中性粒细胞是血液中最丰富的白细胞。中性粒细胞具有转录调控的功能，例如促炎性细胞因子的产生和凋亡的抑制。通过本文所介绍的方法，可在分离的细胞核中利用流式细胞术检测和定量核因子，从而研究这些功能。
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摘要
摘要
中性粒细胞是外周血中最丰富的白细胞。这些细胞最先出现在炎症和感染部位，因此成为抵御入侵微生物的第一道防线。中性粒细胞具有重要的抗微生物功能，例如吞噬作用、释放溶菌酶以及产生活性氧。除了这些重要的防御功能外，中性粒细胞在感染发生时还执行其他任务，如产生促炎性细胞因子和抑制凋亡。细胞因子可招募其他白细胞共同清除感染，而抑制凋亡则使中性粒细胞在感染部位存活更长时间。这些功能在转录水平上受到调控。然而，由于中性粒细胞寿命较短，无法使用传统的报告基因方法来研究这些细胞中转录调控的反应，因为目前尚无高效的中性粒细胞转染技术。在此，我们介绍一种简单且高效的方法，可通过流式细胞术检测和定量分离后经免疫标记的细胞核中的核因子。我们描述了从人外周血中分离纯化中性粒细胞、用抗受体抗体刺激这些细胞、分离并免疫标记细胞核，以及通过流式细胞术分析细胞核的技术。该方法已成功用于检测中性粒细胞及其他细胞类型细胞核中的NF-κB和Elk-1核因子。因此，该方法为分析多种细胞类型分离细胞核中转录因子的活化状态提供了一种可行方案。
引言
中性粒细胞是外周血中最丰富的白细胞1。在炎症和感染过程中，中性粒细胞是最早到达病变部位的细胞，发挥第一道防御作用2。中性粒细胞具有多种抗微生物机制3，包括吞噬作用、活性氧物质的产生、通过脱颗粒释放溶菌酶以及促炎性细胞因子的生成4,5。中性粒细胞是寿命较短的细胞，可通过多种细胞表面受体的信号传导迅速激活。尽管由于其寿命短暂且在未参与炎症过程时会经历凋亡，中性粒细胞曾被认为是终末细胞6，但现在已明确它们也能通过改变特定基因的转录水平来调节自身表型。细胞因子的生成5和凋亡的抑制7,8是中性粒细胞中两种重要的、依赖于激活状态的细胞功能，均在转录水平上受到调控。核因子κB（NF-κB）参与调控多种细胞类型中细胞因子生成的转录过程4，并在细胞存活与凋亡的调节中发挥重要作用9-11。
导致核因子活化的信号通路通常通过报告基因检测或电泳迁移率变动分析（EMSA）进行研究。然而，由于中性粒细胞是短寿命细胞，无法利用报告基因检测来研究这些细胞中转录调控的反应，因为目前尚无高效的中性粒细胞转染技术。已有研究在中性粒细胞中采用EMSA检测核因子的活化12,13；但该方法较为复杂且成本较高，因其涉及放射性物质的使用。核转染（Nucleofection）是另一种已成功用于单核细胞转染的技术14。因此，至少在理论上，可通过转染技术检测中性粒细胞中的核因子活化（尽管效率较低）。然而，该方法将更加昂贵、耗时，且可能定量性更差。免疫染色细胞的显微镜分析也可用于检测细胞核内的核因子。事实上，我们已通过该方法检测到NF-κB向细胞核的转位15。遗憾的是，该技术同样耗时较长，定量性较差，并易受观察者主观偏差的影响。
本文介绍一种简单且高效的方法，可通过流式细胞术对分离并免疫标记的细胞核中的核因子进行检测和定量。我们描述了从人外周血中分离中性粒细胞、通过整合素或 Fc 受体（使用抗受体抗体）刺激这些细胞、分离并免疫标记细胞核，以及通过流式细胞术分析细胞核的技术流程（图1）。该方法已成功用于检测中性粒细胞细胞核中的 NF-κB 15 和 Elk-1 16 核因子。该方法具有高灵敏度，可检测细胞核内核因子水平的微小变化。此方法也可用于分析其他细胞类型细胞核中转录因子的水平。
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方案
1. 从人血液中分离中性粒细胞（PMN）
