方法文章

大鼠中枢神经系统及外周淋巴结组织切片的免疫组织化学分析

DOI：

10.3791/50425

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2016年11月14日

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1Department of Clinical Neuroscience, Neuroimmunology Unit, Center for Molecular Medicine, Karolinska Institutet, 2Department of Neuroimmunology, Center for Brain Research, Medical University of Vienna, 3Department of Medical Biochemistry and Biophysics, Vascular Biology Unit, Karolinska Institutet

本文内容

摘要

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本文介绍了一种优化的详细方案，用于对甲醛固定、石蜡包埋的大鼠中枢神经系统（CNS）和外周淋巴结（LN）组织切片进行双重免疫染色。

摘要

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免疫组织化学（IHC）可实现高度特异、可靠且直观的蛋白质可视化。基于IHC的多色标记实验的正确操作与结果解读具有挑战性，尤其是在评估富含脂肪组织（如中枢神经系统，CNS）中靶蛋白之间相互关系时更为复杂。

本方案是对标准免疫标记技术的优化，特别适用于检测受神经炎症影响的大鼠中枢神经系统及外周淋巴结（LN）中的结构蛋白和可溶性蛋白。然而，无论是否进行进一步修改，本方案也可能用于检测其他相关蛋白靶点，甚至适用于本文所述以外的其他器官和物种。

引言

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尽管已采用针对甲基化组、转录组甚至蛋白质组水平的先进高通量分析技术，免疫染色仍然是在组织样本、细胞培养物或细胞涂片中直接检测蛋白质的金标准。通过揭示目标蛋白的定位/分布模式，免疫组织化学（IHC）可评估其相对比例和空间拓扑关系，甚至提示其生物学活性。因此，IHC 被广泛应用于临床诊断和科学研究。 例如用于疾病诊断、治疗评估、疾病机制研究以及动物模型中的功能与表型改变分析， 等等。

免疫组织化学（IHC）本质上涵盖了组织学、病理学、生物化学和免疫学，自1941年首次使用荧光标记的抗体鉴定感染组织中的Pneumococcal抗原以来，已取得显著进展1。IHC通过抗体（Abs）与其特异性抗原（Ag）的结合来实现对细胞产物和组分的可视化。除了使用荧光素标记的抗体外，还可利用过氧化物酶2,3或碱性磷酸酶4等酶来显示免疫反应。此外，胶体金标记的抗体5可用于光学显微镜和电子显微镜下检测特异性的抗原-抗体相互作用，而放射性标记则通过自显影技术进行可视化。

抗原-抗体免疫反应可通过直接法和间接法进行检测。直接法本质上更快、更简单，因其使用直接标记的一抗6。然而，由于其灵敏度显著较低，通常更倾向于采用间接法。两步间接检测法首先使用未标记的一抗，然后使用针对一抗的标记二抗作为第二层....

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方案

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伦理声明
本研究严格遵循瑞典实验动物管理局指南和欧洲共同体理事会指令（86/609/EEC），并在经北斯德哥尔摩动物伦理委员会批准的伦理许可 N338/09、N15/10 和 N65/10 下进行。

1. 组织制备

  1. 灌注 & 固定
    1. 使用异氟烷麻醉动物，经左心室进行心脏灌流。先用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗血管系统以去除血液成分，随后灌注0.1 M PBS中的4%多聚甲醛（PFA）。
    2. 将解剖得到的脑组织、脊髓和外周淋巴结组织浸入PFA中进行固定。4 °C下固定24小时后，将组织从PFA转移至PBS中，4 °C保存备用。除商用PBS外，也可将9 g NaCl溶解于250 ml Sörensen缓冲液中，再加入750 ml去离子水（dH₂O）配制。2O)；配制 0.2 M Sörensen 缓冲液（pH 7.4），需溶解 13.8 g NaH2PO4 x 1H2O 和 71.2 g Na2HPO4 x 2H2O₂ 在 2.5 L 去离子水中2O.
  2. 脱水 & 包埋 <....

