利用高通量微孔板法测定水体、土壤和沉积物中微生物胞外酶活性

摘要

本文描述了基于微孔板的胞外酶活性比色法或荧光法分析流程。这些方法可在合理的时间范围内，对大量环境样品中的酶活性进行快速测定。

摘要

自然环境中大部分的养分循环和碳素转化过程是通过微生物释放的胞外酶活性实现的。因此，测定这些胞外酶的活性可以揭示生态系统层面过程的速率，例如有机质分解、氮和磷的矿化作用。环境样品中胞外酶活性的测定通常涉及将样品暴露于人工比色或荧光底物，并追踪底物水解的速率。本文描述了基于微孔板的方法，可实现短时间内对大量样品进行分析。样品在96孔微孔板或深孔微孔板中与人工底物发生反应，随后通过常规微孔板读数仪或荧光计检测反应终产物的吸光度或荧光强度，从而确定酶活性。这类高通量方法不仅有助于对空间上相隔的不同地点或生态系统进行比较，还通过显著减少每个样品所需的试剂总体积，大幅降低了测定成本。

引言

细菌和真菌等微生物通过产生胞外酶，从复杂的有机化合物中获取营养物质和碳源。这些酶通常将聚合物水解为较小的亚单位，以便细胞吸收。因此，在生态学层面，这些微生物胞外酶负责了自然环境中大部分的养分矿化和有机物分解过程。纤维二糖水解酶（CBH）和β-葡萄糖苷酶在纤维素降解过程中起重要作用，它们协同催化纤维素水解为葡萄糖^1,2，从而为微生物的吸收与同化提供可利用的碳源。磷酸酶能从有机磷酸酯中释放出可溶性的无机磷酸根，实质上实现了磷的矿化，使其可供大多数生物利用³。其他酶类，如N-乙酰氨基葡萄糖苷酶（NAGase），在几丁质降解中具有重要作用，能够释放碳和氮，供微生物获取利用⁴。

自然环境中微生物胞外酶活性检测的方法之一是使用人工底物 p-硝基苯基（p与纳米颗粒（NP）偶联的底物，该方法最初用于检测土壤磷酸酶活性⁵该方法依赖于对有色终产物的检测， p-硝基苯酚，当人工底物被相应酶水解时会释放该产物。 p硝基苯酚可通过在约400-410 nm处测量其吸光度进行比色定量。该方法随后已被用于检测其他酶，如NAGase。⁶，并已用于多种研究中，以检测土壤和沉积物中微生物胞外酶活性^7-9.

一种最初用于评估水生环境中胞外糖苷酶活性的替代方法^10,11 采用了与4-甲基伞形酮（MUB）连接的底物。反应释放的终产物（4-甲基伞形酮）具有强荧光性，可使用激发/发射波长约为360/460 nm的荧光计进行检测。目前已有多种MUB标记的人工底物，使得至少可检测与使用pNP-底物比色法相当数量的酶活性（例如 β-葡萄糖苷酶、纤维二糖水解酶、N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶、磷酸酶）。其他微生物胞外酶，如降解蛋白质的亮氨酸氨肽酶，也可利用与7-氨基-4-甲基香豆素（COU）连接的底物通过荧光法进行测定。MUB和COU标记的底物均已用于测定多种陆地和水环境样品中的酶活性^12,13。

尽管以往的研究已描述了采用荧光法或比色法微孔板方法来测定胞外酶活性¹⁴，但仍需要清晰地展示此类测定实验的具体操作流程。本文演示了使用比色法pNP标记底物测定土壤和沉积物中胞外酶活性，以及使用荧光MUB标记底物测定天然水体中胞外酶活性的高通量微孔板技术。我们重点关注β-葡萄糖苷酶、N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶（NAGase）和磷酸酶活性的测定，因为这些酶分别与碳、氮和磷的循环密切相关。然而，本文所述方法也可通过使用其他人工底物，应用于其他胞外酶活性的测定。

方案

土壤和沉积物中胞外酶活性的比色分析

1. 酶活性比色分析用底物和缓冲溶液的制备

1. 通过混合以下成分制备 50 mM 乙酸盐缓冲液（pH 5.0–5.5）：50 ml 0.1 M 乙酸（将 2.87 ml 冰乙酸溶于 500 ml 水中）、150 ml 0.1 M 乙酸钠和 200 ml 蒸馏水 H₂O₂O. 如有需要，用 0.1 M 乙酸将 pH 调至 5.0–5.5。
2. 配制1 M氢氧化钠（NaOH）的蒸馏水溶液₂O.
3. 准备 p50 mM 乙酸盐缓冲液中的 NP-偶联底物溶液。为检测磷酸酶，配制 5 mM p50 mM 乙酸盐缓冲液中的NP-磷酸盐；用于检测 β-葡萄糖苷酶，配制5 mM pNP-β-葡萄糖吡喃糖苷；为检测NAG酶活性，配制2 mM pNP-β-N-乙酰氨基葡萄糖苷。所有底物溶液均应在无菌的15 ml或50 ml离心管中配制。溶液可于4℃保存 °2-3 周，4°C

