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方法文章

用于肿瘤大小测量质量控制的临床前多模态模体的构建：基于仿组织材料

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DOI：

10.3791/50403

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2013年7月29日

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1Department of Radiation Oncology, University of Kansas School of Medicine, 2Department of Radiology, University of Texas Health Science Center at San Antonio

本文内容

摘要

本文介绍了使用模拟组织（TM）材料构建临床前多模态体模的内部操作流程，该体模用于动物成像技术（如超声（US）、计算机断层扫描（CT）和磁共振成像（MRI））中肿瘤大小测量的质量保证（QA）。

摘要

世界卫生组织（WHO）和实体瘤疗效评价标准（RECIST）工作组分别于20世纪80年代和90年代提出了针对抗肿瘤药物治疗后实体瘤影像学评估的标准化标准。WHO标准采用二维测量法评估实体瘤，而RECIST标准仅采用一维测量法，后者被认为具有更高的可重复性1, 2, 3,4,5。这些标准已被广泛用作美国食品药品监督管理局（FDA）唯一批准的影像学生物标志物6。因此，为了在影像上准确测量肿瘤对抗肿瘤药物的治疗反应，必须建立完善的质量保证（QA）程序及相应的QA模体。

为满足这一需求，作者基于RECIST标准所规定的有限数量的目标病灶，通过改进Gammex超声商用模体7，使用仿组织（TM）材料构建了一个用于超声（US）、计算机断层扫描（CT）和磁共振成像（MRI）的临床前多模态模体。Lee et al. 的附录展示了该模体制造的具体步骤7。本文以逐步说明的方式介绍了全部实验方案，首先介绍用于在模体中浇铸模拟肿瘤测试物体的硅胶模具的制备步骤，随后介绍适用于多模态成像的仿组织材料的制备，最后介绍临床前多模态质量保证（QA）模体的构建过程。本文的主要目的是提供完整的操作流程，使任何有兴趣的研究人员均可独立为其自身项目构建该模体。使用该质量保证模体制作的测试物体在多个机构中进行的肿瘤大小测量的质量保证流程，以及RECIST、WHO和体积测量结果的详细数据，已在Lee et al.8中全面展示。

引言

评估肿瘤大小的变化是评价抗肿瘤药物在肿瘤缩小和疾病进展方面活性的重要终点9, 10。世界卫生组织（World Health Organization, WHO）和实体瘤疗效评价标准（Response Evaluation Criteria in Solid Tumors, RECIST）是用于超声（US）、计算机断层扫描（CT）或磁共振成像（MRI）等影像学手段对肿瘤病灶进行解剖学评估的规范化方法。根据WHO标准，需计算靶病灶在横断面的最大直径与其最大垂直直径的乘积4。而根据RECIST标准，则需计算有限数量靶病灶在横断面最长直径之和4。尽管对肿瘤治疗反应评估的兴趣持续增长，但目前尚无针对该影像学生物标志物的临床前质量保证（QA）模体或QA操作流程。

鉴于基于 WHO 标准和/或 RECIST 的肿瘤大小测量是美国食品药品监督管理局（FDA）唯一批准的影像学生物标志物，作为其他影像学生物标志物质量保证（QA）的起点，Lee et al. 与 Gammex 公司合作设计并构建了 UTHSCSA/Gammex 第 1 代和第 2 代模体，用于肿瘤大小测量的质量保证7。第 1 代模体是 Gammex 商用超声模体的改进版本，因此体积过大，无法适配动物 CT 和 MR 扫描仪。此外，第 1 代模体中的部分工具对于肿瘤大小测量而言并非必需。第 2 代模体则基于最新获得 FDA 批准的影像学生物标志物 RECIST 进行设计。然而，第 2 代模体的尺寸对 MR 扫描仪而言仍然过大，且该模体的 CT 和 MR 图像质量尚不足以满足精确的肿瘤大小测量要求7。

本文所述的质量控制（QA）模体针对以往模体的不足进行了重新设计，并采用本实验室开发的改良型组织模拟（TM）材料和制备方案构建而成。本文详细描述了模体构建的各项操作步骤：首先，介绍了制备用于浇铸模拟肿瘤测试物体的硅胶模具，以及组装可旋转模体的旋转装置以防止重力沉降的方法；其次，描述了基于D'Souza 等提出的方案进行改良的、适用于超声（US）、计算机断层扫描（CT）和磁共振（MR）成像的TM材料的制备流程11。这些TM材料的物理特性已在各成像模式下进行了测试，以确保其在不同成像方式所获取的图像中能够准确反映人体软组织的特征，但测试结果未在本文中展示；第三，阐述了模体构建的具体操作流程；最后，展示了该模体在超声、CT和MR成像下的图像结果。

