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方法文章

人类心肌细胞的生成：从无饲养层人诱导性多能干细胞分化的心肌细胞制备方案

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DOI：

10.3791/50429

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2013年6月28日

 ,  , 
1Humanitas Clinical and Research Center, Italy, 2Institute of Genetic and Biomedical Research (IRGB), National Research Council (CNR)

本文内容

摘要

多能干细胞，包括胚胎干细胞或诱导性多能干细胞（iPS细胞），是获取人类分化细胞（包括心肌细胞）的重要来源。本文将重点介绍iPS细胞向心脏细胞的诱导分化，展示如何通过基于拟胚体的方案获得功能性人类心肌细胞。

摘要

为了研究驱动心脏发育的过程并确定导致人类心肌疾病的分子机制，首先必须获得功能性人类心肌细胞（CMs）。在药物发现和毒理学研究中使用这些细胞也将带来显著益处，可使针对心脏疾病的新型药理学分子在临床前阶段即可在人类来源的细胞上进行验证。在所有可能的心肌细胞来源中，诱导性多能干细胞（iPS细胞）是最具前景的来源之一，因为这些细胞可直接从易于获取的患者组织中获得，并具有分化为体内所有细胞类型的内在潜能1。目前已有多种方法被提出用于将iPS细胞分化为心肌细胞，其范围从经典的拟胚体（EBs）聚集法到化学成分明确的分化方案不等2,3。本文中，我们提出一种基于拟胚体的分化方案，并展示该方法如何有效地从无饲养层培养的iPS细胞中高效生成具有功能的心肌样细胞。

引言

从历史上看，对驱动人类发育和疾病的遗传与分子机制的研究主要依赖于构建基因修饰的动物模型。然而，许多人类表型无法在小鼠中成功复制，主要原因在于这两个物种之间存在的生物学差异。另一方面，获取人类组织可能受到限制，且通常难以获得足够的材料用于深入的实验研究。心血管生物学领域正面临上述双重局限：人类心脏的生理特性与小鼠存在显著差异，而大量心脏组织仅能在死亡后或心脏手术期间获得。因此，寻找一种理想的可分化为功能性人类心肌细胞（CMs）的细胞来源已成为心血管生物学的核心课题，科研人员已为此付出大量努力。已有多种细胞类型被提出作为候选，包括骨骼肌成肌细胞、局部心脏干细胞、骨髓单个核细胞、内皮祖细胞以及间充质干细胞。然而，利用这些细胞所获得的研究数据并不一致4。

人类胚胎干细胞（ESC）的分离最初 5 山中伸弥（Yamanaka）和汤姆森（Thomson）在诱导性多能干细胞（iPS细胞）领域的开创性发现 6,7 随后似乎提供了解决方案：这些细胞具有无限增殖的能力，并具备分化为三个胚层所有细胞衍生物的潜能，包括心肌细胞（CMs）。诱导多能干细胞（iPS细胞）的使用具有进一步优势：由于其来源于自体成体细胞，因此携带与供体个体或患者相同的基因组。这使得iPS细胞能够用于开发 体外 有助于研究人类遗传性疾病和发育机制的模型。由于这一特性，iPS细胞还能克服与免疫排斥和伦理问题相关的难题 8因此，尽管胚胎干细胞（ESCs）仍是干细胞生物学领域的金标准，但全球研究人员正越来越多地转向诱导多能干细胞（iPS细胞）技术。

诱导多能干细胞现正被用于建立人类疾病模型 体外 包括先天性心血管疾病在内的多种病症 9,10近年来，iPS细胞疾病模型已应用于单基因遗传性心脏疾病的研究（即 长QT综合征、儿茶酚胺能多态性室性心动过速）以及心脏缺陷为复杂表型一部分的病理状态（即 豹综合征和蒂莫西综合征、扩张型心肌病）。这些研究报告证实，源自患者的特异性诱导多能干细胞分化为心肌细胞后，表现出与疾病相似的表型和功能特征 体内.

