光血栓性缺血：一种用于小鼠卒中研究的微创且可重复的光化学皮层损伤模型

摘要

光血栓法是一种快速、微创的技术，可高度可重复地在特定感兴趣区域诱导产生小而界限清晰的梗死灶。该方法特别适用于研究转基因小鼠中脑可塑性相关的细胞和分子反应。

摘要

光血栓性卒中模型旨在通过光敏化先前注射的光敏染料，在特定皮层区域诱导缺血性损伤。光照后，染料被激活并产生单线态氧，损伤血管内皮细胞膜成分，继而引起血小板聚集和血栓形成，最终导致局部血流中断。该方法最初由 Rosenblum 和 El-Sabban 于 1977 年提出，随后 Watson 于 1985 年在大鼠脑中进行了改进，奠定了当前模型的基础。此外，转基因小鼠品系的日益可及也进一步提升了人们对光血栓模型的关注。简而言之，将光敏染料（玫瑰红）经腹腔注射后进入血液循环。当受到冷光源照射时，染料被激活，诱导内皮损伤并激活血小板，引发血栓形成，从而导致局部血流中断。光源可直接作用于完整颅骨，无需开颅手术，因而能够以可重复且无创的方式靶向任意感兴趣的皮层区域。随后对小鼠进行缝合并使其苏醒。缺血性损伤的评估可通过氯化三苯基四氮唑或焦油紫染色快速完成。该技术产生的梗死灶体积小且边界清晰，非常有利于精确的细胞表征或功能研究。此外，该模型特别适用于研究转基因小鼠中脑可塑性相关的细胞与分子反应。

引言

进入21世纪初，缺血性卒中是一种严重疾病，为全球长期残疾的第二大原因¹ ，也是全球死亡的第二大原因，2004年卒中导致的死亡人数约为570万²。尽管已投入大量研究努力，目前仍缺乏有效治疗手段以促进卒中后的功能恢复。卒中动物模型在卒中研究领域被广泛应用，因其可模拟缺血性损伤的病理生理过程，并可在体内（in vivo）评估不同神经保护策略的有效性。多数此类模型旨在通过暂时或永久性阻断大脑中动脉的血流，诱导大范围的梗死；而另一些模型则被开发用于研究特定区域（通常是运动皮层和体感皮层）的小范围病灶。然而，多种因素可能导致实验性卒中研究存在一定程度的变异性，包括所用小鼠品系、实验动物的年龄与性别，以及尤为关键的——诱导缺血性损伤所采用的技术。就后者而言，手术持续时间与侵入性（i.e. 是否需要开颅）以及操作者为可靠诱导缺血性病灶所需具备的手术技能，是决定体内（in vivo）卒中研究成功与无偏倚的关键因素。

光血栓法的概念最初由 Rosenblum 和 El-Sabban 于 1977 年提出³，随后 Watson et al. 在 1985 年将其应用于大鼠脑部研究而广为人知⁴，该研究对技术进行了重大改进，并奠定了当前模型的基础^3-6。光血栓法旨在通过光照激活先前注入血液循环系统的光敏染料，诱导皮层梗死，....

方案

1. 术前准备

1. 在1.5 ml离心管中称取玫瑰红（Rose Bengal），加入无菌生理盐水溶解，配制成终浓度为15 mg/ml的溶液。使用0.2 μm滤器过滤除菌，避光室温保存，可稳定存放长达两个月。
2. 所有手术器械均需通过高压灭菌进行消毒。手术区域应在手术开始前一小时内完成消毒处理。
3. 记录小鼠体重，以调整需注射的玫瑰红剂量。在本实验方案中，我们对12周龄雌性CD1小鼠按10 μl/g体重剂量进行注射。为获得理想的大脑皮层损伤范围，可通过一组独立的预实验测试不同剂量（通常为2 μl/g、5 μl/g或10 μl/g体重）来确定所需玫瑰红的用量。需注意，注射玫瑰红的剂量高度依赖于实验条件，尤其是所用光源类型及光照持续时间。在本研究中，经15分钟光照后，需采用10 μl/g（150 μg/g）剂量才能有效诱导光血栓形成；而其他研究组报道，腹腔注射50 μg/g^6,8或100 μg/g¹⁰剂量已足以诱导光血栓性损伤。