2. 确定将吸光度转换为标准的换算标准 pNP 浓度

1. 配制标准溶液 p50 mM 乙酸盐缓冲液中的硝基苯酚。浓度范围应为 0.025–1 mM。
2. 转移三份100 μ将各浓度溶液各取 l 加入透明 96 孔微孔板中。加入 10 μ1 M NaOH 和 190 μl 蒸馏水₂O至每孔。
3. 使用酶标仪在410 nm处记录吸光度。
4. 将标准曲线中的浓度乘以 0.3 以获得 μ摩尔 pNP 每 300 μl 反应体积。绘制吸光度随浓度变化的曲线。 μ摩尔 pNP。曲线的斜率作为转换因子（C），用于关联吸光度与 μ摩尔 p每次酶反应中的 NP。

3. 进行酶活性测定

1. 对于土壤样品，在无菌的15 ml离心管中制备每份待测样品的悬液，浓度约为1 g/ml^-1 使用50 mM乙酸盐缓冲液。对于沉积物，加入足量的乙酸盐缓冲液，使其成为易于移液的浆液。所需浆液的准确体积取决于所测定的酶种类数量，但建议最少使用5 ml。涡旋振荡每份浆液，直至土壤或沉积物中的所有团块完全分散，并记录最终体积。
2. 重新涡旋每种悬液，并立即用移液器吸取150 μl 加入至 96 孔深孔板的六个孔中（图1）。为保持土壤颗粒悬浮，必须充分且频繁地涡旋振荡。每个板块至少留出两个孔作为空白底物对照。注意：由于土壤悬液容易堵塞吸头，在移液前需用剪刀剪去移液器吸头的尖端。每种待测酶需准备一个96孔板。
3. 将约 5 ml 醋酸盐缓冲液倒入多通道移液器储液槽中，使用 8 通道移液器加入 150 μ将缓冲液加入每个样本的最后两个孔（这些孔作为样本缓冲液对照）以及两个底物对照孔图1)
4. 加入约10 ml相应的 p将NP-底物溶液加入移液管储液槽中，并使用8通道移液器加入150 μ将底物溶液加入每个样本的前四个孔以及两个底物对照孔中（图1记录时间，因为加入底物溶液后反应立即开始。
5. 在室温（22 ℃）下孵育培养板 °C）孵育0.5–4小时。确切的孵育时间将根据样品中酶的活性水平及待测酶的种类而有所不同。对于大多数土壤和沉积物，磷酸酶和 β-葡萄糖苷酶需要0.5–1.5小时的孵育时间，而NAG酶及其他酶则需要孵育时间 >2 小时
6. 孵育检测反应的同时，准备透明的96孔微孔板用于测定吸光度。每个深孔板对应准备一块微孔板。即 （针对每种测定的酶）。用移液器加入10 μ1 M NaOH 和 190 μ将适量蒸馏水加入微孔板的每个孔中。注意：NaOH 会减缓酶促反应，同时提高 pH，从而增强显色效果 p反应过程中释放的NP。
7. 孵育后，以2,000–5,000 × g离心96孔板5分钟，使土壤颗粒沉淀。
8. 使用多通道移液器吸取 100 μ从每个孔中小心吸取上清液，避免触及沉淀物，并将其转移至已准备好的透明96孔微孔板中对应的孔内。
9. 打开酶标仪并设置必要的软件。在410 nm波长下测定吸光度。如果某个孔的吸光度超过酶标仪的线性检测范围，用纯水对该孔样品进行1:1稀释后重新测定。若吸光度仍然过高，则应缩短孵育时间后重新进行检测。

4. 样品干重的测定

1. 用移液器将每种样品悬液各1 ml加入已预先称重的铝盘中。
2. 在75 °C的干燥箱中干燥48小时，然后称重。从该重量中减去铝盘的重量，得到1 ml悬液中土壤或沉积物的干重。将此值乘以0.15的系数，以确定在酶活性测定中加入每个孔的150 μl样品中的干重。

5. 每克土壤或沉积物干重的酶活性计算

1. 通过从样品检测吸光度中减去样品对照吸光度，计算每个样品的最终吸光度。如果底物对照的吸光度较高（大约 >0.060），也需减去其吸光度。
2. 根据以下公式计算酶活性，单位为 μmoles hr^-1 g 干重^-1：

酶活性 = 最终吸光度 / (C × 孵育时间 × 样品干重)