然而，提高诱导iPS细胞向心肌细胞系分化的效率仍面临诸多挑战。通过形成称为拟胚体（embryoid bodies, EBs）的聚集体，已成功实现人胚胎干细胞（ESC）自发生成心肌细胞（CMs）17。自该发现以来，许多其他方法相继被提出。多个研究团队已显著提高了分化方案的效率，并逐步采用化学成分明确且不含动物源性成分的培养试剂（有关现有所有方法的全面综述，参见 Mummery, C., et al., Circulation Research (2012) 3）。

然而，基于拟胚体（EB）聚集的经典方法仍然是进行功能研究和疾病机制探索最常用的方法。我们提出的方案基于将诱导性多能干细胞（iPS细胞）聚集形成拟胚体，并在含血清和抗坏血酸的条件下进行培养，该方法已被证明可促进心肌细胞分化过程，并对这些细胞的成熟产生积极影响18,19。本文将详细阐述这一方法，并展示如何利用无饲养层的iPS细胞系生成患者特异性的iPS来源心肌细胞（CMs）。

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方案

1. 人类iPS细胞系的无饲养层维持与传代

  1. 准备Matrigel包被的培养皿。将一管适用于人胚胎干细胞的基质胶置于冰上解冻一小时，然后用25 ml DMEM-F12培养基稀释。每35 mm培养皿中加入1 ml（若使用其他规格培养皿，则按表面积等比例添加），操作过程中保持所有试剂和器皿处于冰上预冷状态。用铝箔纸包裹培养皿避光。

注意：Matrigel 的储存浓度因批次而异。稀释说明见产品数据表。

  1. 将培养板置于冰上过夜，次日从冰上取出。培养板可在冰箱中保存最多一周后再使用。
  2. 根据下表配制 mTESR1 完全培养基（或解冻一管 Nutristem 培养基）和 H-ESM（人胚胎干细胞培养基）。
    H-ESM终浓度配制 500 ml 所需量
    Knockout 血清替代物（KSR）20%100 ml
    GlutaMAX 100X2 mM5 ml
    MEM 非必需氨基酸0.1 mM5 ml
    青霉素-链霉素100 U/ml - 0.1 mg/ml5 ml
    2-巯基乙醇0.1 mM900 μl
    B27 补充剂 - 不含维生素A1%10 ml
    N2 补充剂1%5 ml
    Knockout DMEM-370 ml

    配制好的储存培养基可在 4 °C 保存不超过 2 周。配制完全生长培养基时，需在换液前加入基础成纤维细胞生长因子（bFGF），使其终浓度为 20 ng/ml。

注意：可使用经小鼠胚胎成纤维细胞条件处理的完全 H-ESM 培养基替代 mTESR1 或 Nutristem 用于诱导多能干细胞培养。

  1. 将包被的培养板置于37 °C培养箱中孵育30分钟至2小时，然后再进行传代。
  2. 细胞应大约每5天传代一次，即使尚未达到汇合状态；克隆之间不应相互接触。
  3. 用1 ml分散酶（1 mg/ml，用PBS将10 mg/ml储存液稀释而成）替换生长培养基。
  4. 使用拉制的玻璃巴斯德移液管去除正在分化的区域。需去除的区域包括克隆中心的火山口样或囊状结构，以及细胞已从克隆脱离、变扁平并呈现向外迁移趋势的区域。
  5. 在37 °C培养罩内孵育，直至克隆边缘变亮并开始脱落（通常约5–7分钟）。弃去分散酶溶液，用1 ml H-ESM洗涤后弃去。
  6. 在1 ml H-ESM中，使用细胞刮刀（类似刮铲）收集克隆，并转移至15 ml离心管中。用额外1 ml H-ESM冲洗后并入同一离心管。以1,000 rcf离心4分钟，弃去上清液。
  7. 将沉淀重悬于1 ml预热的生长培养基（mTESR1或Nutristem）中。避免过度吹打导致细胞团块破碎——吹打次数应少于6–8次。根据所需接种的细胞数量决定保留量，并去除多余细胞（通常按1:4或1:5稀释），例如，若按1:5比例接种2个培养板，则去除600 μl，再加入1.6 ml新鲜培养基。
  8. 去除培养板中的Matrigel。将细胞逐滴加入培养板，均匀分布。避免剧烈振荡离心管，以免细胞聚集至中央。
  9. 用1 ml培养基冲洗离心管，并将液体均分至各培养板。每孔最终体积应为1.5–2 ml。
  10. 每天更换培养基，但传代后的当天除外。尽管理想情况下应每天换液，若自上次传代起未超过2–3天，也可偶尔每两天更换一次，且不会影响细胞的多能性或分化潜能。
  11. 若需冻存细胞系，则改用1–2 ml mFreSR冻存液重悬细胞，用2 ml移液器将1 ml分装至冻存管中。将冻存管放入-80 °C冰箱内的冻存盒中，并在3–4天内转移至液氮中保存。

