用于局部组织病理学分析的视网膜植入假眼处理技术

摘要

用于直接可视化视网膜刺激器中单个电极邻近视网膜细胞结构的技术。

摘要

随着视网膜假体技术的近期发展，在临床前研究中建立评估这些装置安全性的可靠技术变得尤为重要。然而，传统的固定、制备和自动化组织学方法并不理想。本文描述了一种用于直接评估植入物邻近视网膜健康状况的新方法。视网膜假体包含与眼部组织接触的电极阵列，而以往的方法无法在空间上精确定位阵列中单个电极附近的 ocular 组织。此外，在评估植入眼时，标准组织学处理常导致视网膜各层出现明显的伪影性脱离。因此，难以准确评估植入和电极阵列刺激是否造成了局部损伤。为此，我们开发了一种利用（彩色编码）染料标记方案来识别和定位植入电极邻近 ocular 组织的方法，并改进了眼球固定技术以最大程度减少视网膜伪影性脱离。该方法还可使巩膜变为半透明状态，从而实现对单个电极及植入物特定部位的定位。最后，我们采用配对对照设计以增强组织病理学评估的统计效能。综上所述，该方法可实现对植入眼内视网膜细胞结构的可靠、高效区分与评估。

引言

视网膜假体有望很快成为治疗多种严重视力丧失的有用临床干预手段。某些疾病，例如视网膜色素变性（RP），会导致眼球内光感受器广泛退化；这些细胞负责将光转化为神经信号。然而，视网膜其他层中仍保留部分细胞，可作为视网膜假体进行电刺激的潜在靶点¹。早期的人体临床试验结果表明，植入于视网膜表面（epiretinal）^2,3、视网膜下（subretinal）^4,5 和巩膜内（intrascleral）⁶ 位置的电极阵列具有前景。这些装置由不同材料制成，形状各异，但均通过电脉冲激活视网膜中尚存的可存活神经元，以产生视觉感知。

我们更大的研究团队（Bionic Vision Australia）开发了一种植入式视网膜假体，目前已进入临床试点研究阶段，已有3名视网膜色素变性（RP）患者植入了脉络膜上电极阵列（临床试验编号：NCT01603576）。图1A展示了这种脉络膜上型原型视网膜假体。

在临床研究中，患者安全至关重要。因此，在开展人体试验之前，我们已在临床前模型中进行了广泛的急性和慢性测试（图1B）。组织病理学评估对于优化手术操作、迭代电极设计以及最终确立植入物的安全性至关重要。为了与标准临床病理实践相衔接并保持高效的工作流程，采用了石蜡包埋技术。同时，我们希望采用与临床标准相一致的染色方法，例如苏木精和伊红（H&E）染色，以便病理学家能够快速准确地判读结果。此外，我们还希望该技术可适用于免疫组织化学分析，以进一步促进对组织细胞水平的评估。

植入材料的生物相容性以及慢性电刺激的安全性需要进行仔细评估。必须能够检查阵列中各个刺激电极附近眼组织的组织病理学情况。然而，在样本处理前需要先移除电极阵列以便进行检测，且由于其金属成分难以进行切片。因此，我们既往建立的组织制备方法无法实现对组织与植入电极之间位置关系的精确定位和映射⁷。除了缺乏组织定位方法外，传统的基于甲醛的固定和处理技术还会因眼球各层组织收缩程度不同而导致广泛的组织伪影以及视网膜脱落（图2）。由于视网膜组织具有高度异质性，与对照组织进行有效比较十分困难，尤其是在进行定量测量时。上述因素共同导致对植入电极可能造成的组织损伤进行准确评估变得复杂。

本文介绍了克服这些局限性的新方法。我们改进了专用的眼球固定和处理技术^8-10，以保持与石蜡包埋组织学的兼容性。根据临床病理学家的反馈，我们优化了标准组织学和免疫组织化学染色方法，使其获得可比的结果。在使巩膜组织透明化后，采用基于染料的颜色编码标记每个电极邻近的眼部组织，然后将电极阵列从脉络膜上腔移除。通过标记电极阵列及各个电极位点，可精确采集电极邻近区域的组织样本。同时可从对照眼采集匹配样本，以便进行配对比较。