天然水体中胞外酶活性的荧光分析

1. 酶活性荧光分析用底物、标准品和缓冲液溶液的制备

1. 制备 200 μMUB连接底物的M溶液（例如 4-MUB-β-葡萄糖吡喃糖苷，4-MUB-磷酸盐，4-MUB-N-乙酰基β-D-葡萄糖胺）溶解于无菌（高压灭菌）蒸馏H₂在无菌的15 ml或50 ml离心管中。用铝箔包裹管子以避光，并在使用前冷藏保存。若按此方式储存，底物至少可保持稳定1周。
2. 通过配制100的储备液来制备MUB标准品 μ无菌蒸馏水中的4-甲基伞形酮₂O. 储存于棕色瓶或铝箔包裹的瓶中，冷藏。使用前立即稀释100 μ将 M 储备液按 1/10 比例稀释至无菌 H₂O 以配制 10 的工作液 μ用于酶活性测定的 M。
3. 通过将 8.4 g NaHCO₃ 溶于水中，配制 100 mM 碳酸氢盐缓冲液的储备液。₃ 到 1 L H₂O 和高压灭菌。将该储备液按 1/20 比例稀释至无菌 H₂必要时加入 O，配制 5 mM 的工作液用于酶活性测定。

2. 在96孔黑色微孔板中排列水样

1. 按照 图2 所示示例，为每种酶准备一块微孔板。请注意，考虑到足够的重复、标准品和对照，本实验方法可在一块96孔黑色微孔板上同时检测一种酶在多达九个水样中的活性。
2. 将第一个样品约5 ml倒入移液槽中，使用8通道移液器将200 μl样品加入微孔板中第1列的所有孔内。丢弃已使用的吸头，并根据需要为每个水样重复操作，依次填充第1至第9列。

3. 设置样品、标准品、淬灭和底物对照

1. 在同一块黑色微孔板上设置对照，以同时考虑样品、标准品、底物和淬灭的影响（图2）。
2. 样品对照包含样品水和碳酸氢盐缓冲液，不用于活性计算，但可用于评估整个实验过程中读数的一致性。淬灭对照由样品水和固定量的荧光标记物组成，用于测量样品水中荧光的散射情况。底物对照和标准品对照则分别由底物连接的荧光标记物或标准荧光标记物与碳酸氢盐缓冲液组成。
3. 将约5 ml的5 mM碳酸氢盐缓冲液倒入洁净的移液槽中。用移液器向D行和E行的第1至第9号孔中各加入50 μl缓冲液，为每个样品设置两个重复的样品对照孔。更换移液器吸头后，向A行和H行的第10至第12号孔中各转移200 μl碳酸氢盐缓冲液。
4. 调暗或关闭光源以降低环境光照，因为荧光标准品对光敏感。
5. 将约5 ml的10 μM 4-甲基伞形酮（4-methylumbelliferone）倒入洁净的移液槽中。用移液器向H行的第1至第12号孔以及G行和F行的第1至第9号孔中各加入50 μl，为每个样品设置三个重复的淬灭对照孔，并设置总体标准品对照。将微孔板置于避光环境中或用不透光盖板覆盖，以减少MUB的光降解。
6. 打开荧光计，并设置好必要的软件，确保在加入底物前已准备就绪，可立即进行读数。注意：某些荧光计灯泡可能需要3分钟或更长时间的预热。
7. 将约5 ml适当种类的MUB连接底物（例如 4-MUB-磷酸盐）倒入洁净的移液槽中。使用12通道移液器向A行的第1至第12号孔以及B行和C行的第1至第9号孔中各加入50 μl，为每个样品设置三个重复检测孔，并设置三个底物对照孔。随后立即进入步骤4.1，开始记录荧光值。

4. 荧光记录

1. 在向微孔板中加入底物后，立即读取初始荧光值。读取荧光值后，将微孔板在室温（22 °C）下避光孵育，或用不透光的盖子覆盖，以减少MUB的光降解。
2. 测定水样中最大潜在酶活性所需的孵育时间取决于样品中酶的浓度。由于在完成检测前该浓度未知，因此需要在多个时间点读取微孔板。通常情况下，对于许多酶而言，在1小时内每隔10-15分钟读数一次是可接受的，但对于某些酶活性极高的样品，可能在10分钟内即达到峰值。
3. 按照设定的时间间隔持续读取微孔板中的荧光值，至少持续1小时。两次读数之间务必保持微孔板处于覆盖状态或避光保存。

5. 每单位体积水中酶活性的计算

1. 在每个时间点，针对每个样本计算以下指标：初始样本荧光均值（D和E孔）、最终样本荧光均值（A-C孔）、标准荧光均值（H10-11孔）以及淬灭对照荧光均值（F-G孔）。
2. 在每个时间点，根据以下公式计算酶活性，单位为nmoles hr^-1 ml^-1：