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结果

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对经甲醛固定、石蜡包埋的大鼠中枢神经系统（CNS）和淋巴结（LN）组织切片进行双重免疫染色（共染色）。使用推拉式切片机切割3-5 µm厚的组织切片，将其连续贴附于预涂有黏附剂的玻璃载片上，并按先前所述方法处理10,11,12。简言之，切片经脱蜡、再水化及内源性过氧化物酶灭活后，进行抗原修复，随后进行封闭以阻断非特异性结合位点。共染色实验采用以下组合：i) Ccl11/Iba-1，ii) Ccl11/Ed1 和 iii) Ccl11/Cd8。每种共染色所用的一抗分别来自两种不同物种（山羊和小鼠），从而可实现同时孵育。Ccl11通过棕褐色的过氧化物酶反应产物显色，而Iba-1、Ed1和Cd8则通过蓝色的碱性磷酸酶（AP）信号显色。

本文所展示的结果已在我们近期关于趋化因子 Ccl11 在多发性硬化症（MS）样神经炎症中作用的研究中进行了更详细和更广泛的描述10。根据在大鼠中枢神经系统（CNS）中进行的免疫组化分析.......

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讨论

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标准的免疫组化（IHC）操作流程通常需要进行特定调整才能获得最佳结果，这往往依赖于丰富的经验，同时也需要采用"试错"的方法。从组织制备到靶标显色，几乎每一步都可能需要进行个性化优化，以提升最终的实验效果。本文所展示的双重染色方案，是一种基于免疫组化的蛋白质检测方法，特别适用于分析神经炎症影响下的甲醛固定、石蜡包埋的大鼠中枢神经系统（CNS）和淋巴结（LN）组织切片中目标蛋白之间的相互关系。因此，该方案既可作为学习免疫组化技术的教程，也可为更深入的实验提供参考。但需注意的是，若将本方案直接套用于其他蛋白质检测或不同类型的组织，可能无法获得理想结果。

原位 使用锁核酸（LNA）核糖探针进行杂交 Ccl11 在同源近交系大鼠的中枢神经系统中表现出相应mRNA水平的上调10该结果通过qPCR分析得以证实。此外，qPCR还揭示 Ccl11 在疾病保护性同类系大鼠品系中，与野生型（wt）品系相比，同类系外周淋巴结也出现上调现象。最后，蛋白质印迹（WB）显示，该品系两种靶组织中Ccl11蛋白均显著上调

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披露

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作者声明无利益冲突。

致谢

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我们感谢Hans Lassmann和Jan Bauer提供的指导与支持。同时感谢Katalin Benedek提供的出色技术协助，以及Caroline Westerlund在语言和内容方面的审阅与评价。

