中性粒细胞是血液中最丰富的白细胞。中性粒细胞具有转录调控的功能，例如促炎性细胞因子的产生和凋亡的抑制。通过本文所介绍的方法，可在分离的细胞核中利用流式细胞术检测和定量核因子，从而研究这些功能。
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摘要
摘要
中性粒细胞是外周血中最丰富的白细胞。这些细胞最先出现在炎症和感染部位，因此成为抵御入侵微生物的第一道防线。中性粒细胞具有重要的抗微生物功能，例如吞噬作用、释放溶菌酶以及产生活性氧。除了这些重要的防御功能外，中性粒细胞在感染发生时还执行其他任务，如产生促炎性细胞因子和抑制凋亡。细胞因子可招募其他白细胞共同清除感染，而抑制凋亡则使中性粒细胞在感染部位存活更长时间。这些功能在转录水平上受到调控。然而，由于中性粒细胞寿命较短，无法使用传统的报告基因方法来研究这些细胞中转录调控的反应，因为目前尚无高效的中性粒细胞转染技术。在此，我们介绍一种简单且高效的方法，可通过流式细胞术检测和定量分离后经免疫标记的细胞核中的核因子。我们描述了从人外周血中分离纯化中性粒细胞、用抗受体抗体刺激这些细胞、分离并免疫标记细胞核，以及通过流式细胞术分析细胞核的技术。该方法已成功用于检测中性粒细胞及其他细胞类型细胞核中的NF-κB和Elk-1核因子。因此，该方法为分析多种细胞类型分离细胞核中转录因子的活化状态提供了一种可行方案。
引言
中性粒细胞是外周血中最丰富的白细胞1。在炎症和感染过程中，中性粒细胞是最早到达病变部位的细胞，发挥第一道防御作用2。中性粒细胞具有多种抗微生物机制3，包括吞噬作用、活性氧物质的产生、通过脱颗粒释放溶菌酶以及促炎性细胞因子的生成4,5。中性粒细胞是寿命较短的细胞，可通过多种细胞表面受体的信号传导迅速激活。尽管由于其寿命短暂且在未参与炎症过程时会经历凋亡，中性粒细胞曾被认为是终末细胞6，但现在已明确它们也能通过改变特定基因的转录水平来调节自身表型。细胞因子的生成5和凋亡的抑制7,8是中性粒细胞中两种重要的、依赖于激活状态的细胞功能，均在转录水平上受到调控。核因子κB（NF-κB）参与调控多种细胞类型中细胞因子生成的转录过程4，并在细胞存活与凋亡的调节中发挥重要作用9-11。
导致核因子活化的信号通路通常通过报告基因检测或电泳迁移率变动分析（EMSA）进行研究。然而，由于中性粒细胞是短寿命细胞，无法利用报告基因检测来研究这些细胞中转录调控的反应，因为目前尚无高效的中性粒细胞转染技术。已有研究在中性粒细胞中采用EMSA检测核因子的活化12,13；但该方法较为复杂且成本较高，因其涉及放射性物质的使用。核转染（Nucleofection）是另一种已成功用于单核细胞转染的....
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方案
1. 从人血液中分离中性粒细胞（PMN）
- 使用约 20 ml 含肝素（10 U/ml）作为抗凝剂的人血。血液通过静脉穿刺从健康成人志愿者采集。所有实验均在墨西哥国立自治大学生物医学研究所生物伦理委员会批准下进行。
- 在 15 ml 锥形离心管中加入 2 ml 6% 的葡聚糖 T500 PBS 溶液，再加入 10 ml 血液。通过倒置混匀管子两到三次，静置 45 分钟，使红细胞沉降。
- 在另一新的 15 ml 锥形离心管中加入 5 ml Ficoll-Paque 溶液。
- 取红细胞沉降后上层富含白细胞的血浆，小心地用移液器将其加至 Ficoll-Paque 溶液上方，形成第二层。确保形成两相。
- 在 4 °C 条件下以 516 × g 离心 20 分钟。离心后，在血浆与 Ficoll-Paque 的界面处可见单个核细胞层，中性粒细胞则位于管底。
- 弃去上清液，通过轻敲离心管使细胞沉淀松散，加入 10 ml 冷（4 °C）PBS 重悬细胞。注意： 不建议通过反复吹打重悬细胞，因为这会对细胞造成较大损伤。
- 将细胞悬液转移至 50 ml 锥形离心管中，在 4 °C 条件下以 290 × g 离心 5 分钟。
- 同前法打散细胞沉淀，加入 10 ml 冷（4 °C）低渗溶液（0.2% NaCl、1% BSA、20 mM Hepes，pH = 7.4）以裂解红细胞。用手轻轻旋转....
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结果
此处描述的纯化方法通常可获得纯度超过95%的未刺激中性粒细胞（PMN）（图1A）。分离得到的PMN可通过特异性单克隆抗体交联特定受体进行刺激。我们已通过Fc受体和整合素对PMN进行刺激（图1B）。刺激后，裂解PMN并高效分离细胞核。随后使用特异性抗体对细胞核中的特定核因子（如核因子κB（NF-κB））进行免疫标记（图1B）。
在流式细胞仪的点图中，细胞核可被轻易识别为与完整中性粒细胞（PMN）不同的细胞群体（图2A）。 在静息状态的PMN中，细胞核内可检测到基础水平的NF-κB（图2B）。当通过交联β1整合素进行刺激后，NF-κB发生向细胞核的转位，核内NF-κB的增加表现为荧光信号增强（图2B）。类似地，通过交联β2整合素刺激PMN也可诱导NF-κB活化，表现为荧光信号增加（图2C）。该方法具有较高的灵敏度，能够检测到核因子水平的微小变化，这.......
