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方法文章

大鼠中枢神经系统及外周淋巴结组织切片的免疫组织化学分析

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DOI：

10.3791/50425

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2016年11月14日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Clinical Neuroscience, Neuroimmunology Unit, Center for Molecular Medicine, Karolinska Institutet, 2Department of Neuroimmunology, Center for Brain Research, Medical University of Vienna, 3Department of Medical Biochemistry and Biophysics, Vascular Biology Unit, Karolinska Institutet

本文内容

摘要

本文介绍了一种优化的详细方案，用于对甲醛固定、石蜡包埋的大鼠中枢神经系统（CNS）和外周淋巴结（LN）组织切片进行双重免疫染色。

摘要

免疫组织化学（IHC）可实现高度特异、可靠且直观的蛋白质可视化。基于IHC的多色标记实验的正确操作与结果解读具有挑战性，尤其是在评估富含脂肪组织（如中枢神经系统，CNS）中靶蛋白之间相互关系时更为复杂。

本方案是对标准免疫标记技术的优化，特别适用于检测受神经炎症影响的大鼠中枢神经系统及外周淋巴结（LN）中的结构蛋白和可溶性蛋白。然而，无论是否进行进一步修改，本方案也可能用于检测其他相关蛋白靶点，甚至适用于本文所述以外的其他器官和物种。

引言

尽管已采用针对甲基化组、转录组甚至蛋白质组水平的先进高通量分析技术，免疫染色仍然是在组织样本、细胞培养物或细胞涂片中直接检测蛋白质的金标准。通过揭示目标蛋白的定位/分布模式，免疫组织化学（IHC）可评估其相对比例和空间拓扑关系，甚至提示其生物学活性。因此，IHC 被广泛应用于临床诊断和科学研究。 例如用于疾病诊断、治疗评估、疾病机制研究以及动物模型中的功能与表型改变分析， 等等。

免疫组织化学（IHC）本质上涵盖了组织学、病理学、生物化学和免疫学，自1941年首次使用荧光标记的抗体鉴定感染组织中的Pneumococcal抗原以来，已取得显著进展1。IHC通过抗体（Abs）与其特异性抗原（Ag）的结合来实现对细胞产物和组分的可视化。除了使用荧光素标记的抗体外，还可利用过氧化物酶2,3或碱性磷酸酶4等酶来显示免疫反应。此外，胶体金标记的抗体5可用于光学显微镜和电子显微镜下检测特异性的抗原-抗体相互作用，而放射性标记则通过自显影技术进行可视化。

抗原-抗体免疫反应可通过直接法和间接法进行检测。直接法本质上更快、更简单，因其使用直接标记的一抗6。然而，由于其灵敏度显著较低，通常更倾向于采用间接法。两步间接检测法首先使用未标记的一抗，然后使用针对一抗的标记二抗作为第二层7。通过引入与二抗结合的酶偶联三抗（三步间接法），可实现信号放大。常用的间接检测方法包括亲和素-生物素法和过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）法。此外，也可使用碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶（APAAP）复合物替代PAP法。值得注意的是，碱性磷酸酶（AP）法的灵敏度似乎甚至高于免疫过氧化物酶法4。亲和素-生物素复合物（ABC）法采用生物素化的二抗，与标记的亲和素-生物素复合物（LAB）或标记的链霉亲和素-生物素复合物（SLAB）联合使用。通过使用过氧化物酶或碱性磷酸酶标记的亲和素，可进一步提高检测灵敏度8。其他正在使用的检测方法还包括聚合物标记法、酪胺信号放大法和免疫滚环扩增法9。值得注意的是，不同的检测方法可联合用于同一组织样本中的多种抗原检测，该技术最早于1978年被报道4。本文所展示的双重免疫染色实验分别在福尔马林固定、石蜡包埋的大鼠中枢神经系统（CNS）和淋巴结（LN）组织切片上进行，分别使用了过氧化物酶标记和AP偶联的二抗。信号分别通过3,3'-二氨基联苯胺（DAB）显色剂和Fast Blue（FB）APAAP复合物进行显色。