方案

1. 去核与后固定

本方案假设受试者已单侧植入脉络膜上腔电极阵列。

1. 在玻璃肖特瓶中配制固定后溶液。
   1. Davidson 固定液，2×100 ml
      • 2 ml 甲醛（37% 甲醛）
      • 10 ml 冰醋酸（99.7%）
      • 35 ml 乙醇（98%）
      • 53 ml 蒸馏水
   2. 50% 乙醇，2×100 ml
   3. 70% 乙醇，2×100 ml
2. 经心脏灌注温热（37 °C）含肝素生理盐水，随后灌注冷（4 °C）中性缓冲甲醛（10%）。
3. 在双眼的上方角膜缘（或远离脉络膜上腔阵列的位置）绑扎缝线，沿直肌方向，作为解剖标志。
4. 摘除眼球，保留植入眼的任何外部引线。
5. 将每只眼球置于 100 ml Davidson 固定液中，室温下继续固定。
6. 在 Davidson 固定液中固定 18–36 小时后，转移至 50% 乙醇（室温）中 6–8 小时，最后转移至 70% 乙醇（室温）中。
7. 将样品在 4 °C 下冷藏保存，直至进行解剖。

完整且加压的眼球以此方式保存长达3个月，不会对最终的组织学结果产生不利影响。

2. 鉴定与组织定位

上述固定步骤（步骤1）已使巩膜变为半透明，阵列现在可见——包括各个电极位点（图3）。

1. 从乙醇中取出植入的眼球，仔细修剪掉多余组织，包括结膜和滕囊。将视神经修剪至 2 - 3 mm 长度（图 3A）。
2. 使用组织学染料标记方案，按照预设的颜色编码标记电极，注意避免染料污损。

• 我们选用了一种市售的专用组织学染料（参见附录）。用细头画笔（Roymac 00号）将少量染料小心地涂抹于组织上，并静置晾干，时间最长可达5分钟。
• 根据本研究需要，我们设定如下颜色编码：绿色表示在研究期间以超阈值强度进行最大程度刺激的主动电极；红色表示其他主动电极；黄色表示直径较大的回路电极；蓝色用于额外的引导标记和/或解剖距离标记（图3B和3C）。
• 可能需要经过若干次尝试才能找到一种在后续步骤中保持稳定的染料。例如，在图4中可以看出，绿色染料比红色染料更稳定。将染料用70%乙醇稀释有助于提高其对脂质的渗透性和组织覆盖效果。
• 建议对染色后的标本进行草图绘制或拍照，以供后续参考。

3. 返回70%乙醇中以脱水去除染料。
4. 对未植入的对照眼球重复步骤2.1。
5. 利用步骤1.3中的缝线，将对照眼与植入眼以镜像配对方式对齐。
6. 在对照眼上与植入眼相对应的镜像位置放置一个硅胶模板（尺寸与电极阵列相同），以模拟植入位置（N.B. 半透明的巩膜以及步骤2.2中的染料标记可清晰显示植入阵列的位置）。
7. 对对照眼执行步骤2.2和2.3，使得每个植入电极位点均有一个解剖位置相对应（i.e. 镜像匹配的等效位置）的对照配对位点。

3. 解剖与包埋

1. 将植入阵列从眼球中取出，并移除眼球前部（包括角膜、虹膜和晶状体）。从剩余的眼杯（后房）中去除玻璃体液。
2. 将植入的眼球解剖成多个具有代表性的条状组织（厚度约2 mm），每个条状组织包含部分染料标记区域（图3D）。注意，条状组织的取向应有助于评估组织对植入物反应的各个方面⁷。

为了便于日后参考，建议记录每条带上存在的染料区域及其相对位置（和颜色）。

3. 将条带侧放于浅层液化琼脂（4%；80 - 90 °C）中，使首先切割的一侧朝下图3E).
4. 琼脂凝固后，沿样本周围切割，并将其放入由泡沫垫片支撑的组织包埋盒中（图3F).
5. 重复步骤 3.1–3.3 对照眼的操作——注意解剖出镜像匹配的条带。
6. 处理所有包埋盒 通过 标准（自动化过夜）石蜡包埋处理技术
7. 将处理好的组织包埋于石蜡中，待切面朝下。

