将真菌昆虫病原菌定殖为内生菌：迈向内生生物防治

摘要

本实验方案展示了两种接种方法，用于将虫生真菌Beauveria bassiana作为内生菌引入普通菜豆（Phaseolus vulgaris）中，为后续开展内生菌生物防治效果评估做准备。

摘要

球孢白僵菌 是一种能够以内生方式定殖植物的真菌昆虫病原体。作为内生菌， B. bassiana 可能在保护植物免受食草动物取食和病害方面发挥作用。本实验方案展示了两种接种方法，用于建立 B. bassiana 内生地存在于普通菜豆（Phaseolus vulgaris），为后续内生生物防治效果的评估做准备。植物在经过表面灭菌的种子萌发后生长两周，随后接受处理 B. bassiana 10的处理⁸ 每毫升（或每毫升水）分生孢子接种液通过叶面喷雾或土壤浇灌方式施用。两周后收获植株，采集其叶片、茎和根组织，以评估内生真菌的定殖情况。具体操作为：将样品分别进行表面灭菌，切成多个小段，接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基中，培养20天。每隔2–3天观察植物组织片段相关的真菌生长情况，并记录发生频率 B. bassiana 以评估其内生定殖程度。接种效果的分析比较了以下情况的发生频率 B. bassiana 在特定植物部位内（即 叶片、茎或根）在不同处理组与对照组间的差异。除了接种方法外，实验的具体结果可能还取决于目标作物的物种或品种、所使用的真菌昆虫病原菌的菌株或分离物，以及植物的生长条件。

引言

虫生真菌是昆虫种群的重要调节因子，在真菌杀虫剂方面具有巨大潜力¹。然而，直到最近才证实虫生真菌可作为内生真菌存在，无论是在自然条件下，还是通过多种接种方法诱导产生²。内生型虫生真菌的生态功能在很大程度上仍不清楚，但一些研究已将其与植物生长促进^3,4、抗食草动物^5-8以及抗病性^9,10联系起来。本文所介绍方法的总体目标是将一种虫生真菌引入植物体内成为内生菌，为后续开展内生生物防治效果评估做好准备。

Beauveria bassiana（Balsamo）Vullemin（子囊菌门：肉座菌目）是研究最为深入的内生性真菌昆虫病原菌^5-9,11-19，并已作为商品化真菌杀虫剂投入使用。已测试用于建立B. bassiana为内生菌的接种方法包括土壤浇灌^14,17、种子包衣¹⁸和浸种¹⁴、胚根处理^13,15、根部及根茎浸入^11,16,18、茎部注射¹⁷、叶面喷雾^14,17,20以及花部喷雾¹⁹。利用这些方法，研究人员已成功将B. bassiana引入香蕉¹¹、菜豆⁷、可可¹³、咖啡¹⁷、玉米⁷、棉花⁷、枣椰树¹²、黄麻²¹、罂粟²⁰、南瓜⁷、辐射松¹⁸、高粱¹⁴、番茄⁷和小麦⁷。近期证据表明，内生性的B. bassiana不仅有可能保护植物免受节肢动物害虫的侵害^5-7,22-27，还可能抵御某些植物病原体⁹。

普通菜豆（Phaseolus vulgaris）是受病虫害影响最严重的作物之一，可能受到超过400种害虫和200种病原体的侵袭，这些生物的侵害被认为是全球各地区菜豆生产最主要的限制因素²⁸。因此，普通菜豆可作为研究球孢白僵菌（B. bassiana）内生生物防治作用范围的理想模式作物。作为实现这一目标的第一步，本文描述了通过叶面喷雾和土壤浇灌两种接种方法，将球孢白僵菌（B. bassiana）引入普通菜豆体内成为内生菌的技术。

方案

1. 植物

1. 将菜豆种子（品种 Calima）浸入0.5%次氯酸钠溶液中2分钟，再浸入70%乙醇中2分钟，进行表面灭菌。随后用无菌蒸馏水冲洗种子三次。
2. 取最后一次冲洗液100 μl涂布于马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基上，于25 °C培养10天，以评估灭菌效果。若平板上出现任何微生物生长，则终止实验并重新开始。
3. 将种子每三粒一组种植于含有无菌土壤与沙子（2:1比例）混合物的花盆中。将花盆置于25 °C、相对湿度约50%、12小时光周期的生长室中。种子萌发一周后，去除其中长势最弱的两株幼苗。每隔2–3天用无菌蒸馏水浇灌，并在种植后10天和20天时，施用6 g/L的NPK 15-15-15水溶性肥料进行施肥。