注意： iPS细胞的手动显微解剖必须在体视显微镜下进行。 体外 体外受精（IVF）工作站（例如 配备体视显微镜的KSystem体外受精工作站可在加热平台上保持无菌条件以进行细胞操作。若无此设备，可将体视显微镜置于常规层流罩内使用。

2. 胚状体聚集与心脏诱导

  1. 根据下表配制EBM-20培养基。
    EBM-20终浓度500 ml 配方
    南美洲来源胎牛血清20%100 ml
    MEM非必需氨基酸0.1 mM5 ml
    青霉素-链霉素100U/ml - 0.1 mg/ml5 ml
    GlutaMAX 100X0.1 mM5 ml
    2-巯基乙醇50 μM450 μl
    DMEM/F12-385 ml

    使用南美来源的胎牛血清（FBS）对于确定分化效率至关重要：使用其他类型的血清可能影响分化过程。配制完全EBM-20培养基时，加入抗坏血酸（AA）至终浓度为50 μg/ml。完全生长培养基在4 °C保存不得超过一周。
  2. 按照上述方法（步骤1.6至1.9）收获iPS克隆。
  3. 用2 ml移液器在1 ml EBM-20培养基中轻柔重悬。避免过度打散细胞团块——上下吹打不超过2–3次，并在体视显微镜下观察细胞集落的大小。按1:1比例接种至超低吸附培养板中例如 对于35 mm培养皿，使用6孔板中的1个孔。用1 ml EBM-20冲洗离心管，然后加入培养板中。

注意： 类胚体（EB）的大小会影响分化过程，控制心脏诱导的效率和时间。研究表明，大小均一的类胚体聚集可降低分化过程中观察到的变异性。

  1. 第3天，在显微镜下更换一次EBM-20培养基，以避免移除类胚体（EBs）。移液时将移液器靠近培养板边缘，小心吸出培养基。
  2. 第7天，将类胚体转移至预先用0.1%明胶包被并已在37 °C孵育30分钟的培养板中。如有需要，可去除明胶，并将培养板置于细胞培养超净台中过夜。每35 mm培养皿中加入35–40个类胚体。
  3. 观察类胚体中是否出现搏动区域，并每周更换两次EBM-20培养基。在培养皿盖顶部标记出搏动区域的位置，以便在体视显微镜下快速定位。搏动区域通常在约10–20天后出现。
  4. 当出现自发性收缩区域时，将培养基更换为EBM-2（配制方法同EBM-20，但使用2% FBS），并按照下文第3节所述方法进行分离。
  5. 继续观察其他区域是否出现搏动现象，并每周更换两次培养基，直至搏动区域可用于后续实验。

注意：分化过程的效率在很大程度上取决于多个因素，其中最关键的是特定的细胞系以及用于诱导心肌分化的血清批次。为获得最高效率，应检测细胞系的心肌生成潜能及不同批次的血清。

3. 搏动区域的分离与培养

  1. 用 PBS 稀释纤连蛋白至 5 μg/cm2，加入足够体积使其完全覆盖 12 孔板（每孔表面积为 4 cm2）或其他所需培养板的整个表面（12 孔板每孔共 300 μl）。将培养板置于细胞培养超净台中，不加盖，使其自然干燥。培养板可用封口膜包裹后于 4 °C 过夜保存。
  2. 根据需要，使用拉制的玻璃巴氏吸管和手术刀去除跳动区域，并用 1 ml 移液器将其转移至包被有纤连蛋白的培养板中。
  3. 加入 1 ml EBM-2 培养基。
  4. 在培养板上标记已去除细胞的区域，并更换培养基。培养板可保存长达 1 个月，因为其他区域可能在后期开始出现跳动。