4. 切片与染色

1. 根据步骤2和步骤3的记录，将石蜡块切成5 μm的切片。
2. 收集来自各染色区域的切片，并将其贴附于载玻片上。

现在可以有把握地评估每个染色巩膜斑点附近的区域，因为这些区域在阵列中与相应的电极距离最近（图4）。

3. 根据需要进行染色或免疫荧光操作。图5中所示的染色示例和免疫组织化学包括：苏木精-伊红（H&E）；Luxol快蓝（LFB）；焦油紫（cresyl violet）；Masson三色蓝（Masson's trichrome blue）；过碘酸雪夫（PAS）；普鲁士蓝染色（Perls' Prussian blue stain）；谷氨酰胺合成酶抗体（anti-glutamine synthetase, GS）；神经丝蛋白抗体（anti-neurofilament protein, NF）；胶质纤维酸性蛋白抗体（anti-glial fibrillary acidic protein, GFAP）以及4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）。
4. 标准染色与特殊染色操作步骤如下：
   1. 按照Leica多染机ST5020（Leica Biosystems）提供的方案进行H&E染色。
   2. LFB和焦油紫染色（改良自¹¹）：
      1. 在三批二甲苯中脱蜡（3次，每次2分钟），再在两批乙醇中（100%，100%）（2次，每次1分钟），然后用自来水冲洗（45秒）。
      2. 将切片水化至95%乙醇。
      3. 将切片置于LFB溶液¹¹中，在37–42 °C孵育（过夜）。
      4. 用70%乙醇洗去多余染液。
      5. 用蒸馏水冲洗。
      6. 置于稀释的碳酸锂（8%）中（数秒）。
      7. 在70%乙醇中分化（数秒）。
      8. 用蒸馏水冲洗。
      9. 如有必要，重复步骤4.4.2.6至4.4.2.8，直至背景无色。
      10. 在37 °C下用焦油紫乙酸工作液孵育（10分钟）。
      11. 不要用水洗涤。
      12. 在三批无水乙醇中脱水（1次30秒，2次各20秒），再在三批二甲苯中（1次1分30秒，2次各1分钟）。
      13. 用DPX封片剂封片。
   3. Masson三色蓝染色（改良自¹¹）：
      1. 按步骤4.4.2.1脱蜡。
      2. 将切片水化至水中（2分钟）。
      3. 用Weigert铁苏木精染细胞核（2分钟）。
      4. 用自来水冲洗，再用蒸馏水漂洗。
      5. 用猩红-酸性品红溶液染色（5分钟）。
      6. 用蒸馏水冲洗。
      7. 用磷钼酸-磷钨酸溶液分化，直至胶原呈淡粉色（6分钟）。
      8. 用蒸馏水冲洗。
      9. 用苯胺蓝复染（1分钟）。
      10. 在1%乙酸中充分洗涤（1分钟）。
      11. 脱水、封片和盖片操作同步骤4.4.2.12和4.4.2.13。
   4. PAS染色（改良自¹¹）：
      1. 按步骤4.4.2.1脱蜡。
      2. 在1%过碘酸中氧化（15分钟）。
      3. 用流水冲洗后，再用蒸馏水冲洗。
      4. 用Schiff试剂染色（15分钟）。
      5. 用水冲洗（5分钟）。
      6. 用Harris苏木精复染（1分钟）。
      7. 用自来水短暂冲洗。
      8. 在0.5%酸性乙醇中分化（1次浸洗）。
      9. 用自来水充分冲洗。
      10. 在Scott自来水（模拟自来水）中返蓝（1分钟）。
      11. 充分用水冲洗。
      12. 脱水、封片和盖片操作同步骤4.4.2.12和4.4.2.13。
   5. 普鲁士蓝染色（Perls' Prussian blue stain）操作如文献¹¹所述。
5. 免疫荧光染色操作步骤如下：
   1. 按步骤4.4.2.1脱蜡。
   2. 用蒸馏水冲洗（2次，每次5分钟）。
   3. 使用pH 6的0.01%柠檬酸缓冲液，在75–80 °C进行抗原修复（20分钟），然后在0.01%柠檬酸缓冲液中冷却（20分钟）。
   4. 用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤切片（2次，每次5分钟）。
   5. 在洗涤缓冲液中通透细胞膜（10分钟）。
   6. 用血清封闭液孵育（2小时）。
   7. 将切片与单一的一抗在抗体稀释液（10%正常山羊血清/0.1% Triton X-100/PBS）中稀释后孵育（4 °C过夜）。所用各一抗的滴度见表1。
   8. 过夜孵育后，用洗涤缓冲液洗涤切片（5次，每次3分钟）。此后所有步骤均需避光操作。
   9. 将切片与相应二抗在1:500滴度下孵育特定时间（具体时间见表1）。
   10. 用洗涤缓冲液洗涤切片（3次，每次5分钟）。
   11. 将切片与DAPI（1:25,000 / PBS）孵育（30分钟）。
   12. 用洗涤缓冲液洗涤切片（3次，每次5分钟）。
   13. 使用荧光封片剂封片并加盖盖玻片。