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方案

1. 模体设计

预临床多模态模体的示意图如图所示 图1 7, 8该模体直径为38 mm，长度为115 mm，可适用于多种动物扫描仪。模体内包含五个模拟肿瘤的测试物体（直径分别为14、10、7、4和2 mm），置于模体内部深度10 mm处。

2. 硅胶模具的构建

本节所述方法用于制备硅胶模具，以浇铸模拟肿瘤的测试物体7。制备硅胶模具所需的所有丙烯酸板和棒材均在美国德克萨斯大学健康科学中心圣安东尼奥分校（UTHSCSA）机加工车间进行切割，加工精度为25 μm。

  1. 在两块亚克力底板（尺寸：4.2 cm × 11.5 cm × 0.9 cm）上分别制作五个用于测试物体的孔（直径：14、10、7、4、2 mm）和另外五个用于对准杆的孔（直径：6 mm）（图 2A）。
  2. 切割高度分别为 7、5、3.5、2 和 1 mm 的间隔片对（尺寸：1.0 cm × 5.5 cm）（图 2B）。
  3. 准备钢球（直径：14、10、7、4 和 2 mm，精度：2.5 μm）。
  4. 依次将两对高度为 7 mm 的间隔片和一块底板放置在一块薄亚克力板上，并使用C型夹固定（图 2C）。
  5. 将直径为 14 mm 的钢球插入底板上的 14 mm 孔中，并使用 J-B KWIK 胶粘剂固定（图 2C）。对剩余钢球（图 2D）及另一块底板重复上述操作。注意两块底板中的钢球应以镜像方式粘接7。
  6. 使用美纹纸胶带将四块高 2.5 cm 的亚克力板（其中两块尺寸为 2.5 cm × 11.5 cm，另两块为 2.5 cm × 4.2 cm）像围栏一样固定在每个底板组件上（图 3A）。
  7. 将顶板（尺寸：4.2 cm × 11.5 cm，含五个直径为 0.8 cm 的孔和十个直径为 1.2 cm 的孔）安装在一个底板组件上，用于插入五根带 1 mm 尖端的亚克力杆（直径：0.8 cm，长度：0.5 cm），插入五根对准杆（直径：0.9 cm，长度：5.0 cm），并用于浇注硅胶（图 3A）。
  8. 将亚克力杆完全插入顶板的 0.8 cm 孔中，直至接触钢球顶部，并使用硅胶粘合剂固定。然后通过顶板上的较大孔将对准杆插入底板的孔中（图 3A）。
  9. 按重量比 10:1 将硅橡胶组分 A 与组分 B 混合。
  10. 将硅橡胶混合物倒入组件中，并在室温下干燥约 24 小时（图 3B）。

3. 旋转器组件装配

旋转装置由PVC管和旋转烤肉电机组装而成。

  1. 将螺栓的一端磨细，使其能够适配旋转烤肉电机的孔。
  2. 使用螺母和垫圈将磨细的螺栓固定在PVC管（长度：270 mm，内径：75 mm）的一端。
  3. 弯曲金属板，并使用J-B KWIK将其粘接到塑料板上，以支撑PVC管并调节PVC管的高度7。

