利用高通量微孔板法测定水体、土壤和沉积物中微生物胞外酶活性

摘要

本文描述了基于微孔板的胞外酶活性比色法或荧光法分析流程。这些方法可在合理的时间范围内，对大量环境样品中的酶活性进行快速测定。

摘要

自然环境中大部分的养分循环和碳素转化过程是通过微生物释放的胞外酶活性实现的。因此，测定这些胞外酶的活性可以揭示生态系统层面过程的速率，例如有机质分解、氮和磷的矿化作用。环境样品中胞外酶活性的测定通常涉及将样品暴露于人工比色或荧光底物，并追踪底物水解的速率。本文描述了基于微孔板的方法，可实现短时间内对大量样品进行分析。样品在96孔微孔板或深孔微孔板中与人工底物发生反应，随后通过常规微孔板读数仪或荧光计检测反应终产物的吸光度或荧光强度，从而确定酶活性。这类高通量方法不仅有助于对空间上相隔的不同地点或生态系统进行比较，还通过显著减少每个样品所需的试剂总体积，大幅降低了测定成本。

引言

细菌和真菌等微生物通过产生胞外酶，从复杂的有机化合物中获取营养物质和碳源。这些酶通常将聚合物水解为较小的亚单位，以便细胞吸收。因此，在生态学层面，这些微生物胞外酶负责了自然环境中大部分的养分矿化和有机物分解过程。纤维二糖水解酶（CBH）和β-葡萄糖苷酶在纤维素降解过程中起重要作用，它们协同催化纤维素水解为葡萄糖^1,2，从而为微生物的吸收与同化提供可利用的碳源。磷酸酶能从有机磷酸酯中释放出可溶性的无机磷酸根，实质上实现了磷的矿化，使其可供大多数生物利用³。其他酶类，如N-乙酰氨基葡萄糖苷酶（NAGase），在几丁质降解中具有重要作用，能够释放碳和氮，供微生物获取利用⁴。

自然环境中微生物胞外酶活性检测的方法之一是使用人工底物 p-硝基苯基（p与纳米颗粒（NP）偶联的底物，该方法最初用于检测土壤磷酸酶活性⁵该方法依赖于对有色终产物的检测， p-硝基苯酚，当人工底物被相应酶水解时会释放该产物。 p硝基苯酚可通过在约400-410 nm处测量其吸光度进行比色定量。该方法随后已被用于检测其他酶，如NAGase。⁶，并已用于多种研究中，以检测土壤和沉积物中微生物胞外酶活性^7-9.

一种最初用于评估水生环境中胞外糖苷酶活性的替代方法<....

方案

土壤和沉积物中胞外酶活性的比色分析

1. 酶活性比色分析用底物和缓冲溶液的制备

1. 通过混合以下成分制备 50 mM 乙酸盐缓冲液（pH 5.0–5.5）：50 ml 0.1 M 乙酸（将 2.87 ml 冰乙酸溶于 500 ml 水中）、150 ml 0.1 M 乙酸钠和 200 ml 蒸馏水 H₂O₂O. 如有需要，用 0.1 M 乙酸将 pH 调至 5.0–5.5。
2. 配制1 M氢氧化钠（NaOH）的蒸馏水溶液₂O.
3. 准备 p50 mM 乙酸盐缓冲液中的 NP-偶联底物溶液。为检测磷酸酶，配制 5 mM p50 mM 乙酸盐缓冲液中的NP-磷酸盐；用于检测 β-葡萄糖苷酶，配制5 mM pNP-β-葡萄糖吡喃糖苷；为检测NAG酶活性，配制2 mM pNP-β-N-乙酰氨基葡萄糖苷。所有底物溶液均应在无菌的15 ml或50 ml离心管中配制。溶液可于4℃保存 °2-3 周，4°C

2. 确定将吸光度转换为标准的换算标准 pNP 浓度

1. 配制标准溶液 p50 mM 乙酸盐缓冲液中的硝基苯酚。浓度范围应为 0.025–1 mM。
2. 转移三份100 ....