测试样本和对照样本已准备好进行成对比较。

结果

图4展示了从图3所示样本切取的一个代表性切片。该切片厚度为5 μm，按照上述方案使用H&E染色。样本条带的整体形态得以保留，且组织人工假象极少（图4A）。两种染料标记在巩膜上均可见，但绿色染料比红色染料更稳定（图4B）。视网膜各层未出现人为分离，视网膜形态结构保存良好（图4C）。紧邻染料标记的视网膜组织——对应于阵列中电极的位置——可被清晰识别。

图5展示了根据本实验方案制备的组织切片的代表性特殊染色和免疫组织化学结果。有关特定染色方法及其使用过程中所做修改的更多细节，请参见图5的图注和补充材料。经修改后，这些染色和免疫组织化学方法的结果与既定标准相当，已由病理学家验证确认。

一抗类型及稀释度（括号内）	GFAP (1:1500)	NF200 (1:100)	GS (1:100)
二抗类型及稀释度（括号内）	Alexa Fluor 594	Alexa Fluor 488	Alexa Fluor 488
二抗孵育时间	1 hr	2 hr	45 min

表1. 抗体类型、滴度及标记持续时间。

图1. 脉络膜上腔原型电极阵列。A) 临床级模制阵列的宏观照片。 B) 手工制作的临床前阵列的显微照片。

图2. 既往视网膜组织学。 采用标准的组织学方法制备这些样本，H&E染色后，植入脉络膜上电极阵列的眼部切片。 A) 电极阵列腔横截面（以星号标示）。视网膜自眼球外层组织脱离，尤其在植入区域下方更为明显（箭头所示）。无法确定视网膜的哪一部分曾邻近阵列中的各个电极。比例尺 = 1 mm。 B) 图中面板方框区域的更高倍数放大图 A视网膜各层中存在多个规律分布的人工伪影（箭头所示），以及脉络膜照膜层（猫眼中的反光层）的大范围脱离。比例尺 = 100 μm。 C) 图中面板方框区域的更高倍数放大图 B箭头指示光感受器的外节段以及保持完整的色素上皮，提示该脱离是制备过程中的人为假象副作用，而非由某种原因引起 体内 创伤或病理变化。比例尺 = 20 μm。

图3. 电极邻近组织的定位与解剖 A-D) 高动态范围宏摄影图像，显示一枚去核眼球及脉络膜上腔电极阵列 原位 A) 用 Davidson 固定液固定后，在移除阵列之前，透明的巩膜可使阵列中的各个电极清晰可见（箭头所示为单个示例）。 B) 电极用预定义的染料颜色标记。 C) 在解剖学标志点处以固定间距进行染料标记，以确保实验间的一致性。 D) 取出阵列后，手工将眼球解剖成样本条。彩色箭头指示巩膜上两个电极邻近位点。黄色虚线表示切片平面。 E) 琼脂块中嵌入的样品条宏观照片。 F) 琼脂包埋样品条的宏观照片（来自图示面板） E，剪下后置于包埋盒中，并用泡沫活检垫支撑，以减少处理过程中切片的移动。

图4. 新的视网膜组织学图像。 上述样本条带（来自图3D），包含电极袋，经石蜡包埋后切片，厚度为5 μm，并用H&E染色。A) 在与图3D中黄色虚线对应水平的切片中，可见绿色和红色染色区域（由箭头指示，同图3D）。比例尺 = 1,000 μm。视网膜未发生脱离，无论是在阵列袋下方还是远端区域均如此。B) 来自图A中标记框选区域，可见由箭头指示的红色和绿色染料，且视网膜结构完整。比例尺 = 500 μm。C) 来自图B中标记框选区域，显示紧邻绿色染料的视网膜结构完整且附着良好。比例尺 = 50 μm。由于染料位置可指示电极所在位置，因此我们可以准确评估电刺激是否对邻近视网膜组织造成任何损伤。

