我们设计了一种新型机械负荷生物反应器，可在将软骨生物复合材料移植到关节软骨缺损部位之前，对其施加单轴或双轴机械应变。
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摘要
摘要
我们设计了一种加载装置，能够对用于移植的组织工程复合材料施加单轴或双轴机械应变。该装置主要作为生物反应器，模拟组织所处的天然机械应变环境，同时配备有载荷传感器，可用于提供力反馈或对构建物进行力学测试。该装置可对工程化软骨构建物施加高精度剂量（包括幅度和频率）的双轴机械加载，并且结构紧凑，可置于标准组织培养孵育箱内使用。装置可直接在组织培养板中对样本进行加载，兼容多种规格的培养板。该装置采用专为精密导向激光应用制造的部件设计而成。双轴加载通过两个正交的运动平台实现，每个平台具有50 mm的行程范围，并由步进电机驱动器独立驱动。驱动器具备闭环控制和微步进功能，可实现小于50 nm的步进尺寸。聚砜材质的加载压板与双轴移动平台相连接。平台的运动由Thorlabs高级定位技术（APT）软件控制，该软件与步进电机驱动器配合使用，可独立且同时调节剪切和压缩载荷的频率与幅度参数。位置反馈由线性光学编码器提供，其双向重复精度为0.1 μm，分辨率为20 nm，从而在整个50 mm行程范围内实现小于3 μm的定位精度。这些编码器向驱动电子系统提供必要的位置反馈，以确保真正的纳米级定位能力。为了提供力反馈以检测接触状态并评估加载响应，在加载压板与移动平台之间安装了一个高精度微型载荷传感器。该载荷传感器的满量程精度高达0.15%至0.25%。
引言
我们设计了一种加载式生物反应器，能够对用于移植的组织工程复合材料施加单轴或双轴机械应变。该装置主要作为关节软骨组织工程替代物的生物反应器而设计，也可用于人体其他承重组织。本生物反应器的设计理念源于 Drachman 和 Sokoloff 1，首次观察到因缺乏运动导致麻痹的鸡胚关节软骨出现异常形成。类似地，体育锻炼对正常肌肉和骨骼的发育至关重要。基于这一理念，许多研究团队已探究了不同形式的物理刺激在发育过程中对组织和器官的影响。 体外 培养调控细胞-生物材料复合物及组织外植体的生化与力学特性 2-7功能性组织工程的概念涉及 体外 利用机械刺激增强组织的功能特性， 即 使组织能够承受预期的机械性能 体内 应力与应变 8,9大量研究报道了利用剪切和压缩的力学加载来刺激工程化关节软骨构建物。Mauck 等 10 表明，即使在缺乏通常被认为至关重要的生长因子的情况下，单纯的机械负荷也能诱导间充质干细胞的软骨形成。在组织培养过程中施加间歇性机械负荷（如压缩或剪切力）已被证明可调节软骨和骨的形成，但最佳的负荷剂量因细胞和组织特性而异 11.
