrich	C-1016	人精子培养基 （HSM） 试剂
HEPES	Sigma-Aldrich	H-3125	人精子培养基试剂 （HSM）
D-葡萄糖	JT Baker	1906-01	人精子试剂培养基 （HSM）
丙酮酸钠	Sigma-Aldrich	P-2256	人精子培养基 （HSM） 试剂
L-乳酸钠（约 99%）	Sigma-Aldrich	L- 7022	人精子培养基 （HSM） 试剂碘
化丙啶	Invitrogen	L-7011	组分 B
Triton X-100（叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇）	Sigma- Aldrich	X-100	2.4 mM 溶液在水中
圆形盖玻片	VWR	48380 080	直径 25 mm
聚-L-赖氨酸溶液	Sigma-Aldrich	P8920
氯化锰	Sigma-Aldrich	M-3634
Attofluor;细胞室， 用于显微镜	Life technologies	A-7816
二甲基亚砜	Sigma-Aldrich	D2650	5x5 ml