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方案

伦理声明
本研究严格遵循瑞典实验动物管理局指南和欧洲共同体理事会指令（86/609/EEC），并在经北斯德哥尔摩动物伦理委员会批准的伦理许可 N338/09、N15/10 和 N65/10 下进行。

1. 组织制备

  1. 灌注 & 固定
    1. 使用异氟烷麻醉动物，经左心室进行心脏灌流。先用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗血管系统以去除血液成分，随后灌注0.1 M PBS中的4%多聚甲醛（PFA）。
    2. 将解剖得到的脑组织、脊髓和外周淋巴结组织浸入PFA中进行固定。4 °C下固定24小时后，将组织从PFA转移至PBS中，4 °C保存备用。除商用PBS外，也可将9 g NaCl溶解于250 ml Sörensen缓冲液中，再加入750 ml去离子水（dH₂O）配制。2O)；配制 0.2 M Sörensen 缓冲液（pH 7.4），需溶解 13.8 g NaH2PO4 x 1H2O 和 71.2 g Na2HPO4 x 2H2O₂ 在 2.5 L 去离子水中2O.
  2. 脱水 & 包埋
    1. 使用剃刀将组织切成约5 mm厚的片状。
    2. 使用 Tissue-Tek 启动组织硬化过程（脱水）V.I.P 真空渗透处理仪（标准程序：依次浸入浓度递增的乙醇，随后二甲苯，最后石蜡）表1).
    3. 将组织放入模具中，并在样品周围倒入液态石蜡，以形成包埋块 "石蜡包埋块"长期储存需在室温（RT）下进行。然而，在切片前建议将包埋块冷却。 例如， 4 °C 过夜（o/n）。

2. 切片

  1. 将石蜡包埋块放入滑动式切片机的固定夹持器中，使其能够来回穿过刀片。调整包埋块与切片刀之间的最佳角度（该角度取决于刀片的几何形状，也与切割速度和技术有关）。
  2. 从石蜡包埋块上切下 3 - 5 µm 厚的横切片。
  3. 将刚切下的切片转移至水浴容器中，随后将其从水中捞起并贴附到载玻片上。
  4. 小心地将贴好的切片压在纸巾上，以去除残留水分和可能存在的气泡。建议使用 commercially pre-coated adhesive glass slides（商品化预涂黏附载玻片）。
  5. 将贴好切片的载玻片在 50 - 60 °C 的烘箱中干燥数小时。

3. 脱蜡（复水） & 阻断内源性过氧化物酶活性)

  1. 将切片浸入二甲苯（或替代品XEM-200）中2次，每次15–20分钟。
  2. 用99%乙醇冲洗。
  3. 为阻断内源性过氧化物酶活性，将切片在含有0.25%过氧化氢的甲醇溶液中孵育30分钟。
  4. 通过使用含水量逐渐增加的乙醇（99%、70%）进行再水化，最后置于蒸馏水中。
  5. 从此步骤开始直至盖玻片封片完成，切片必须始终保持湿润。

4. 抗原修复

  1. 使用食物蒸锅将载玻片在抗原修复液（此处为 pH 8.5 的 EDTA 缓冲液）中煮沸 60 分钟（EDTA 缓冲液储存液的配制：将 1.21 g Tris 和 0.37 g EDTA 溶解于 50 ml dH2O 中；工作液的配制：取 2.5 ml EDTA 储存液加入 47.5 ml dH2O 稀释）。
  2. 将载玻片在室温下冷却约 1 小时，然后用 Tris 缓冲盐水（TBS，也可使用 PBS）冲洗 3–5 次；TBS 由 0.05 M Tris 和 0.15 M NaCl 组成，用 HCl 调节 pH 至 7.5。也可使用市售的 TBS 溶液。