- 使用约 20 ml 含肝素（10 U/ml）作为抗凝剂的人血。血液通过静脉穿刺从健康成人志愿者采集。所有实验均在墨西哥国立自治大学生物医学研究所生物伦理委员会批准下进行。
- 在 15 ml 锥形离心管中加入 2 ml 6% 的葡聚糖 T500 PBS 溶液，再加入 10 ml 血液。通过倒置混匀管子两到三次，静置 45 分钟，使红细胞沉降。
- 在另一新的 15 ml 锥形离心管中加入 5 ml Ficoll-Paque 溶液。
- 取红细胞沉降后上层富含白细胞的血浆，小心地用移液器将其加至 Ficoll-Paque 溶液上方，形成第二层。确保形成两相。
- 在 4 °C 条件下以 516 × g 离心 20 分钟。离心后，在血浆与 Ficoll-Paque 的界面处可见单个核细胞层，中性粒细胞则位于管底。
- 弃去上清液，通过轻敲离心管使细胞沉淀松散，加入 10 ml 冷（4 °C）PBS 重悬细胞。注意： 不建议通过反复吹打重悬细胞，因为这会对细胞造成较大损伤。
- 将细胞悬液转移至 50 ml 锥形离心管中，在 4 °C 条件下以 290 × g 离心 5 分钟。
- 同前法打散细胞沉淀，加入 10 ml 冷（4 °C）低渗溶液（0.2% NaCl、1% BSA、20 mM Hepes，pH = 7.4）以裂解红细胞。用手轻轻旋转混匀，精确持续 1 分钟。
- 加入 10 ml 冷（4 °C）高渗溶液（1.6% NaCl、1% BSA、20 mM HEPES，pH = 7.4），混匀后使用血细胞计数板计数细胞（通常>95% 为 PMN）。
注意： 计数细胞时，将含细胞悬液的离心管置于冰上。 - 同前法离心，用冷（4 °C）PBS 将 PMN 重悬至浓度为 107 个细胞/ml，置于冰上保存。
注意： 中性粒细胞在 4 °C 下可保持活力和功能约 6 至 8 小时。
2. 激活中性粒细胞
- 取100 μl PMN悬液（1 × 107 个细胞/ml）加入1.5 ml离心管中。
注意： 样品管应至少设置复孔。常规阴性对照应包括仅加一抗和仅加二抗的组别。 - 加入相应抗整合素或抗Fc受体单克隆抗体（mAb），终浓度为10 μg/ml，冰上孵育15分钟。
- 加入1 ml冷（4 °C）PBS洗涤PMN，微型离心机中1,743 × g（4,500 rpm）离心，吸除上清液。
- 轻敲管底使细胞沉淀重悬，加入1 ml冷PBS，按上一步骤再洗涤两次。
注意： 此步骤可去除未结合的抗体。 - 将PMN重悬于相同（初始）体积的温热（37 °C）PBS中，其中含60 μg/ml F(ab')2山羊抗小鼠IgG。
注意： 二抗（抗小鼠IgG）将结合一抗（抗受体抗体），从而引起受体交联。 - 根据所研究的核因子，于37 °C孵育1至20分钟。通常NF-κB激活需15分钟，Elk-1激活需5分钟。
注意： 37 °C孵育可诱导受体交联，该过程在4 °C下无法发生。 - 加入1 ml冷PBS，微型离心机中1,743 × g离心3分钟。
- 移除上清液。
- 立即在干冰/乙醇浴中冷冻PMN，并维持10分钟。
3. 细胞核的分离与固定
- 将冻存的中性粒细胞（PMN）沉淀重悬于 100 μl 冷（4 °C）低渗缓冲液（10 mM HEPES、10 mM KCl、1.5 mM MgCl2, 和 1 mM 新鲜添加的 DL-二硫苏糖醇 [DTT]；pH = 7.9）中。建议将冻存管逐个从干冰/乙醇浴中取出，并在加入低渗缓冲液前将管底擦拭干净。
- 置于冰上，取部分核悬液用台盼蓝染色，检测核的完整性。完整的细胞核呈圆形且染成蓝色。完整的中性粒细胞不被染色，而细胞碎片则表现为不规则形状的蓝色颗粒。