2. 真菌

1. 获取一种市售制剂 球孢白僵菌 菌株GHA（Mycotrol SE，Laverlam，Cali，哥伦比亚）。
2. 为获得单孢子储备培养物，取约一环孢子悬浮于1 ml含0.1% Triton-X 100的水溶液中，涡旋振荡10秒，然后涂布平板 100 μl 在2.5% Noble琼脂上涂布悬浮液，并在37°C下孵育24小时 25 °C将单个萌发的分生孢子转移至含有PDA的100 mm培养皿中，培养至菌丝覆盖整个培养皿（约3–4周）。
3. 在无菌条件下，用刮刀将培养基表面的真菌菌体刮下，并悬浮于10 ml无菌的0.1% Triton-X 100溶液中，涡旋振荡1分钟。随后，将悬浮液通过无菌纱布过滤，以去除菌丝，获得储备悬浮液。
4. 使用血细胞计数板估算储备悬浮液中的分生孢子浓度。为便于计数分生孢子，制备10,000倍的系列稀释液，每次转移 100 μl 分生孢子悬液的 900 μl 加入0.1% Triton-X 100，涡旋振荡10秒，然后进行下一步稀释。
5. 为制备接种物，将储备悬液调整至终浓度为10⁸ 分生孢子/毫升，使用公式：
   
6. 为评估分生孢子活力，进行平板培养 100 μl 2.5% 营养琼脂平板上进行10,000倍稀释，于37°C培养24小时 25 °C然后，随机检查三组各100个分生孢子，以估算萌发率。当观察到分生孢子萌发出的芽管长度超过该分生孢子直径的一半时，视为已萌发。仅当平均萌发率超过90%时，方可使用该孢子悬浮液。

3. 接种

1. 当植物长至第一片真叶期（约播种后14天）时进行接种。接种前24小时，用无菌蒸馏水将盆土浇透至田间持水量。
2. 采用叶面喷雾法时，使用手动喷雾器将分生孢子悬浮液（处理组）或0.1% Triton-X 100（对照组）均匀喷洒于叶片正面（上表面），直至表面饱和。用铝箔覆盖花盆顶部，防止分生孢子随液体流入土壤。喷雾后，用塑料袋覆盖植株24小时，以维持高湿度环境，促进真菌侵染。
3. 采用土壤浇灌法时，使用量筒将10 ml分生孢子悬浮液（处理组）或0.1% Triton-X 100（对照组）浇灌于植株基部的土壤表面。
4. 接种完成后，将植株放回生长室，采用随机完全区组设计进行排列。应设置不少于四个额外的实验区组，以便在同一实验中同时评估植株生长情况和内生定殖效果。

4. 评估

1. 以随机顺序逐个区组评估实验。对于无法在一天内完成评估的大型实验，此步骤尤为重要。
2. 处理植株前，测量并记录其从基部到顶端分生组织的高度。然后小心地将植株连根拔起，并用流动的自来水彻底清洗。
3. 从每株植株上采集两片小叶、两段根和两段茎。从小叶中随机选取样品，取自植株的第一片真叶。然后从植株中部和靠近土壤表面处各取一段3 cm长的茎样品。最后，从主根中部和根尖后方1 cm处各取一段3 cm长的主根样品。将样品分别放入三个独立的纸袋中，并做好相应标记。
4. 完成一个区组中所有植株的清洗和取样后，依次处理叶片、根部，最后处理茎部。
5. 在无菌超净工作台中对组织进行表面灭菌，操作同上文1.1步骤。将每个样品浸入无菌蒸馏水中清洗三次，然后在无菌纸巾上晾干。随后切去并弃除外缘部分，因为这些区域的内生真菌可能因接触消毒剂而被清除。
6. 将修剪后的样品切成六个小段，叶片段平均大小为6×6 mm，茎和根段各长6 mm。将六个小段接种于直径60 mm、添加了抗生素（四环素、链霉素和青霉素，各2 mg/L）的PDA培养基平板上。用封口膜密封平板，并在黑暗条件下25 °C恒温培养。每株植株产生六个平板，每个植物部位两个。
7. 处理完每个植物部位的区组后，更换漂洗用水。在丢弃使用过的漂洗水之前，取100 μl样品涂布于PDA培养基平板上，25 °C黑暗培养10天，以评估灭菌效果。若出现真菌生长，则相应样品不得用于后续分析。
8. 在20天内每隔2–3天检查一次平板，观察并记录真菌生长情况。一旦发现植物小段上出现真菌内生菌，应立即切除并转移至含有新鲜PDA培养基的新平板中，以避免原平板中相邻样品间的交叉污染。
9. 记录植物小段中B. bassiana的生长情况。Beauveria bassiana可通过其特征性的白色浓密菌丝、边缘逐渐变为乳黄色来识别。若不确定，可将样本置于一滴水中制片，在显微镜下观察是否存在该物种特有的球形分生孢子和锯齿状分生孢子梗。
10. 利用额外的实验区组评估处理对植物生物量的影响。首先测量植株从基部到顶端分生组织的高度。然后小心地将植株连根拔起，用自来水清洗干净，并在45 °C下烘干三天，以测定其干重。