5. 封闭非特异性结合位点

  1. 为避免非特异性背景反应，将切片置于含有10%胎牛血清（FCS）和90% DAKO缓冲液的封闭液中，在室温下孵育30分钟。

6. 双重免疫标记：同时与一抗孵育

  1. 将所需量的一抗用封闭液稀释，于4 °C孵育过夜。进行双重免疫染色时，将α-eotaxin（Ccl11；1:300）与α-Cd68（Ed1；1:1,000）、或α-Iba1（Aif1；1:1,000）、或α-Cd8α（Ox-8；1:200）联合使用。
  2. 用TBS缓冲液冲洗切片3–5次（也可选用10倍稀释的DAKO缓冲液）。
  3. 将所需量的二抗（生物素化抗山羊抗体和碱性磷酸酶标记的抗小鼠抗体，均为1:200）用封闭液稀释，在室温下孵育1小时。
  4. 用TBS缓冲液冲洗切片3–5次（也可选用10倍稀释的DAKO缓冲液）。
  5. 将切片与辣根过氧化物酶（HRP）标记的亲和素-过氧化物酶复合物用封闭液稀释后，在室温下孵育1小时。
  6. 用TBS缓冲液冲洗切片3–5次（也可选用10倍稀释的DAKO缓冲液）。

7. 可视化

  1. 结合的碱性磷酸酶标记二抗的显色
    1. 通过将 12.1 g Tris 溶解于 1 L dH2O 中配制 0.1 M Tris-HCl 缓冲液，并用 HCl 调节 pH 值。使用相同的 Tris-HCl 缓冲液配制 1 M 左旋咪唑溶液。新鲜配制 4% NaNO2 溶液于 dH2O 中。
    2. 为获得 50 ml 快速蓝（FB）底物（一个标准玻璃比色皿所需体积），将 6.25 mg 萘酚-AS-MX-磷酸盐溶解于 312.5 µl DMF 中，加入玻璃管内，然后混入 50 ml 预热（37 °C）的 Tris-HCl 缓冲液中。将 12.5 mg FB RR 盐溶解于 312.5 µl 2 N HCl 中，加入 312.5 µl 新鲜配制的 4% NaNO2 溶液，将混合物搅拌进入同一份 50 ml 预热的 Tris-HCl 缓冲液中。轻轻振荡，直至黄色液体变澄清，最后加入 77 µl 新鲜配制的 1 M 左旋咪唑溶液。过滤所得混合液，并将其倒入放置于玻璃比色皿中的载玻片上。
    3. 在 37 °C 下开始孵育，并每隔约 15 - 30 分钟在光学显微镜下观察显色过程。若显色模糊，应更换为新鲜的 FB 溶液。
    4. 用 TBS 缓冲液冲洗载玻片 3 - 5 次，随后转移至 PBS 缓冲液中。
  2. 结合的生物素化二抗的显色
    1. 通过将 1 ml DAB 储存液（每 1 ml PBS 含 25 mg DAB）稀释于 49 ml PBS 中，配制 DAB/H2O2 显色液。加入 16.5 µl H2O2，在倾倒至切片前进行过滤。
    2. 发色剂 DAB 转化为沉淀性棕褐色色素的过程可能非常迅速。应在光学显微镜下密切监控显色过程（即使孵育时间延长数秒，也可能导致背景过高，掩盖特异性信号）。
    3. 棕褐色沉淀的强度可通过在含 2% 硫酸铜和 0.9% NaCl 的溶液中孵育 5 分钟进行增强。
    4. 用 PBS 冲洗载玻片 3 - 5 次，最后用 dH2O 冲洗，也可选择使用自来水。
    5. 直接从水中用 GelTol 水性封片介质加盖玻片封片。避免产生气泡。
    6. 让封片介质完全干燥，例如，在 4 °C 过夜。将干燥后的载玻片在室温下保存。
1.% 乙醇20'40 °C
2.% 乙醇60'40 °C
3.% 乙醇90'40 °C
4.% 乙醇60'40 °C
5.% 乙醇90'40 °C
6.% 乙醇60'40 °C
7.% 乙醇90'40 °C
8.% 乙醇120'40 °C
9.二甲苯30'40 °C
10.二甲苯60'40 °C
11.石蜡60'60 °C
12.石蜡60'60 °C
13.石蜡60'60 °C
14.石蜡120'60 °C