2. 麻醉操作步骤

1. 在透明的麻醉诱导舱中，使用异氟烷（诱导浓度3.5-4%，维持浓度1.5-2%）与50%（v/v）氧气/50%（v/v）一氧化二氮混合气体对小鼠进行麻醉。气体麻醉可使动物快速苏醒，且麻醉气体浓度易于调节。也可选用氯胺酮-赛拉嗪混合物对小鼠进行麻醉。
2. 当达到深度麻醉状....

结果

该方案将产生一个皮质损伤，此损伤在解剖暴露大脑皮层后肉眼即可观察到（图 1A-1C）。光血栓性损伤发生在皮层的浅层和深层，这些区域的组织具有足够的透光性，可允许玫瑰红（Rose Bengal）发生光激活。脑梗死范围的测量可通过在新鲜组织上使用氯化三苯基四氮唑（TTC）进行组织学染色，或在经4%多聚甲醛（PFA）固定后使用焦油紫（cresyl violet）快速完成。在进行TTC孵育前，需将新鲜解剖获得的大脑置于脑切片器中，切成1 mm厚的脑片（图 1C）。TTC可将存活组织染成红色，而梗死区域则呈苍白色，从而可精确测量梗死面积（图 1D-1E）。根据病灶大小，缺血不完全区域（即半暗带）非常小或几乎不存在。

类似地，焦油紫染色可使未染色的梗死区域与呈紫色的周围组织形成对比，从而识别梗死区。此外，还可评估损伤后第一周内发生的反应性增生和细胞浸润（图2A1-2A2），以及胶质瘢痕的形成（图2B1-2B2）。阴性对照组需进.......

讨论

修改与替换

由于玫瑰红在562 nm处具有吸收峰，最初选择使用滤光氙弧灯产生的绿光激光照射光敏性玫瑰红染料。尽管激光介导的激发最近仍有应用5，但也可由冷光源灯替代，后者同样可确保染料的激发。^10,15冷光源光纤比激光源更易于操作且成本较低。然而应注意，开颅后激光通常用于靶向单个表面小动脉 体内 血管特异性凝血¹⁰.

敏感性染料的递送通常通过尾静脉注射完成，这需要一定的训练才能获得均一且可重复的结果。相比之下，腹腔注射操作更为简便，且玫瑰红染料在注射后几分钟内即可在血液中检测到¹³。有效的光诱导血栓形成可在腹腔注射玫瑰红后5分钟激发染料实现⁸，然而在大鼠中使用高剂量腹腔注射玫瑰红的研究显示，染料的血浆浓度在给药后60分钟内仍持续上升¹³。采用静脉输注方式给予玫瑰红可提高病灶的可重复性¹³，但若输注速度过快（<1.5 分钟）或染料浓度过高，则可能引起低血压⁵。为.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
溶液与化学试剂
玫瑰红（Rose Bengal）	Sigma, 意大利	330000
异氟烷 Vet（Isoflurane Vet）	Merial	103120022
聚维酮碘（Betadine）	Asta Medica
多聚甲醛（Paraformaldehyde）	Sigma-Aldrich	158127
手术材料与设备
Fluosorber 滤光片	Havard 装置	340415
150 W 光纤光源照明器	Photonic	PL3000
板式温度控制器 TCAT-2DF	Havard 装置	727561
立体定位仪	Stoelting	51950
手术显微镜	Takagi	OM8
加热垫
氧气与氮气
手术器械	World Precision Instruments		光纤分路器与面罩为定制