注意： 若核悬液中含有大量完整细胞或碎片，建议弃去该样品，改用另一份样本重新进行操作。 - 在4°C环境下，将核悬液于微量离心机中以 775 × g（3,000 rpm）离心 10 分钟。此时细胞核极为脆弱，需格外注意保持样品低温，避免使用过高的离心力。
- 通过极其小心的移液操作去除上清液。
- 加入 100 μl 冷的含 4% 多聚甲醛的 PBS 溶液以固定细胞核。
注意： 沉淀非常疏松，加入缓冲液即可使其重悬，应避免反复吹打。 - 冰上孵育 20 分钟。
- 进行流式细胞术所需的免疫标记，或于 4 °C 保存不超过 24 小时以备后续使用。
4. 用于流式细胞术分析的细胞核免疫标记
- 将细胞核在微量离心机中以 1,743 × g（4,500 rpm）离心 1 分钟，然后通过轻柔的移液操作去除上清液。
- 加入 100 μl 冷（4 °C）含 0.1% Triton X-100 和 4% 多聚甲醛的 PBS 溶液，以透化细胞核。冰上孵育 10 分钟。
- 将透化后的细胞核在微量离心机中以 1,743 × g 离心，并小心去除上清液。此时细胞核沉淀在管底附着不牢。若沉淀松动，建议再次离心。
- 将细胞核重悬于 500 μl 冷的含 4% 胎牛血清（FBS）的 PBS 中，以阻断非特异性结合位点，冰上孵育 20 分钟。在微量离心机中以 1,743 × g 离心 3 分钟，小心去除上清液。
- 将细胞核重悬于 100 μl 冷的含 4% FBS 及 2.5 μg/ml 针对目标核因子的单克隆抗体（mAb）的 PBS 溶液中，冰上孵育 20 分钟。
注意： 常规阴性对照应包括仅加抗核因子抗体、以及仅加 FITC 标记的二抗。 - 用 500 μl 冷的含 4% FBS 的 PBS 洗涤两次，每次以 1,743 × g 离心 3 分钟。
- 非常小心地去除上清液，将细胞核重悬于 100 μl 冷的含 4% FBS 及 10 μg/ml 对应的 FITC 标记二抗的 PBS 溶液中，冰上孵育 20 分钟。
- 参照前一步骤，用 500 μl 冷的含 4% FBS 的 PBS 将细胞核洗涤两次。
- 将细胞核重悬于 400 μl 冷的含 4% 多聚甲醛的 PBS 溶液中。
注意： 将细胞核置于多聚甲醛中可使样本在数天内保存，避免因血清存在而可能引起的污染问题。 - 立即通过流式细胞术分析，或避光保存于 4 °C，最多可保存三天。
5. 流式细胞术分析
- 使用流式细胞仪（如 Becton Dickinson 公司的 FACScan，Franklin Lakes, NJ）或类似设备分析免疫标记的细胞核。
- 将采集参数设置为：FSC 以对数尺度设为 10⁻¹，SSC 以对数尺度设为 196，并在点图中圈选细胞核群体。
- 每份样品采集一万个细胞核。
- 通过 FL-1 通道（506 nm）以对数尺度 400 检测 FITC 标记细胞核的荧光信号。
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结果
此处描述的纯化方法通常可获得纯度超过95%的未刺激中性粒细胞（PMN）（图1A）。分离得到的PMN可通过特异性单克隆抗体交联特定受体进行刺激。我们已通过Fc受体和整合素对PMN进行刺激（图1B）。刺激后，裂解PMN并高效分离细胞核。随后使用特异性抗体对细胞核中的特定核因子（如核因子κB（NF-κB））进行免疫标记（图1B）。
在流式细胞仪的点图中，细胞核可被轻易识别为与完整中性粒细胞（PMN）不同的细胞群体（图2A）。 在静息状态的PMN中，细胞核内可检测到基础水平的NF-κB（图2B）。当通过交联β1整合素进行刺激后，NF-κB发生向细胞核的转位，核内NF-κB的增加表现为荧光信号增强（图2B）。类似地，通过交联β2整合素刺激PMN也可诱导NF-κB活化，表现为荧光信号增加（图2C）。该方法具有较高的灵敏度，能够检测到核因子水平的微小变化，这...