图 5. 使用特殊染色和免疫荧光技术改良的视网膜细胞组织化学示例。 与标准的福尔马林固定方法相比，使用 Davidson 固定液需要对常规染色方案进行调整，具体修改内容已在主实验方案文本中说明。病理学家已确认，这些修改后的方案可获得等效的染色结果。A) 苏木精-伊红染色（H&E）；苏木精将细胞核染成紫色，伊红则将细胞质、胶原蛋白和支持组织染成不同深浅的粉红色。B) 镀银-焦油紫染色（LFB）；LFB 将髓鞘染成蓝色，而焦油紫复染可用于识别神经节细胞，其通过将胞体内的尼氏小体染成蓝色，并突出显示环绕细胞的卫星细胞。C) 马松三色蓝染色（Masson's trichrome blue）；碱性品红-酸性品红溶液将肌纤维染成红色，而苯胺蓝将胶原染成蓝色，在本图中为巩膜。D) 过碘酸-雪夫染色（PAS）；基底膜和结缔组织中的糖蛋白成分被染成紫色，同时苏木精复染使细胞核呈紫色。E) 普鲁士蓝染色（Perls' Prussian blue）；在出血部位，红细胞降解后形成的含铁血黄素及释放的铁复合物呈现紫色，而加入中性红染料可将溶酶体染成红色。F) 谷氨酰胺合成酶（GS）；该神经递质降解酶存在于 Müller 细胞中¹³（绿色），可见其从内核层的 Müller 细胞胞体向两侧延伸，其终足构成内界膜。G) 神经丝蛋白 200（NF-200）；该重链细胞骨架蛋白（绿色）存在于细胞胞体及突起中，可与其他神经丝交联以维持神经元结构^14,15。在神经节细胞层和神经纤维层中可见神经节细胞及其轴突，同时在猫视网膜内核层外缘处的水平细胞轴突也被清晰标记。使用 DAPI（蓝色）复染可清晰显示视网膜各层结构。H) 胶质纤维酸性蛋白（GFAP）；该细胞骨架蛋白（红色）在胶质增生过程中于 Müller 细胞和星形胶质细胞中大量表达¹⁶，可见其沿神经纤维层分布，Müller 细胞形成细长突起贯穿内层至外层视网膜。使用 DAPI（蓝色）复染有助于视网膜各层结构的观察。所有图中比例尺 = 50 μm。每幅图像顶部显示为内层视网膜；底部为外层视网膜，图 E 除外，其显示的是巩膜下反应。

讨论

评估植入物的安全性是临床前研究中的首要考虑因素。在将视网膜假体植入人体之前，必须验证其不会造成任何损害。这需要评估植入物的生物相容性^17-23，以及慢性电刺激可能引起的潜在组织损伤^24-26。借鉴类似神经假体（如人工耳蜗）的经验，可为不会引起组织损伤的电刺激参数及物理参数范围提供参考依据²⁷。然而，视网膜与其他植入部位具有不同的特性，因此不能直接从其他系统的既往研究中推断其精确的安全限值（如最大电荷密度）。电荷密度在活性电极位点处最高，这也对应着最大的损伤风险。因此，若能建立一种方法以准确定位各单个活性电极附近的组织，将显著提高此类研究的价值。此外，还可针对假体特定区域邻近的组织进行重点标记，以便更细致地检查。这种靶向性方法可在确保评估了“最不利情况”的前提下，减少所需分析的切片数量。

本文所述的巩膜染料定位方法已广泛应用于手形和模制的硅胶/铂电极阵列^28-30。该方法也已用于薄膜聚酰亚胺阵列^7,31以及薄膜硅胶/铂阵列³²。一些视网膜假体研究采用了带有巩膜内植入的“子弹形”电极³³。本技术应可用于评估此类电极阵列。在巩膜较薄（后极厚度为90 - 200 μm）的猫眼中，可清晰观察到阵列中的单个电极。然而，即使单个电极不可见，只要能够看到阵列的轮廓，即可通过硅胶模板轻松推断其位置（类似于步骤2.6中所使用的模板）。