关节软骨最重要的功能是能够承受关节内的压缩力和剪切力，因此必须具备较高的压缩模量和剪切模量。工程化软骨因缺乏功能性力学强度和生理性的超微结构，导致新生软骨发生退变破坏。 体内 以及关节内软骨替代策略的失败。尽管压缩和剪切力已被普遍证实可调节并改善关节软骨生物复合物的力学强度，但联合应用这两种力学刺激的方法仍较为罕见。 6,12-15. Wartella 和 Wayne 16 设计了一种生物反应器，可施加拉伸和压缩力以生成半月板软骨替代物。Waldman 等人 15 设计了一种装置，用于对在多孔聚磷酸钙基质中培养的软骨细胞施加压缩和剪切力。Bian 等. 17 表现出与天然软骨相匹配的力学性能 体外 成年犬软骨细胞在凝胶中的培养及双轴力学加载（压缩变形加载与滑动接触加载）的应用。
双轴力学加载生物反应器最初由我们实验室的 Danielle Chu 设计，其总体目标是诱导组织工程软骨构建物发生形态学适应，从而获得比现有材料更高的压缩模量和剪切模量18。我们相信，这项研究将显著增进我们对如何调控机械转导以工程化临床相关组织的深入理解。
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方案
1. 双轴加载生物反应器设计
- 该生物反应器采用 Thor-labs 公司（Newton, MA）生产的两个运动平台，专为精密激光导向应用设计，可对工程化组织施加单轴或双轴机械应变，具有精确的加载剂量（振幅和频率）控制能力，并适用于从单孔到24孔板等多种组织培养条件（图1）。
- 双轴加载由两个 TravelMax 平台（LNR50SE）实现。这两个平台以正交方式安装，构成XZ方向配置。水平平台通过沿X轴振荡提供动态剪切运动，垂直平台通过沿Z轴振荡提供动态压缩加载。这些平台具有50 mm的行程范围，由步进电机驱动器（DRV014）独立驱动，并通过具备微步进功能的闭环步进电机控制器（BSC102）进行控制，可实现小于50 nm的步长精度。
- 设备安装在一块刚性铝制基板上，尺寸为25 cm × 30 cm × 12.5 mm，作为机械部件组装平台以及组织培养板的安装基座。采用可调节的运动学限位装置将组织培养板固定在铝基板上。这些限位装置配有微调螺钉，可实现手动无法达到的精确定位。基板的模块化设计允许灵活布置这些限位装置，以适应不同尺寸和形状的培养板（如培养皿与多孔板）。
- 一块定制加工的聚砜加载压头通过精密加工的直角支架连接至双轴移动平台。选用聚砜材料是因为其具有良好的生物相容性、易于加工以及易于灭菌的特点。
- 平台的运动由 Thor-labs 公司的高级定位技术（APT）软件进行控制。步进电机驱动器与该软件配合使用，可独立且同时调节剪切和压缩载荷的频率与振幅参数。
- 每个移动平台均配备线性光学编码器，提供位置反馈，并与控制软件集成。该编码器系统的双向重复精度为0.1 μm，分辨率为20 nm，在整个50 mm行程范围内可实现小于3 μm的位置精度。这些编码器向驱动电子系统提供必要的位置反馈，确保真正的纳米级定位能力，并直接输出绝对位置读数。
- 为实现对压头与样品接触的检测及加载响应的评估所需的力反馈，在加载压头与移动平台之间安装了一个精密微型测力传感器（Honeywell 型号 31）（图2）。该测力传感器的全量程精度高达0.15%至0.25%。其显示单元（SC500）可提供最多五位小数的载荷测量值，并配有RS-232接口，便于在计算机上进行数据采集。
2. 细胞接种的琼脂糖构建物
- 制备 4% 琼脂糖：在 50 ml 锥形瓶中，将 0.8 g 琼脂糖加入 20 ml DMEM（无添加剂）中，煮沸，随后置于 70 °C 烤箱中保温备用。
- 调整细胞悬液体积，使其为所需接种细胞密度的两倍体积。将此细胞悬液与等体积的 4% w/v 琼脂糖混合，以获得含有目标接种密度的 2% 琼脂糖凝胶。