4. 透射电子显微镜样品制备

制备TM材料的方案修改自威斯康星大学麦迪逊分校Ernest L. Madsen博士实验室所开发的方法，更多细节见Lee et al. 8,11。

4.1 背景：TM 材料的制备

  1. 将市售全脂牛奶（200 cc）依次通过 20 μm 和 10 μm 的网状滤器进行过滤。
  2. 将硫柳汞（0.2 g）溶解于过滤后的牛奶（100 cc）中。
  3. 使用实验室真空泵，在室温下对上述牛奶溶液抽气脱气 30 秒。
  4. 在室温下将干燥琼脂糖（2 g）溶解于去离子水（18 MΩ）（100 cc）中。
  5. 然后向琼脂糖溶液中加入 1-丙醇（7.9 cc）和硫酸钡 BaSO4（1 g）。
  6. 对琼脂糖溶液进行脱气处理，随后将其置于 95 °C 水浴中加热，直至溶液澄清。
  7. 在琼脂糖溶液于 95 °C 水浴中加热澄清的同时，将炼乳置于 55 °C 水浴中加热。
  8. 将熔融的琼脂糖溶液转移至 55 °C 水浴中冷却。
  9. 当两种溶液均达到 55 °C 后，将琼脂糖溶液（50 cc）与炼乳（50 cc）按体积比 50:50 混合，缓慢搅拌，并去除表面的气泡。
  10. 然后向琼脂糖-牛奶混合物中加入 EDTA（0.103 g）和二水合氯化铜 CuCl2·2H2O（0.06 g），充分搅拌以确保混合均匀。
  11. 最后加入玻璃珠（直径 15 - 60 μm，平均直径：35 μm）（0.1 g），反复搅拌最终混合物。使用前需将玻璃珠在浓硝酸中浸泡 24 小时以去除杂质，然后用水彻底冲洗去除残余酸液。

4.2 测试物体TM材料制备

测试样品的TM材料的制备方法与背景TM材料相似，仅在以下组分上存在差异：

  1. 将市售全脂牛奶（20 cc）依次通过20 μm和10 μm的网状滤器。
  2. 将硫柳汞（0.02 g）溶解于过滤后的牛奶（10 cc）中。
  3. 将干燥的琼脂糖（0.60 g）溶解于室温的去离子水（10 cc）和1-丙醇（0.79 cc）混合溶液中。
  4. 对琼脂糖溶液进行脱气处理，然后置于95 °C水浴中加热，直至溶液变澄清。
  5. 当琼脂糖溶液在95 °C水浴中逐渐澄清时，将炼乳置于55 °C水浴中加热。
  6. 将熔融的琼脂糖溶液转移至55 °C水浴中。
  7. 待两种溶液均达到55 °C后，将琼脂糖溶液（5 cc）与炼乳（5 cc）混合，缓慢搅拌，并去除液面的气泡。
  8. 随后向琼脂糖-牛奶混合物中加入EDTA（0.0017 g）和CuCl2·2H2O（0.0010 g），并充分搅拌。

5. 多模态体模组装

使用硅胶模具，通过以下步骤构建多模态模体。

  1. 在没有1 mm孔的硅胶模具上，沿球体中心固定尼龙线，并使用硅胶粘合剂将尼龙线粘在模具两端（图4A）。
  2. 使用软毛刷将硅脂涂覆在两个模具的表面（图4A），然后使用对准杆将两个模具组装在一起。
  3. 按照第4.2节所述方法制备测试物体组织模拟材料，并使用注射器的22号针头通过硅胶模具上的1 mm孔注入材料。
  4. 为使测试物体固化，将模具置于冰箱（5 °C）中约30分钟。
  5. 在半圆柱形容器（长度：115 mm，直径：38 mm）的每一侧，从模型表面下方10 mm深度处制作两个直径为1 mm的孔，用于安装带有测试物体的尼龙线；另制作一个直径为6 mm的孔，用于注入背景组织模拟材料。
  6. 将带有尼龙线的测试物体从模具中取出（图4B），然后将其安装到半圆柱形容器中（图4C）。
  7. 使用3M Scotch-Weld DP-100胶和3M胶带，将薄型非导电铝片（厚度：0.12 mm）粘附在亚克力容器表面；使用相同的胶封闭亚克力容器上的1 mm孔（图4C）。
  8. 快速制备背景组织模拟材料，并使用小型塑料漏斗缓慢地通过容器上的6 mm孔注入材料。
  9. 排除所有气泡后，使用3M Scotch-Weld DP-100胶封闭6 mm孔。
  10. 组装完成后，在室温下将模型置于旋转器中以2 rpm的转速旋转4至5小时。
  11. 待模型内的组织模拟材料完全硬化后，移除尼龙线。

6. 多模态成像

该模型在临床前超声、CT和MRI中进行扫描，并获取三种模态的图像。成像方案在Lee et al. 7, 8中有详细描述。

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结果

图3B 和 图5 分别展示了用于浇铸测试物体的两个硅胶模具以及多模态成像体模。每个模具的长 × 宽 × 深为 109 mm × 37 mm × 21 mm，两个模具互为相同的镜像。其中一个模具设有直径 1 mm 的孔，可用于插入肿瘤模拟物（TM）材料，操作时使用细针。每个模具还额外设有五个用于对准杆的孔。该体模的长 × 宽 × 深为 115 mm × 38 mm × 24 mm，初始质量为 101.02 g。该体模的尺寸适合放入临床前成像设备中。

