一种简单有效的方法，通过流式细胞仪检测核转录因子激活人体中性粒细胞

Summary

中性粒细胞是白细胞在血液中含量最丰富的。中性粒细胞具有转录调控功能，如生产的炎性细胞因子和抑制细胞凋亡。这些函数可以用这里介绍的方法，它允许核因素，通过流式细胞术检测和定量在孤立的核研究

Abstract

中性粒细胞是最丰富的外周血白细胞。这些细胞是第一次出现在炎症和感染的网站，从而成为第一线的防御入侵的微生物。中性粒细胞具有重要的抗菌功能的吞噬作用，细胞溶解酶的释放，生产的活性氧等。除了这些重要的防御功能，中性粒细胞生产的炎性细胞因子和细胞凋亡的抑制感染，如执行其他任务。细胞因子招募其他的白细胞，帮助清除感染和抑制细胞凋亡，使中性粒细胞在受感染的网站活的时间更长。这些功能是在转录水平的调节。但是，由于中性粒细胞是短命的细胞，在这些细胞中的转录调控的响应研究不能进行与传统的报告基因的方法，因为没有效率cient中性粒细胞转染技术。在这里，我们提出了一个简单而有效的方法，它允许在孤立和immunolabeled的核的流式细胞仪检测和定量的核因子。我们描述的技术来隔离纯粹从人外周血中性粒细胞，刺激这些细胞与抗受体抗体，隔离和immunolabel核，并用流式细胞仪分析核。该方法已成功地用于检测NF-κB和核因子Elk-1的中性粒细胞和其他类型细胞的细胞核中。因此，这种方法代表一个选项用于分析从多种类型的细胞在孤立的核转录因子的激活。

Introduction

中性粒细胞是最丰富的外周血中的白细胞^1。在炎症和感染过程中嗜中性粒细胞是出现在受影响的部位，在那里他们作为防御²的第一行的第一个细胞。中性粒细胞具有几种抗菌^机制的吞噬能力，生产的活性氧的溶解酶脱颗粒，释放和生产，促炎细胞因子^4,5。中性粒细胞是短命的细胞得到迅速激活，通过从不同的细胞表面受体的信号。虽然中性粒细胞被认为是终末细胞，由于其短暂的一生，因为它们发生细胞凋亡，除非激活在炎症过程，它现在很清楚，他们也可以修改他们的表型改变特定基因的转录水平。生产的细胞因子⁵和抑制凋亡^7,8两个important活化依赖的细胞功能调节在嗜中性粒细胞中的转录水平。核因子κB（NF-κB）参与细胞因子的生产^4，在调节细胞的存活和凋亡^9-11在各种细胞类型中的转录控制。

导致核因子激活的信号通路研究报告基因检测或电泳迁移率分析（EMSA）。但是，由于中性粒细胞是短命的细胞，在这些细胞中的转录调控的响应研究不能进行与报告基因检测中，因为不存在有效的中性粒细胞转染技术。 EMSA分析已被用于在嗜中性粒细胞，探讨核因子活化^12,13，然而，这种方法是复杂和昂贵的，因为它涉及使用放射性物质。核转染是另一种技术，已被用于成功。LLY转染单核细胞^14。因此，至少在理论上，核因子的活化可以....

Protocol

1。从人血中分离中性粒细胞（PMN）

1. 约20毫升人体血液中作为抗凝血剂肝素（10 U / ml）的使用。从健康成年志愿者venopuncture采集血液。所有的实验都做生物伦理委员会在研究所德Investigaciones的Biomédicas - 墨西哥国立自治大学的批准下。
2. 将2毫升在PBS中的6％葡聚糖T500到15毫升锥形离心管中，并加入10毫升的血液。颠倒试管混合两次或三次，并让它坐45分钟，以允许血沉。
3. 在一个新的15毫升锥形离心管中，将5毫升的Ficoll-Paque联合应用。
4. 以富含白细胞的血浆上方形成沉淀的红细胞，并仔细吸取试剂的Ficoll-Paque联合形成的第二层的顶部上。确保有两个阶段。
5. 在4℃下离心20分钟，在516×g离心离心分离后，在血浆和Ficoll-Paque的相间有单核细胞的层。氖在试管底部utrophils是。
6. 消除上清液，通过轻敲管针对机架打破细胞沉淀，重悬细胞，加入10毫升冷的（4℃）的PBS。 注:重悬细胞通过上下吹打不推荐使用，因为这是太破坏细胞。
7. 细胞悬浮液转移到50毫升锥形离心管中，离心，在290×g离心5分钟，在4℃下
8. 如前额的细胞沉淀，并加入10毫升冷的（4℃）低渗溶液（0.2％的NaCl，1％BSA的20mM的Hepes，pH值= 7.4），以溶解红细胞。混合管用手轻轻摇晃了整整一分钟。
9. 加入1....