- 将细胞悬液和一支 10 ml 移液管一同放入培养箱中预温。
- 组装凝胶浇铸系统。将一块 1.5 mm 和一块 0.75 mm 间隔板叠放，形成厚度为 2.25 mm 的凝胶。也可使用其他尺寸的间隔板以制备不同厚度的凝胶。由于凝胶浇铸系统本身无法牢固固定这些板，必须用胶带将其严密固定，以防泄漏。
- 下一步需在琼脂糖凝固前迅速将细胞悬液与预先制备的琼脂糖混合，并移入凝胶模具中。从烤箱中取出液态琼脂糖，插入无菌温度计。琼脂糖必须冷却至 42–43 °C 后方可与细胞混合。同时将细胞悬液升温至 37 °C。当琼脂糖温度降至 43 °C 时，迅速吸取所需体积的琼脂糖，立即吸取细胞悬液并上下吹打数次以充分混匀，随后立即将全部混合液移入凝胶模具中。
- 静置凝胶 10–15 分钟使其固化，然后小心地将模具倾斜至水平位置。
- 移除顶部玻璃板，使用活检打孔器打取凝胶圆片。可用无菌小刮勺小心挑取圆片。根据我们的经验，9 ml 凝胶足以制备超过一百个直径为 5 mm 的圆片。
3. 培养组织块
- 在24孔非组织培养处理板的每个孔中放入一个圆盘。
- 向每个孔中加入2 ml无血清软骨诱导分化培养基。
- 将培养板放入培养箱（37 °C，5% CO2）中。
- 更换培养基时，每隔2-3天每孔更换1 ml。
4. 机械加载样品的固定
- 制备4%琼脂糖（不添加细胞悬液），其厚度应薄于待测样品本身（以防止加样时产生干扰）。推荐厚度为1.5–1.9 mm（适用于2.25 mm厚的样品）。
- 琼脂糖凝固后，为24孔板打孔，制备直径16 mm的琼脂糖圆片。在每个圆片中央打一个直径5 mm的孔，用于放置样品。如需更换培养基时便于移液操作，可在圆片边缘再打一个直径5 mm的孔，用于放置移液枪头。
- 制备好琼脂糖小室后，将其放入24孔板中，如图3所示。
- 将琼脂糖小室置于24孔板中后，将样品压入每个小室中，样品应从琼脂糖小室顶部突出。
5. 机械加载
- 对压头进行灭菌（图 2）。
- 将铝板固定到载荷传感器上。将压头/载荷传感器/铝板组件固定到载物台上。
- 打开步进电机控制器（背面开关）。
- 启动计算机并打开“APT User”程序（图 4）。
- 左屏幕控制水平方向的步进电机，右屏幕控制垂直方向的步进电机。在每个屏幕中，“图形控制”选项卡用于手动定位，“运动序列”选项卡用于自动化操作。所有单位均为 mm。
- 在两个屏幕中均进入“图形控制”选项卡，然后按下“回零/归零”按钮。两个步进电机的行程范围均为 50 mm。按下“回零/归零”按钮后，两个步进电机会移动至零位（最上端和最右端位置）。
- 准备 24 孔板中的样品，通过从每个孔中移除部分培养基来进行加样前处理。每个孔中残留的培养基不应超过 1 ml，以防止加样过程中溢出。同时确保每个孔中保留足够的培养基以完全覆盖样品。
- 注意：为防止仪器故障，培养箱应保持在低湿度环境中。
- 将 24 孔板放入生物反应器中，并小心地与压头对齐。
- 使用四个可调节的运动学定位器将板固定在生物反应器上。为便于压头对齐，左侧两个定位器已预先定位。拧紧右侧两个定位器以固定板，并确保板与生物反应器底座前缘齐平。
- 在“图形控制”选项卡中，可通过单击位置框手动输入特定的步进电机位置。利用此功能缓慢降低压头并水平移动，以与板对齐。
- 当压头接近样品时，开始以极小的步长（0.1 mm）逐步下移，直至达到预设的起始位置（见第 6 部分）。
- 到达起始位置后，切换至“运动序列”选项卡，通过点击“加载”按钮载入所需的运动序列，然后点击“运行”开始实验（图 5）。参见第 7 部分：编写给药程序。
- 完成加样后，手动抬高压头。若任何样品粘附在压头上，应使用无菌刮铲小心将其放回相应的孔中。
- 从生物反应器中取出 24 孔板并更换培养基。
- 小心地将压头从载荷传感器上卸下，然后关闭仪器。
6. 校准加载压头
为确保将正确的菌株应用于样品，每次实验开始前必须对每个压板进行仔细校准。