结果

土壤和水体沉积物通常具有显著的胞外酶活性，这是由于微生物群落（生物膜）附着在颗粒表面生长所致。图3展示了从美国密西西比州北部一条三级溪流表层沉积物中获取的不同粒径颗粒上，这种酶活性如何随颗粒大小而变化。先前一项研究表明，通过对群落结构进行分子分析，可将该溪流沉积物颗粒上的细菌群落分为三个明显不同的类群：附着在0.063 mm颗粒上的群落、附着在0.125、0.25和0.5 mm颗粒上的群落，以及附着在1 mm颗粒上的群落¹⁵。胞外酶活性分布模式的分析支持了这一结论；使用pNP标记底物法测定时，磷酸酶活性（图3A）在0.125、0.25和0.5 mm颗粒上相近，但在1 mm和0.063 mm组分上显著更高。其他酶类如β-葡萄糖苷酶（图3B）和N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶（NAGase，图3C）在最细颗粒上也表现出类似的活性峰值，但在1 mm颗粒上并未升高，这表明不同酶类可能具有不同的环境分布特征，而本实验方法有助于揭示这些差异。相对较小的误差棒表明，对沉积物中酶活性.......

讨论

测定土壤和沉积物中多种微生物胞外酶的活性，可为养分矿化速率和有机质降解过程提供有价值的见解¹⁷。然而，土壤的含水量可能存在差异，因此有必要将酶活性标准化为土壤干重。这需要在测定酶活性的基础上额外增加一个干燥步骤（通常为两天）。因此，与能够快速获得结果的水样酶活性检测不同，土壤和沉积物中酶活性的可靠测定通常需要数天时间。对于某些土壤，以每克有机质或无灰干重表示酶活性可能更为合适，这就需要在干燥步骤之外再增加一个灰化步骤（通常为500 °C下灼烧2小时）。无论采用何种表示方式，土壤或沉积物酶活性比色测定中最关键的步骤是在孵育结束后，通过离心使深孔板中的样品沉降，然后从深孔板中吸取上清液。由于该方法依赖吸光度测定，最终微孔板中即使存在少量游离土壤颗粒，也可能导致错误结果。提高离心速度（>5,000 × g）可能有助于缓解这一问题，但根据我们的经验，能够容纳微孔板的离心机转子通常旋转速度上限低于该值，且深孔板本身可能无法耐受更高的转速。因此，这一特定的移液步骤需要操作者兼顾谨慎与速度，使用多通道移液器迅速将所需量的上清液从深孔板转移至微孔板中。

水样中胞外酶活性.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂与材料
冰乙酸			多家供应商
乙酸钠			多家供应商
氢氧化钠			多家供应商
p-硝基苯酚	Fisher	BP612-1	可选用其他替代品
p-硝基苯基（pNP）-磷酸盐	Sigma	N3234	pNP-底物
pNP-β-葡萄糖苷	Sigma	N7006	pNP-底物
pNP-β-N-乙酰氨基葡萄糖苷	Sigma	N9376	pNP-底物
透明96孔微孔板	Fisher	12-563-301	可选用其他替代品
96孔深孔板	Costar	3958	可选用其他替代品
铝制称量盘			多家供应商
无菌15 ml离心管			多家供应商
无菌50 ml离心管			多家供应商
4-甲基伞形酮	Sigma	M1381
4-甲基伞形基（MUB）-磷酸盐	Sigma	M8883	MUB-底物
4-MUB-葡萄糖苷	Sigma	M3633	MUB-底物
4-MUB-N-乙酰氨基葡萄糖苷	Sigma	M2133	MUB-底物
碳酸氢钠			多家供应商
黑色96孔微孔板	Costar	3792
移液管储液槽			多家供应商
仪器
离心机	Eppendorf	5810R
离心机转子	Eppendorf	A-4-81	适用于微孔板/深孔板
微孔板读板仪	BioTek	Synergy HT	可选用其他替代品
微孔板荧光计	BioTek	FLx 800	可选用其他替代品
8通道移液器			多家供应商