表1. 使用Tissue-TekV.I.P真空浸润处理仪进行组织处理。

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结果

对经甲醛固定、石蜡包埋的大鼠中枢神经系统（CNS）和淋巴结（LN）组织切片进行双重免疫染色（共染色）。使用推拉式切片机切割3-5 µm厚的组织切片，将其连续贴附于预包被的粘附性玻璃载玻片上，并按先前所述方法处理10,11,12。简言之，切片经脱蜡、组织再水化及内源性过氧化物酶灭活后，进行抗原修复，随后进行封闭以阻断非特异性结合位点。共染色实验采用以下组合：i) Ccl11/Iba-1，ii) Ccl11/Ed1，以及 iii) Ccl11/Cd8。每种共染色所用的一抗分别来自两种不同物种（山羊和小鼠），从而可实现同时孵育。Ccl11通过棕褐色的过氧化物酶反应产物显色，而Iba-1、Ed1和Cd8则通过蓝色的碱性磷酸酶（AP）信号显色。

本文所述结果已在我们近期关于趋化因子Ccl11在多发性硬化症（MS）样神经炎症中作用的研究中进行了更为详尽和广泛背景下的阐述10根据在大鼠中枢神经系统中进行的免疫组化分析，Cc...

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讨论

标准的免疫组化（IHC）操作流程通常需要进行特定调整才能获得最佳结果，这往往依赖于丰富的经验，同时也需要采用"试错"的方法。从组织制备到靶标显色，几乎每一步都可能需要进行个性化优化，以提升最终的实验效果。本文所展示的双重染色方案，是一种基于免疫组化的蛋白质检测方法，特别适用于分析神经炎症影响下的甲醛固定、石蜡包埋的大鼠中枢神经系统（CNS）和淋巴结（LN）组织切片中目标蛋白之间的相互关系。因此，该方案既可作为学习免疫组化技术的教程，也可为更深入的实验提供参考。但需注意的是，若将本方案直接套用于其他蛋白质检测或不同类型的组织，可能无法获得理想结果。

原位 使用锁核酸（LNA）核糖探针进行杂交 Ccl11 在同源近交系大鼠的中枢神经系统中表现出相应mRNA水平的上调10该结果通过qPCR分析得以证实。此外，qPCR还揭示 Ccl11 在疾病保护性同类系大鼠品系中，与野生型（wt）品系相比，同类系外周淋巴结也出现上调现象。最后，蛋白质印迹（WB）显示，该品系两种靶组织中Ccl11蛋白均显著上调

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

我们感谢Hans Lassmann和Jan Bauer提供的指导与支持。同时感谢Katalin Benedek提供的出色技术协助，以及Caroline Westerlund在语言和内容方面的审阅与评价。