结果

B. bassiana 能够以内生方式定殖P. vulgaris，这是对已实施的接种处理的响应（图1）。无论是叶面喷施还是土壤浇灌，均导致在超过80%的处理植株中实现了B. bassiana的内生定殖（图2）。然而，定殖程度取决于所评估的植物部位以及所采用的接种方法。叶片对喷雾接种的响应最佳；而根部仅对浇灌接种产生响应；茎部则对两种接种方法的响应相似。B. bassiana在任何对照组植物组织中均未被检测到。

无论采用何种处理，除B. bassiana外的内生菌均从15%的受试植物组织中生长出来，但在这些内生菌侵入邻近组织并影响实验结果之前，已将其从培养平板上分离移除。

接种后两周，处理组与对照组植株在外观上无法区分。两组植株的干重和株高均未检测到差异。

图1. 枯草芽孢杆菌（Beauveria bassiana）对菜豆植株（Phaseolus vulgaris cv. Calima）内生定殖的接种处理代表性结果。 左上：无菌生长的对照平板。右上：来自植物组织片段的内生真菌污染整个平板。左下：两个植物组织片段中生长出的 B. bassiana。右下：显微镜下观察到的内生 B. bassiana 分生孢子及分生孢子梗。

图2. 接种处理对球孢白僵菌（Beauveria bassiana）菌株GHA在菜豆（Phaseolus vulgaris cv. Calima）植株内生定殖的影响（接种后两周）。 定殖率表示定殖的植物组织段数量占培养的组织段总数的百分比。

讨论

多种因素可能影响将虫生真菌确立为内生菌的实验具体结果。我们的结果表明，接种方法便是其中之一。可进行实验的生物因素包括所选作物种类或品种，以及所用虫生真菌的物种、菌株或分离物。其他可考虑调控的因素还包括接种物浓度、接种时植物的生长阶段以及植物的培养条件。

理想的接种方法应能使昆虫病原真菌在植物体内实现系统性定殖^14,17,18,21。然而，实际情况似乎是接种方法往往倾向于导致局部定殖的特定模式。例如，在咖啡植株中，叶面喷雾有利于真菌在叶片中定殖，而土壤浇灌则更有利于根部定殖¹⁷。我们在普通菜豆中也发现了相同的模式。最终，接种方法的选择应根据内生真菌在植物体内的预期定殖位置来决定，该位置应与目标植食性昆虫或植物病原体所占据的生态位相匹配。

尽管培养基培养法常用于内生菌的检测与定量，但该方法可能成本较高、操作困难且易产生误差。例如，在一项优化实验中，共评估了10,800个植物组织片段（接种于1,800个培养皿上） B. bassiana 香蕉接种¹⁶其中，4,496 个切片被一种假定的微生物定植 B. bassiana，主要根据菌落形态进行鉴定。显然，对每个菌落进行显微镜下的物种验证是理想但难以实现的步骤。另一方面，有1,176个样本被其他真菌定植，因此被弃用并视为缺失数据。¹⁶然而，存在一种可能性 B. bassiana 是一种竞争力较弱或生长较慢的内生菌，如果给予足够时间，最终可能从这些区域生长出来。因此，基于培养基培养的内生菌检测方法容易产生假阳性与假阴性结果。因此，有必要开发更为可靠的检测与定量方法，例如基于聚合酶链式反应（PCR）的检测技术^20,21,24是合理的。

接种实验的最终目标应是开发出一种高效的处理方法，能够提供持久的系统性抗性，以抵御植食性生物侵害和/或病害。一个合理但尚未经过验证的假设是，内生菌定殖程度应与内生菌介导的抗性程度呈正相关。因此，在优化接种方法后，一个自然的后续步骤便是检验这一相关性。已有若干视频实验方案可帮助研究人员为特定害虫或病原体设计合适的抗性测定方法^29-31。最终，正是该测定方法将决定接种方法的成功与否，以及内生菌生物防治潜力的实现程度。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂
试剂/材料名称	公司	目录编号
Mycotrol SE	Laverlam	4167
Noble 琼脂	Sigma	A5431-250G
青霉素 G 钠盐	Sigma	P3032-25MU
培养皿 (100 × 15 mm)	Fisher	08-757-12
培养皿 (60 × 15 mm)	Fisher	08-757-13A
马铃薯葡萄糖琼脂	Difco	213400
普通漂白剂 (NaOCl)	CLOROX	N/A
硫酸链霉素	Sigma	S6501-25G
四环素	Sigma	T3258-25G
三元复合肥 (NPK)	ABOCOL	N/A
吐温 X-100	Sigma	X-100
仪器
生物安全柜	NuAire	NU-425-600
血细胞计数板	Fisher	02-671-10
Leica DM LB 显微镜	Leica	N/A