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讨论
本文所述纯化方法可在短时间内分离出纯度高于95%（通过显微镜观察评估）的未受刺激中性粒细胞（PMN）。有时，若红细胞未被完全裂解，则可能导致中性粒细胞被红细胞污染。但通常情况下这不会影响实验，因为在流式细胞术中，红细胞与PMN可被轻易区分为不同的细胞群体。分离得到的PMN可通过特异性单克隆抗体交联特定受体的方式进行刺激。事实上，PMN也可通过药理学手段，或通过黏附至不同基质或其他细胞而被激活。本文所介绍的方法可用于分析在各种相关生物学刺激激活细胞后，导致PMN细胞核内核因子发生改变的信号通路。
中性粒细胞（PMN）受到刺激后，本文所述方法可快速高效地纯化细胞核，并通过免疫荧光和流式细胞术检测细胞核中的NF-κB。在某些受体被激活后，细胞质中的NF-κB会从其抑制蛋白IκB上解离，随后转位至细胞核内（图1B）。因此，NF-κB的活化水平由其在细胞核内的含量决定。由于该方法能够检测并定量细胞核中NF-κB的含量，因而可简便地判断该转录因子的活化状态。类似地，只要其他核因子的活化过程伴随其核内含量的变化，该方法也可用于检测其活化情况。核因子的活化改变可能.......
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
作者感谢 Nancy Mora 提供的技术支持。
本工作由墨西哥国家科学技术委员会（Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologia）的研究基金48573-M和168098号，以及墨西哥国立自治大学学术人员总务局（Direccion General de Asuntos del Personal Academico, Universidad Nacional Autonoma de Mexico）的IN212308号和IN205311-2号基金资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 试剂 | |||
| 肝素 | PiSA (墨西哥) | ||
| 右旋糖酐 T500 | Pharmacosmos A/S (Holbaek, 丹麦) | T1-右旋糖酐 T500 | |
| Ficoll-Paque | Pharmacia | 17-0320-01 | |
| 氯化钠 | Sigma | S7653 | |
| 磷酸二氢钠 | Sigma | S9638 | |
| 磷酸氢二钠 | Sigma | S9390 | |
| 牛血清白蛋白 (BSA) | Sigma | A2153 | Cohn Fraction V |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| 氯化钾 | Sigma | P9541 | |
| 无水氯化镁 | Sigma | M8266 | |
| DL-二硫苏糖醇 (DTT) | Sigma | D9163 | |
| 台盼蓝 (0.4% 溶液) | Sigma | T8154 | |
| 多聚甲醛 | Sigma | P6148 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| 胎牛血清 (FBS) | GIBCO | 10437-028 | |
| 单克隆抗体 IV.3 | Medarex (Annandale, NJ) | 025-1 | 人源特异性抗-FcRII (CD32) |
| 单克隆抗体 3G8 | Medarex (Annandale, NJ) | 028-2 | 人源特异性抗-FcRIII (CD16) |
| 单克隆抗体 TS2/16 | Dana Farber 癌症研究所 (Boston, MA) | 由 Martin Hemler 博士惠赠 | 人源特异性抗-β1 整合素 (CD29) |
| 单克隆抗体 IB4 | 加州大学旧金山分校 | 由 Eric J. Brown 博士惠赠 | 人源特异性抗-β2 整合素 (CD18) |
| F(ab')2 山羊抗小鼠 IgG | Cappel (Aurora, OH) | 55468 | |
| FITC 标记的 F(ab')2 山羊抗小鼠 IgG | Cappel (Aurora, OH) | 55522 | |
| FITC 标记的 F(ab')2 山羊抗兔 IgG | Cappel (Aurora, OH) | 55665 | |
| 抗-NF-κB p50 | Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) | sc-114 | 兔多克隆抗体 |
| 抗-NF-κB p65 | Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) | sc-109 | 兔多克隆抗体 |
| 仪器 | |||
| 15 ml 离心管 | Corning | 430791 | |
| 50 ml 离心管 | Corning | 430291 | |
| 台式离心机，Sorvall | Dupont Instruments | RT 6000D | |
| pH 计 | Corning | 340 | |
| 移液器 Pipetman P-20 | Gilson | F123600 | |
| 移液器 Pipetman P-200 | Gilson | F123601 | |
| 移液器 Pipetman P-1000 | Gilson | F123602 | |
| 血细胞计数板 | Fisher Scientific | 0267110 | |
| 显微镜 | Nikon | Eclipse E600 | |
| 倒置显微镜 | Nikon | TMS | |
| 水浴培养箱 | Fisher Scientific | 2IS-M | |
| 微量离心机 | Eppendorf | 5414C | |
| 微量离心机 | Eppendorf | 5418 | |
| 流式细胞仪 | Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ) | FACScalibur |
参考文献
- Sendo, F., et al. Regulation of neutrophil apoptosis: its biological significance in inflammation and the immune response. Human Cell. 9, 215-222 (1996).
- Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33, 657-670 (2010). ....
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重印与许可