通过超声（US）、计算机断层扫描（CT）和磁共振成像（MRI）获取的图像如图6所示。测试物体与背景之间的对比度足以区分测试物体并测量其尺寸。除超声图像中存在轻微的混响伪影外，其他图像中均未观察到严重伪影。

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讨论

本文旨在提供用于多模态成像的组织模拟材料（TM材料）制备方法，并构建一种临床前多模态模体，作为在多个机构中利用不同成像方式准确测量肿瘤大小的质量保证（QA）工具。如前所述，TM材料最初由威斯康星大学麦迪逊分校的Ernest L. Madsen博士实验室开发，用于多模态前列腺模体。我们针对自身需求对Madsen博士的TM材料方案进行了改进，以在测试物体与背景之间获得足够的对比度，并在超声（US）、计算机断层扫描（CT）和磁共振（MR）图像中准确反映软组织的物理特性。我们采用自有的TM材料方案构建模体的方法首次由Lee 等简要介绍7, 8。本文将详细阐述TM材料及模体构建的完整操作流程。

在制备TM材料之前，我们在实验室中定制了硅胶模具和旋转仪。由于硅胶模具在干燥过程中可能发生收缩，因此选择合适的硅胶化合物对模具制备至关重要。模具硬化后，我们使用可追溯至美国国家标准与技术研究院（NIST）的卡尺测量每个模具中物体的直径，以确保收缩程度最小。旋转仪的使用是为了防止背景材料中的玻璃珠发生重力沉降。

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致谢

作者感谢威斯康星大学麦迪逊分校的 Madsen 博士以及 Gammex 公司的 Cristel Baiu 在组织模拟材料（TM materials）方面提供的建议。作者还感谢 Malcolm David Murray 博士提供了构建模体的方法。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
试剂/材料 
聚氯乙烯管N/AN/AHome Depot
螺栓、螺母、垫圈和金属板N/AN/AHome Depot
丙烯酸板和棒材N/AN/A德克萨斯州圣安东尼奥市塑料供应商
钢球Nordex, Inc.AEC-M2-2, -4, -7, -10 和 -14直径分别为 2、4、7、10 和 14 mm
C型夹可调夹具1420-C2 英寸长度
美纹纸胶带3M 工业胶粘剂与胶带公司2600 
管道胶带3M 工业胶粘剂与胶带公司S-3763SIL 
J-B KWIKJ-B WELD 公司380238 
3M Scotch-Weld 环氧胶粘剂3M 工业胶粘剂与胶带公司DP-100 
硅脂Permatex, Inc.22058 
硅胶DAP, Inc.688 
硅橡胶化合物Smooth-ON, Inc.Smooth-SilTM950 A组分和B组分A:B 混合比例 = 按重量计 10:1
刷子N/AN/AHobby Lobby
注射器Becton Dickinson30960410 ml
针头Becton Dickinson30515622号，1.5英寸长度
漏斗N/AN/A 
网状滤器Small parts, Inc.CMN-0010-C 和 CMN-0020-C10 和 20 μm
全脂牛奶N/AN/A德克萨斯州圣安东尼奥市 HEB 超市
硫柳汞Sigma-Aldrich Co.T5125 
丙醇Sigma-Aldrich Co.33538 
EDTASigma-Aldrich Co.431788 
CuCl2Sigma-Aldrich Co.459097 
琼脂糖Sigma-Aldrich Co.A0169 
BaSO4Sigma-Aldrich Co.B8675 
玻璃珠Potters Industries, Inc.3000E 
PET/AL/LLDPE*Pechiney Plastic Packaging, Inc.Pechiney Spec 151幻影模型覆盖材料
 *聚对苯二甲酸乙二醇酯/铝/线性低密度聚乙烯
设备 
旋转烤肉电机Brinkmann812-7103-SHome Depot
水浴槽 1Precision, Inc.型号：282，序列号：601091552 
水浴槽 2VWR, Inc.型号：1212，序列号：08119606 
超声成像仪Visualsonics序列号：770/120-259 
CTGamma Medica-Ideas序列号：GR 0050 
MRIBruker部件号：W3301390，序列号：0030 

参考文献

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