- 执行步骤 5.1 至 5.8。
- 手动将水平步进电机置于 25 mm 位置。
- 小心降低压板，直至其刚好与生物反应器底部接触。此时载荷传感器将显示载荷增加。记录垂直步进电机的精确位置（应尽可能精确，因为所有压缩应变测量值都将基于此数值计算）。
- 记录该位置。此数值将用于根据样品尺寸和目标应变编写给料程序。
7. 撰写给药方案
- 该生物反应器能够同时或单独施加压缩应变和剪切应变。必须确定三个主要参数：预载压缩应变、动态应变幅值和加载频率。
- 施加预载应变是为了防止压头从样品上抬起。
- 选择样品的动态应变幅值和加载频率。
本研究中，我们将压缩应变和剪切应变定义如下：
示例双向给药方案
样品厚度：2.25 mm
预载应变（压缩）：样品厚度的10%（0.225 mm）
动态应变振幅（压缩）：10%（±样品厚度的5%）
频率（压缩）：1 Hz
动态应变振幅（剪切）：样品厚度的25%（0.5625 mm）：剪切应力为
由平板水平移动施加到样品上。
频率（剪切）：0.5 Hz
典型的给药方案为每天3小时的负荷期。
在此示例中，动态载荷和剪切载荷是同时施加的，而非依次施加。我们认为这种加载模式能更好地模拟人体膝关节内的复杂受力环境。
- 选定给药方案后，必须编写一个压缩运动序列程序。
- 运动序列正如其名，即步进电机在指定加速度和最大速度下所要移动到的一系列位置列表。
- 根据给药方案和压板校准值（来自第6部分）计算所需的垂直位置。
- 以下提供了压板1的示例计算：
| 与校准值的差值 | 垂直位置 | |
| 压板校准值（接触生物反应器底部） | 0 mm | 29.7700 mm |
| 压板接触样品时（样品厚度为 2.25 mm） | 4.4140 mm | 25.3560 mm |
| 应变（厚度的 5%） | 4.3015 mm | 25.4705 mm |
| 应变（厚度的 10%） | 4.1890 mm | 25.5810 mm |
| 应变（厚度的 15%） | 4.0765 mm | 25.6955 mm |
- 位置计算完成后，通过调整加速度和最大速度值来获得正确的频率。相应地，应选择合适的循环次数（例如 10,800 个循环，1 Hz，持续 3 小时。
- 示例动态压缩运动序列程序（10% 预压缩，10% 动态应变幅度，1 Hz）图5)
- 动态剪切运动序列程序：循环次数应根据所需的频率和持续时间进行选择（例如 5,400 个循环，0.5 Hz，持续 3 小时。
- 示例动态剪切位移序列程序（10% 预压缩，0.5625 mm（厚度的25%）动态剪切应变振幅，0.5 Hz）图5).
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结果
通过使用接种了2000万个细胞/ml软骨细胞的琼脂糖凝胶，并在单轴（压缩）或双轴（压缩和剪切）力学负荷条件下培养，对装置进行了测试。原代猪软骨细胞从2至4月龄猪的关节软骨中分离获得。直径5 mm、厚度1.5 mm的样品在24孔板中培养，每孔加入2 ml明确定义的软骨诱导培养基（高糖DMEM，1% ITS+ Premix，100 U/ml青霉素，100 μg/ml链霉素，2 mM L-谷氨酰胺，2.5 μg/ml两性霉素B，50 μg/ml抗坏血酸，0.1 mM非必需氨基酸（NEAA），0.4 mM脯氨酸），培养条件为37 °C、5% CO2。在培养的前10天中添加10-7 M地塞米松和10 ng/ml TGF-β1。样品在培养第10至30天期间每天加载3小时。单轴加载参数为10%压缩峰-峰值振幅、1 Hz；双轴加载参数为0.15 mm（厚度的10%）压缩和0.075 mm剪切峰-峰值振幅、1 Hz。动态应变振幅和加载频率的选择依据已发表的研究17,19。在培养30天结束时，评估了工程化软骨的生化和力学性能。
本研究采...