酶活性 = (样品平均荧光值 - 样品初始平均荧光值) / ((标准品平均荧光值 / 0.5 mol) × (淬灭对照平均荧光值 / 标准品平均荧光值) × (0.2 ml) × (反应时间，单位为小时))

3. 检查每个时间步长计算出的活性值。根据活性最高的时间步长确定最终潜在活性。如果活性值持续上升，则可能需要更晚的时间点；如果活性值在运行过程中持续下降，则应使用更短的时间步长重新运行实验。最终活性单位为每小时每毫升消耗的纳摩尔底物（nmoles hr^-1 ml^-1），但可换算为每小时每升消耗的微摩尔（μmoles hr^-1 L^-1）来表示。

结果

土壤和水体沉积物通常具有显著的胞外酶活性，这是由于微生物群落（生物膜）附着在颗粒表面生长所致。图3展示了从美国密西西比州北部一条三级溪流表层沉积物中获取的不同粒径颗粒上，这种酶活性如何随颗粒大小而变化。先前一项研究表明，通过对群落结构进行分子分析，可将该溪流沉积物颗粒上的细菌群落分为三个明显不同的类群：附着在0.063 mm颗粒上的群落、附着在0.125、0.25和0.5 mm颗粒上的群落，以及附着在1 mm颗粒上的群落¹⁵。胞外酶活性分布模式的分析支持了这一结论；使用pNP标记底物法测定时，磷酸酶活性（图3A）在0.125、0.25和0.5 mm颗粒上相近，但在1 mm和0.063 mm组分上显著更高。其他酶类如β-葡萄糖苷酶（图3B）和N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶（NAGase，图3C）在最细颗粒上也表现出类似的活性峰值，但在1 mm颗粒上并未升高，这表明不同酶类可能具有不同的环境分布特征，而本实验方法有助于揭示这些差异。相对较小的误差棒表明，对沉积物中酶活性...

讨论

测定土壤和沉积物中多种微生物胞外酶的活性，可为养分矿化速率和有机质降解过程提供有价值的见解¹⁷。然而，土壤的含水量可能存在差异，因此有必要将酶活性标准化为土壤干重。这需要在测定酶活性的基础上额外增加一个干燥步骤（通常为两天）。因此，与能够快速获得结果的水样酶活性检测不同，土壤和沉积物中酶活性的可靠测定通常需要数天时间。对于某些土壤，以每克有机质或无灰干重表示酶活性可能更为合适，这就需要在干燥步骤之外再增加一个灰化步骤（通常为500 °C下灼烧2小时）。无论采用何种表示方式，土壤或沉积物酶活性比色测定中最关键的步骤是在孵育结束后，通过离心使深孔板中的样品沉降，然后从深孔板中吸取上清液。由于该方法依赖吸光度测定，最终微孔板中即使存在少量游离土壤颗粒，也可能导致错误结果。提高离心速度（>5,000 × g）可能有助于缓解这一问题，但根据我们的经验，能够容纳微孔板的离心机转子通常旋转速度上限低于该值，且深孔板本身可能无法耐受更高的转速。因此，这一特定的移液步骤需要操作者兼顾谨慎与速度，使用多通道移液器迅速将所需量的上清液从深孔板转移至微孔板中。

水样中胞外酶活性...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂与材料
冰乙酸			多家供应商
乙酸钠			多家供应商
氢氧化钠			多家供应商
p-硝基苯酚	Fisher	BP612-1	可选用其他替代品
p-硝基苯基（pNP）-磷酸盐	Sigma	N3234	pNP-底物
pNP-β-葡萄糖苷	Sigma	N7006	pNP-底物
pNP-β-N-乙酰氨基葡萄糖苷	Sigma	N9376	pNP-底物
透明96孔微孔板	Fisher	12-563-301	可选用其他替代品
96孔深孔板	Costar	3958	可选用其他替代品
铝制称量盘			多家供应商
无菌15 ml离心管			多家供应商
无菌50 ml离心管			多家供应商
4-甲基伞形酮	Sigma	M1381
4-甲基伞形基（MUB）-磷酸盐	Sigma	M8883	MUB-底物
4-MUB-葡萄糖苷	Sigma	M3633	MUB-底物
4-MUB-N-乙酰氨基葡萄糖苷	Sigma	M2133	MUB-底物
碳酸氢钠			多家供应商
黑色96孔微孔板	Costar	3792
移液管储液槽			多家供应商
仪器
离心机	Eppendorf	5810R
离心机转子	Eppendorf	A-4-81	适用于微孔板/深孔板
微孔板读板仪	BioTek	Synergy HT	可选用其他替代品
微孔板荧光计	BioTek	FLx 800	可选用其他替代品
8通道移液器			多家供应商