染料标记法可减少获取无关组织切片的需求，仅需获取含有染料的切片。准确推断电极位置的能力不仅有助于进行相关的组织病理学分析并提高统计效能，而且通过减少所用载玻片和刀片的数量以及降低人力成本，显著改善了时间和成本管理。选择一种具有黏附性、能够耐受组织处理过程且在未染色组织切片中仍可见的染料，是重要的初始考量因素。在解剖及包埋过程中了解染料的位置和组织的方向，有助于切片操作，包括正确地定位组织块，以获得非斜切的切片，并完整呈现组织结构。因此，执行切片操作的人员应在染料标记、解剖和包埋时在场。

总体方案对微小的改动具有较强的耐受性，尤其是在固定时间方面。然而，眼球解剖和染料标记步骤属于精细操作，需要良好的手工技巧，以避免损伤样本。尽管Davidson固定液已被证明可有效减少植入物附近视网膜的人为脱离现象，但其无法防止在解剖过程中造成的直接机械损伤。此外，Davidson固定液与某些特殊的组织学和免疫组织化学方法相容性较差。因此，有必要如上文所述对这些步骤进行修改和优化。通过逐步调整染色时间和试剂浓度，直至获得最佳效果；更多细节请参见补充材料。

视网膜组织学的定量分析仍然存在困难。视网膜并非均质结构，其厚度和细胞密度随着距中央区距离的增加而发生变化^34,35。因此，无法使用植入眼内的邻近组织进行比较，而需采用对照眼作为参照。将每一组织切片与对照眼进行配对匹配，可更有力地对病理改变进行统计学比较；在评估受试者双眼间视网膜假体的疗效和安全性结果时，这种同体对照眼的比较方法更为可靠³⁶。必须特别注意尽量减少斜切现象，因为这会影响定量结果的准确性。