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讨论
我们设计了一种加载装置，能够对用于移植的组织工程构建物施加单轴或双轴机械应变。该装置可作为生物反应器使用 体外 工程化生物复合材料的培养，或作为测试装置用于描述天然组织或其他处理前后的力学特性。该装置可对工程化组织构建体施加双轴机械载荷，载荷剂量（振幅和频率）控制精确，并可适用于从单孔到24孔板的多种组织培养条件。
施加剪切载荷为此系统的构建带来了一系列独特的挑战。为了最大化营养物质的传递，最初将构建物置于24孔板的各个孔中且未加约束。这对于动态压缩并不构成问题，因为预设的压缩应变可确保样品与压头之间的接触不会丧失。然而，当在实验方案中加入剪切应变后，未受约束的样品会在孔板底部滑动，部分样品甚至与压头失去接触。此外，在双轴加载方案中，样品容易发生翻转，导致加载不一致。我们通过制备琼脂糖微孔来固定样品，从而解决了这一问题，具体操作如文中所述。这些琼脂糖微孔可在不影响样品营养供应的前提下，实现样品的稳定双轴加载。
与被广泛研究的压缩式生物反应器20,21不同，我们的装置能够在多个轴向上施...
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
本研究由美国退伍军人事务部研究与发展办公室（RR&D 服务）、美国国立卫生研究院 COBRE 1P20RR024484、美国国立卫生研究院 K24 AR02128 以及美国国防部 W81XWH-10-1-0643 项目资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 试剂 | |||
| DMEM，高糖，丙酮酸钠 | Invitrogen | 11995 | |
| 琼脂糖 II 型 | Sigma | CAS 39346-81-1 | |
| 青霉素-链霉素-谷氨酰胺 100X | Invitrogen | 10378-016 | |
| ITS+ 预混液 | BD Biosciences | 354352 | |
| 青霉素-链霉素-谷氨酰胺 | Invitrogen | 10378-016 | |
| 两性霉素 B | Invitrogen | 041-95780 | |
| 抗坏血酸 | Sigma | A-2218 | |
| 非必需氨基酸溶液 100x | Sigma | M-7145 | |
| L-脯氨酸 | Sigma | P-5607 | |
| 地塞米松 | Sigma | D-2915 | |
| 重组人转化生长因子 β1 | R&D Systems | 240-B-010 | |
| 设备 | |||
| 31 型载荷传感器（1000 g） | Honeywell | AL311 | |
| 31 型载荷传感器（1000 g） | Honeywell | AL311 | |
| 单通道显示器 | Honeywell | SC500 | |
| 带步进执行器的 50 mm 线性编码 Travelmax 平台 | Thorlabs | LNR50SE/M | |
| 双通道步进电机控制器 | Thorlabs | BSC102 | |
| 50 mm 梯形步进电机驱动器（2 个） | Thorlabs | DRV014 | |
| 可调式运动学定位器（4 个） | Thorlabs | KL02 | |
| 精密直角板 | Thorlabs | AP90/M | |
| 垂直安装支架 | Thorlabs | LNR50P2/M | |
| 实心铝制光学平台板 | Thorlabs | MB3030/M | |
| 凝胶制备系统，含 1.5 mm 和 0.75 mm 间隔板 | BioRad | #1653312 和 #1653310 | |
| 一次性活检打孔器，5 mm | Miltex, Inc. | 33-35 | |
| 16 mm 空心打孔器 | Neiko Tools | ||
| 非组织培养处理的 24 孔平底板 | BD Biosciences | 351147 | |
| 超防潮聚砜片（用于加载压头） | McMaster-Carr | 86735k19 | 定制加工 |
参考文献
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