本研究由Biogen Idec、Wenner-Gren基金会、瑞典研究理事会、瑞典神经功能障碍患者协会、瑞典脑基金会、欧盟第六框架计划EURATools（LSHG-CT-2005-019015）和Neuropromise（LSHM-CT-2005-018637）提供的资助支持。资助方在研究设计、数据收集与分析、发表决定或稿件撰写过程中均未发挥任何作用。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
试剂
异氟烷（Isoflurane）：1-氯-2,2,2-三氟乙基（二氟甲基醚），2-氯-2-(二氟甲氧基)-1,1,1-三氟乙烷（C3H2ClF5O）Baxter1001936060眼部照射。可能影响生育能力并对子宫内胎儿造成损害。仅可在配备完善的麻醉环境中使用。
氯化钠（NaCl）Merck1.0604
磷酸盐缓冲液（PBS），片剂Sigma-AldrichP4417
多聚甲醛（OH(CH2O)nH（n = 8 - 100）），1×PBS 中含 4%Apl pharma34 24 28健康危害。腐蚀性。易燃。急性毒性。
乙醇 ≥99.5%，无水（CH3CH2OH）Sigma-Aldrich459844-1L易燃。
二甲苯（Xylenes，组织学级；C6H4(CH3)2 Sigma-Aldrich534056易燃。急性毒性。
Histo-Comp 石蜡Tissue-TekV0-5-1001
粘附性显微镜载玻片StarfrostMIC-1040-W
二甲苯替代物 XEM-200Vogel GmbHND-HS-200呼吸道致敏。致癌性。
α-CD8（Ox-8）小鼠抗大鼠一抗AbD SerotecMCA48G
α-Iba1（AIF1）小鼠抗大鼠一抗MilliporeMABN92
α-CD68（ED1）小鼠抗大鼠一抗AbD SerotecMCA341R
α-嗜酸性粒细胞趋化因子 C-19（CCL11）山羊抗大鼠一抗Santa Cruz BTSC-6181
碱性磷酸酶（AP）标记二抗Dakopatts, DenmarkD0314
生物素化二抗Amersham BiotechRPN1025
亲和素-辣根过氧化物酶复合物（HRP）Sigma-AldrichA3151
萘酚AS-MX磷酸盐（C19H18NO5P）Sigma-AldrichN4875-1G急性毒性。
快蓝RR盐，偶氮重氮24号（C15H14ClN3O3 x 1/2 ZnCl2）Sigma-AldrichFBS25
左旋咪唑盐酸盐（C11H13ClN2S）Sigma-Aldrich31742急性毒性。
3,3'-二氨基联苯胺四盐酸盐（DAB显色剂）DAKOS3000高度易燃。有毒。
硫酸铜（CuSO4）Merck1.02791急性毒性。环境危害。
水溶性封片剂 GelTolThermo Electron Corporation230100
过氧化氢，30%（H2O2）Merck107210急性毒性。
甲醇（CH3OH）Fluka65543急性毒性。呼吸道致敏。致癌性。易燃。
三羟甲基氨基甲烷，TRIS碱（C4H11NO3）AppliChemA1379皮肤和眼睛刺激。
Tris缓冲盐水（TBS），片剂Sigma-AldrichT5030
二水合磷酸氢二钠（Na2HPO4 × 2H2O）Merck1.0658
一水合磷酸二氢钠（NaH2PO4 × 1H2O）Merck1.06346
胎牛血清（FCS）Cambrex BioScienceDE-14-802F
DAKO细胞染色洗涤缓冲液10×DAKOS3006应储存于2-8 °C以抑制细菌生长。避免起泡。
N,N-二甲基甲酰胺；DMF（C3H7NO）Fluka40250易燃。急性毒性。
玻璃盖玻片 24 × 36 mmMenzel-GläserBB024036A1
盐酸，浓（HCl）Sigma-Aldrich30721腐蚀性，刺激性，渗透性。肺部致敏（以酸雾形式）。有毒。
盐酸溶液，容量法，2 M HCl（2 N）Fluka71826腐蚀性，刺激性，渗透性。肺部致敏（以酸雾形式）。有毒。
亚硝酸钠，试剂级，≥99.0%（NaNO2）Sigma-AldrichS2252氧化剂。有毒。对环境有害。
乙二胺四乙酸二钠盐二水合物（EDTA；C10H14N2Na2O8 × 2H2O）Merck1.08454口服暴露可能引起生殖和发育毒性。
仪器设备
Tissue-TekV.I.P 真空渗透处理仪Sakura5902 VIP Jr. 115 V, 60 Hz
Hacker-Bright 8000 系列底座滑动式切片机Hacker instruments
家用食品蒸锅BraunMultiGourmet FS 20
光学显微镜Leica Polyvar 2

参考文献

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