Results

这里所描述的纯化方法通常提供未受刺激的嗜中性粒细胞（PMN）的纯度大于95％（ 图1A）。隔离PMN然后，可以通过交联的特定受体的特异性单克隆抗体的刺激。我们已刺激的PMN通过Fc受体和整合（ 图1B）。一旦受到刺激，中性粒细胞裂解和细胞核被隔离，产量高。细胞核，然后为一个特定的核转录因子核因子κB（NF-κB），与特定的抗体（ 图1B），如immunolabeled。

作为一个不同的人口从完整的中性粒细胞与一个点图（ 图2A）的流式细胞仪中的原子核，可以很容易地确认。在静息中性粒细胞基础水平的NF-κB在细胞核内（ 图2B）。通过交联β1整合素刺激后，NF-κB被转运到细胞核内，这个增量在核的NF-κB的耳鼻喉科检测到的荧光的增加（ 图2B）。同样地，通过交联β2整合也刺激的PMN诱导的NF-κB活化，所表示的荧光的增加（ 图2C）。了该方法的灵.......

Discussion

这里所描述的纯化方法允许隔离未受刺激的嗜中性粒细胞（PMN）的纯度大于95％（通过显微镜观察评估），在很短的时间。有时，中性粒细胞被污染的红细胞，如果后者不完全溶解。通常这并不影响技术，通过流式细胞仪检测，因为红细胞和中性粒细胞可以很容易地被区分为不同的细胞群。隔离PMN然后，可以通过交联的特定受体的特异性单克隆抗体的刺激。事实上，中性粒细胞也可以被刺激的药理装置或通过粘合的各种基材上或其它细胞。这里介绍的方法可用于分析的信号转导途径，导致在中性粒细胞的细胞核的核因子的变化，细胞被激活后，由几乎任何相关的生物刺激。

一旦中性粒细胞有刺激作用，本文中所描述的方法可以快速，effici核耳鼻喉科净化和检测，在这些细胞核中NF-κB免疫荧光和流式细胞仪分析。 PMN刺激某些受体后，在细胞质中的NF-κB被释放及其抑制剂IκB，然后traslocated到细胞核中（ 图1B）。因此，NF-κB活化的水平确定的量，在细胞核中NF-κB的本。因为这种方法可以检测和测量NF-κB在细胞核中，它可以很容易地确定这种核转录因子的激活。以类似的方式，该方法可以检测其他.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
试剂
肝素	PiSA（墨西哥）
葡聚糖 T500	Pharmacosmos A/S（丹麦霍尔贝克）	T1-葡聚糖 T500
Ficoll-Paque	Pharmacia	17-0320-01
氯化钠	Sigma	S7653
磷酸二氢钠	Sigma	S9638
磷酸氢二钠	Sigma	S9390
牛血清白蛋白 （BSA）	Sigma	A2153	Cohn 馏分 V
HEPES	Sigma	H3375
氯化钾		Sigma P9541
无水氯化镁	Sigma	M8266
DL-二硫苏糖醇 （DTT）	Sigma	D9163
台盼蓝（0.4% 溶液）	Sigma	T8154
多聚甲醛	Sigma	P6148
Triton X-100	Sigma	X100
胎牛血清 （FBS）	GIBCO	10437-028
单克隆抗体 IV.3	Medarex（新泽西州安南代尔）	025-1	人特异性抗 FcRII （CD32）
单克隆抗体 3G8	Medarex （Annandale， NJ）	028-2	人特异性抗 FcRIII （CD16）
单克隆抗体 TS2/16	Dana Farber 癌症研究所 （波士顿，马萨诸塞州）	由 Martin Hemler 博士捐赠	人特异性抗 -β1 整合素 （CD29）
单克隆抗体 IB4	大学旧金山	由 Eric J. Brown 博士捐赠	人类特异性抗 -β2 整合素 （CD18）
F（ab'）2 山羊抗小鼠 IgG	Cappel （Aurora， OH）	55468
FITC偶联的F（ab'）2山羊抗小鼠IgG	Cappel （Aurora， OH）	55522
FITC偶联的F（ab'）2山羊抗兔IgG	Cappel （Aurora， OH）	55665
抗-NF-κB p50	Santa Cruz Biotechnology （Santa Cruz， CA）	sc-114	兔多克隆抗体
抗 NF-κB p65	Santa Cruz Biotechnology （Santa Cruz， CA）	sc-109	兔多克隆抗体
EQUIPMENT
15 ml 离心管	康宁	430791
50 ml 离心管	康宁	430291
离心机，Sorvall 台式	杜邦仪器	RT 6000D
pH 计	康宁	340
Pipetman 移液器 P-20	Gilson	F123600
移液器 P-200	Gilson	F123601
Pipetman 移液器 P-1000	Gilson	F123602
血球计数器	Fisher Scientific	0267110
显微镜	Nikon	Eclipse E600
倒置显微镜	尼康	TMS
水浴培养箱	Fisher Scientific	2IS-M
微量离心机	Eppendorf	5414C
微量离心机	Eppendorf	5418
流式细胞仪	Becton Dickinson（新泽西州富兰克林湖）	FACScalibur