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讨论
本文所述纯化方法可在短时间内分离出纯度高于95%（通过显微镜观察评估）的未受刺激中性粒细胞（PMN）。有时，若红细胞未被完全裂解，则可能导致中性粒细胞被红细胞污染。但通常情况下这不会影响实验，因为在流式细胞术中，红细胞与PMN可被轻易区分为不同的细胞群体。分离得到的PMN可通过特异性单克隆抗体交联特定受体的方式进行刺激。事实上，PMN也可通过药理学手段，或通过黏附至不同基质或其他细胞而被激活。本文所介绍的方法可用于分析在各种相关生物学刺激激活细胞后，导致PMN细胞核内核因子发生改变的信号通路。
中性粒细胞（PMN）受到刺激后，本文所述方法可快速高效地纯化细胞核，并通过免疫荧光和流式细胞术检测细胞核中的NF-κB。在某些受体被激活后，细胞质中的NF-κB会从其抑制蛋白IκB上解离，随后转位至细胞核内（图1B）。因此，NF-κB的活化水平由其在细胞核内的含量决定。由于该方法能够检测并定量细胞核中NF-κB的含量，因而可简便地判断该转录因子的活化状态。类似地，只要其他核因子的活化过程伴随其核内含量的变化，该方法也可用于检测其活化情况。核因子的活化改变可能...
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
作者感谢 Nancy Mora 提供的技术支持。
本工作由墨西哥国家科学技术委员会（Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologia）的研究基金48573-M和168098号，以及墨西哥国立自治大学学术人员总务局（Direccion General de Asuntos del Personal Academico, Universidad Nacional Autonoma de Mexico）的IN212308号和IN205311-2号基金资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 试剂 | |||
| 肝素 | PiSA (墨西哥) | ||
| 右旋糖酐 T500 | Pharmacosmos A/S (Holbaek, 丹麦) | T1-右旋糖酐 T500 | |
| Ficoll-Paque | Pharmacia | 17-0320-01 | |
| 氯化钠 | Sigma | S7653 | |
| 磷酸二氢钠 | Sigma | S9638 | |
| 磷酸氢二钠 | Sigma | S9390 | |
| 牛血清白蛋白 (BSA) | Sigma | A2153 | Cohn Fraction V |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| 氯化钾 | Sigma | P9541 | |
| 无水氯化镁 | Sigma | M8266 | |
| DL-二硫苏糖醇 (DTT) | Sigma | D9163 | |
| 台盼蓝 (0.4% 溶液) | Sigma | T8154 | |
| 多聚甲醛 | Sigma | P6148 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| 胎牛血清 (FBS) | GIBCO | 10437-028 | |
| 单克隆抗体 IV.3 | Medarex (Annandale, NJ) | 025-1 | 人源特异性抗-FcRII (CD32) |
| 单克隆抗体 3G8 | Medarex (Annandale, NJ) | 028-2 | 人源特异性抗-FcRIII (CD16) |
| 单克隆抗体 TS2/16 | Dana Farber 癌症研究所 (Boston, MA) | 由 Martin Hemler 博士惠赠 | 人源特异性抗-β1 整合素 (CD29) |
| 单克隆抗体 IB4 | 加州大学旧金山分校 | 由 Eric J. Brown 博士惠赠 | 人源特异性抗-β2 整合素 (CD18) |
| F(ab')2 山羊抗小鼠 IgG | Cappel (Aurora, OH) | 55468 | |
| FITC 标记的 F(ab')2 山羊抗小鼠 IgG | Cappel (Aurora, OH) | 55522 | |
| FITC 标记的 F(ab')2 山羊抗兔 IgG | Cappel (Aurora, OH) | 55665 | |
| 抗-NF-κB p50 | Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) | sc-114 | 兔多克隆抗体 |
| 抗-NF-κB p65 | Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) | sc-109 | 兔多克隆抗体 |
| 仪器 | |||
| 15 ml 离心管 | Corning | 430791 | |
| 50 ml 离心管 | Corning | 430291 | |
| 台式离心机，Sorvall | Dupont Instruments | RT 6000D | |
| pH 计 | Corning | 340 | |
| 移液器 Pipetman P-20 | Gilson | F123600 | |
| 移液器 Pipetman P-200 | Gilson | F123601 | |
| 移液器 Pipetman P-1000 | Gilson | F123602 | |
| 血细胞计数板 | Fisher Scientific | 0267110 | |
| 显微镜 | Nikon | Eclipse E600 | |
| 倒置显微镜 | Nikon | TMS | |
| 水浴培养箱 | Fisher Scientific | 2IS-M | |
| 微量离心机 | Eppendorf | 5414C | |
| 微量离心机 | Eppendorf | 5418 | |
| 流式细胞仪 | Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ) | FACScalibur |
参考文献
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