本研究由Biogen Idec、Wenner-Gren基金会、瑞典研究理事会、瑞典神经功能障碍患者协会、瑞典脑基金会、欧盟第六框架计划EURATools（LSHG-CT-2005-019015）和Neuropromise（LSHM-CT-2005-018637）提供的资助支持。资助方在研究设计、数据收集与分析、发表决定或稿件撰写过程中均未发挥任何作用。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
试剂
异氟烷（Isoflurane）：1-氯-2,2,2-三氟乙基（二氟甲基醚），2-氯-2-(二氟甲氧基)-1,1,1-三氟乙烷（C3H2ClF5O）Baxter1001936060眼部照射。可能影响生育能力并对子宫内胎儿造成损害。仅可在配备完善的麻醉环境中使用。
氯化钠（NaCl）Merck1.0604
磷酸盐缓冲液（PBS），片剂Sigma-AldrichP4417
多聚甲醛（OH(CH2O)nH（n = 8 - 100）），1×PBS 中含 4%Apl pharma34 24 28健康危害。腐蚀性。易燃。急性毒性。
乙醇 ≥99.5%，无水（CH3CH2OH）Sigma-Aldrich459844-1L易燃。
二甲苯（Xylenes，组织学级；C6H4(CH3)2 Sigma-Aldrich534056易燃。急性毒性。
Histo-Comp 石蜡Tissue-TekV0-5-1001
粘附性显微镜载玻片StarfrostMIC-1040-W
二甲苯替代物 XEM-200Vogel GmbHND-HS-200呼吸道致敏。致癌性。
α-CD8（Ox-8）小鼠抗大鼠一抗AbD SerotecMCA48G
α-Iba1（AIF1）小鼠抗大鼠一抗MilliporeMABN92
α-CD68（ED1）小鼠抗大鼠一抗AbD SerotecMCA341R
α-嗜酸性粒细胞趋化因子 C-19（CCL11）山羊抗大鼠一抗Santa Cruz BTSC-6181
碱性磷酸酶（AP）标记二抗Dakopatts, DenmarkD0314
生物素化二抗Amersham BiotechRPN1025
亲和素-辣根过氧化物酶复合物（HRP）Sigma-AldrichA3151
萘酚AS-MX磷酸盐（C19H18NO5P）Sigma-AldrichN4875-1G急性毒性。
快蓝RR盐，偶氮重氮24号（C15H14ClN3O3 x 1/2 ZnCl2）Sigma-AldrichFBS25
左旋咪唑盐酸盐（C11H13ClN2S）Sigma-Aldrich31742急性毒性。
3,3'-二氨基联苯胺四盐酸盐（DAB显色剂）DAKOS3000高度易燃。有毒。
硫酸铜（CuSO4）Merck1.02791急性毒性。环境危害。
水溶性封片剂 GelTolThermo Electron Corporation230100
过氧化氢，30%（H2O2）Merck107210急性毒性。
甲醇（CH3OH）Fluka65543急性毒性。呼吸道致敏。致癌性。易燃。
三羟甲基氨基甲烷，TRIS碱（C4H11NO3）AppliChemA1379皮肤和眼睛刺激。
Tris缓冲盐水（TBS），片剂Sigma-AldrichT5030
二水合磷酸氢二钠（Na2HPO4 × 2H2O）Merck1.0658
一水合磷酸二氢钠（NaH2PO4 × 1H2O）Merck1.06346
胎牛血清（FCS）Cambrex BioScienceDE-14-802F
DAKO细胞染色洗涤缓冲液10×DAKOS3006应储存于2-8 °C以抑制细菌生长。避免起泡。
N,N-二甲基甲酰胺；DMF（C3H7NO）Fluka40250易燃。急性毒性。
玻璃盖玻片 24 × 36 mmMenzel-GläserBB024036A1
盐酸，浓（HCl）Sigma-Aldrich30721腐蚀性，刺激性，渗透性。肺部致敏（以酸雾形式）。有毒。
盐酸溶液，容量法，2 M HCl（2 N）Fluka71826腐蚀性，刺激性，渗透性。肺部致敏（以酸雾形式）。有毒。
亚硝酸钠，试剂级，≥99.0%（NaNO2）Sigma-AldrichS2252氧化剂。有毒。对环境有害。
乙二胺四乙酸二钠盐二水合物（EDTA；C10H14N2Na2O8 × 2H2O）Merck1.08454口服暴露可能引起生殖和发育毒性。
仪器设备
Tissue-TekV.I.P 真空渗透处理仪Sakura5902 VIP Jr. 115 V, 60 Hz
Hacker-Bright 8000 系列底座滑动式切片机Hacker instruments
家用食品蒸锅BraunMultiGourmet FS 20
光学显微镜Leica Polyvar 2

参考文献

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  1. Coons, A., Creech, H. J., Jones, R. N. Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group. Proc Soc Exp Biol Med. 47, 200-202 (1941).
  2. Nakane, P. K., Pierce, G. B.

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