综上所述，上述方法显著改进了我们的组织病理学分析，从而实现了更高效的临床前工作流程。采用这些方法开展的临床前研究结果直接推动了一项临床试验的实施，已有3名视网膜色素变性（RP）患者成功植入了脉络膜上视网膜假体，且安全性良好。这些方法不仅适用于视网膜刺激器，也适用于其他需要评估长期植入后病理反应的眼内植入物。该方法在维持细胞结构完整性以及将病理变化准确定位至植入物感兴趣区域方面提供了显著优势。尽管尚未进行专门验证，但对这些操作流程稍加改进后，可能也可应用于其他物种及其他解剖部位，尤其是当阵列被浅表植入时。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
戴维森标记系统	Bradley Products	1163-4 - 红色 1163-5 - 蓝色 1163-2 - 黄色 1163-1 - 绿色
兔多克隆胶质纤维酸性蛋白抗体	Millipore	AB5804	1:1500，过夜孵育
小鼠单克隆抗谷氨酰胺合成酶抗体	Millipore	MAB302	1:100，4°C 过夜孵育
单克隆小鼠抗神经丝蛋白200抗体	Sigma-Aldrich	N0142	1:100，4°C 过夜孵育
4',6-二脒基-2-苯基吲哚，双乳酸盐（dilactate）	Life Technologies	D3571	1:25,000，孵育30分钟
Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠 IgG	Life Technologies	A11029	1:500
Superfrost 90° 黄色	Grale Scientific	SF41299
FLEX IHC 显微镜载玻片	DAKO	K802021-2
Alexa Fluor 594 山羊抗兔 IgG	Life Technologies	A11037	1:500
正常山羊血清	Life Technologies	PCN5000	10% 血清/0.1% Triton X-100/PBS
特殊染色用非常规溶液的配制 1% 水性焦油紫储备液 甲苯胺蓝 1 g 蒸馏水 100 ml 乙酸焦油紫工作液 1% 水性焦油紫储备液 9 ml 蒸馏水 51 ml 10% 乙酸 0.5 ml 比布里希猩红-酸性品红溶液 1% 贝赫里希猩红 90 ml 1% 酸性品红 10 ml 冰醋酸 1 ml 磷钼酸-磷钨酸溶液 磷钼酸 2.5 g 磷钨酸 2.5 g 蒸馏水 100 ml 苯胺蓝溶液 苯胺蓝 2.5 g 冰醋酸 2 g 蒸馏水 100 ml 免疫组织化学溶液 洗涤缓冲液溶液 磷酸盐缓冲液（PBS）中含 0.1% Triton X-100 血清封闭液 PBS 中含 10% 正常山羊血清/0.1% Triton X-100 补充材料 劳梭快蓝 进行Luxol快蓝（Luxol Fast Blue, LFB）染色的目的是通过焦油紫（cresyl violet）复染来鉴定神经节细胞层中的神经节细胞。LFB可染色髓鞘，而焦油紫则结合神经元中的尼氏物质（Nissl substance），后者由粗面内质网和核糖体组成。视网膜中多种细胞含有尼氏物质，包括无长突细胞。这些细胞通常位于内核层的内界膜层，但也可在神经节细胞层中发现异位的无长突细胞。尼氏物质的染色有助于区分染色深、体积较大的神经节细胞与体积较小的异位无长突细胞。为增强这些细胞的可视性，我们对焦油紫工作液的配制方案进行了改良，通过增加工作液中焦油紫储备液的体积来优化染色效果。我们将焦油紫储备液的体积以1.0 ml为增量，从6.0 ml逐步增加至9.0 ml，相应减少蒸馏水的体积。通过评估神经节细胞的可视性与可辨识性，发现当加入9 ml焦油紫储备液与51 ml蒸馏水时，染色效果最佳。焦油紫为碱性染料，但要染色尼氏物质，需在酸性条件下使用，因此乙酸的体积保持不变，为0.5 ml。 过碘酸雪夫 过碘酸雪夫（Periodic Acid Schiff, PAS）染色用于突出显示多糖，尤其是基底膜和真菌细胞壁中的糖原，以提示真菌感染。PAS染色的原理是利用过碘酸氧化多糖中的羟基，生成醛基；随后加入雪夫试剂，与醛基结合产生品红色，再经苏木精复染使细胞核呈紫色。我们的切片显示内界膜处染色较弱，可能与多糖的存在有关，因为并非所有多糖均可在标准氧化时间内被充分氧化，特别是含有阴离子多糖的结构。因此，我们将氧化步骤的时间从10分钟延长至12、15和20分钟。结果表明，15分钟的氧化时间在PAS染色中效果最佳。 马松’s 三色蓝 Masson三色蓝染色法的原理是染色胶原和肌肉组织，在我们的视网膜切片中可用于指示胶原组织的增加，从而提示可能因损伤引起的纤维化。该染色方法对固定技术敏感，因此需要进行调整以获得最佳染色效果。该染色过程首先使用酸性比布里奇猩红-酸性品红红色染料对细胞质和肌纤维进行红色染色。随后用磷钼酸/磷钨酸进行分化，竞争胶原纤维中的红色染料。在巩膜中，较大的磷钼酸/磷钨酸分子能够穿透疏松结缔组织，而致密的肌纤维仅允许小分子渗透。接着应用苯胺蓝染料取代胶原纤维中的酸，使巩膜呈现蓝色染色。为了在视网膜切片中优化该染色效果，将比布里奇猩红-酸性品红染料的染色时间缩短，以平衡蓝色与红色染料的显色。此外，使用Davidson固定液时还需延长分化时间，以充分去除胶原中的红色染料。我们尝试了5、6、8和10分钟的分化时间，最佳结果出现在6分钟。分化时间还受切片厚度和平整度的影响，可能需要超过6分钟的分化时间。 胶质纤维酸性蛋白（GFAP）抗体 多克隆，宿主物种为兔，分子量为50 kDa。GFAP抗原是一种中间丝蛋白，存在于细胞质中（星形胶质细胞和Mü视网膜中的 Müller 细胞），该抗原由 428 个氨基酸组成，分子量为 49512 Da。 神经丝蛋白-200抗体 单克隆抗体，宿主物种为小鼠，克隆号 N52，同种型为 IgG1，可识别分子量为 200 kDa 的重链神经丝蛋白的磷酸化与非磷酸化形式。该抗体可结合神经丝蛋白尾部结构域的表位。该抗体可标记神经元胞体、树突和轴突中的神经丝。 谷氨酰胺合成酶（GS）抗体 单克隆抗体，克隆号 GS-6，宿主物种为小鼠，分子量为 45 kDa，抗体同种型为 IgG2a。GS 抗原位于细胞质中（M 细胞质中）ü视网膜中的 Müller 细胞），该抗原含有 373 个氨基酸，分子量为 42,064 Da。