注意：如果需要更小的搏动细胞团，可在体视显微镜下将移植区域反复吹打数次，直至其分裂成更小的碎片。这样将得到由少量搏动细胞组成的细胞簇（见视频3）。

  1. 每两周更换一次培养基，直至准备进行分析。

注意：本方案获得的心肌细胞具有类似胎儿的形态和功能特征；通过延长培养时间以进一步分化这些细胞，可使其成熟为类似成人的表型。

4. 单个搏动细胞的分离与分析

  1. 用 PBS 将纤连蛋白稀释至 5 μg/cm2，并充分覆盖 2 孔玻片（4 cm2 面积）或其他合适载体的表面进行包被。若使用玻璃载体，则用层粘连蛋白和纤连蛋白（每种各 5 μg/cm2）进行包被。
  2. 使用巴斯德吸管或解剖刀从第 3 节的培养板中取出跳动区域。
  3. 使用 1 ml 移液器将细胞转移至含有 500 μl 胶原酶 II（在含 Mg 和 Ca 的 PBS 中浓度为 480 U/ml）的 15 ml 离心管中，于 37 °C 孵育 15 分钟，孵育期间轻摇一次试管。
  4. 用 200 μl 移液器反复吹打。如有团块残留，将细胞转移至新鲜胶原酶 II 溶液中，并重复步骤 4.3。
  5. 重复步骤 4.4，直至无大块细胞团残留。
  6. 加入 3 ml EBM-2（不含氨基酸）以终止胶原酶反应。随后可将试管置于加热金属架中，在生物安全柜内静置，直至其他样品处理完毕。以 1,000 rcf 离心 4 分钟。
  7. 将细胞沉淀重悬于每管 1 ml 0.25% 胰蛋白酶/EDTA 溶液中（由 0.5% 储存液用 1×PBS 稀释而成），于 37 °C 孵育 5 分钟。合并来自同一初始样品的消化产物。
  8. 加入 4 ml EBM-2（不含氨基酸）以终止胰蛋白酶反应。使用 2.5 ml 注射器连接 18G 针头，将细胞悬液通过针头吹打不超过 7 次。以 1,000 rcf 离心 4 分钟。
  9. 每孔用 1 ml EBM-2 重悬细胞沉淀后接种。接种后 2–3 天可进行功能学和形态学分析。

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结果

在我们的研究中，我们利用多个人诱导多能干细胞（iPS）系生成了心肌细胞（CMs）。这些细胞系最初是在小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）饲养层上建立的，但随后立即转移至Matrigel基质上，并使用定义明确的培养基（mTESR1或Nutristem）进行培养。通过多种检测方法验证了这些细胞形态学特征的维持情况、多能性细胞标志物（OCT-4、SSEA4和TRA1-60）的表达以及基因组稳定性（图1）。

通过将iPS细胞聚集形成拟胚体（EBs），并在特定类型的血清和AA存在下进行培养，诱导其向心肌谱系分化（图2A和图2B）。根据所使用的细胞系不同，出现收缩区域的比例占总体的20-35%（图2C和视频1）。通过酶消化法从这些区域分离出的收缩性心肌细胞（CMs）（视频2）表达典型的心肌细胞结构蛋白（心肌肌钙蛋白、α-肌节肌动蛋白、肌球蛋白重链α和β）、缝隙连接蛋白（连接蛋白-43）以及主要的离子通...

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讨论

多能干细胞具有自发分化为心肌细胞（CMs）的潜力，但效率较低，且不同细胞系之间的变异性较大。因此，新型诱导方法的开发主要集中在提高分化效率，并朝着更明确的方案发展。然而，大多数这些新分化方法较为复杂，需要精细的培养条件、对试剂添加时间和浓度的精确控制，以及使用昂贵的细胞因子和生长因子进行处理。此外，不同iPS细胞系内源性细胞因子信号水平的差异使得细胞因子浓度的标准化变得困难，通常需要针对每个细胞系将其调整至适当水平。

获得的iPS来源心肌细胞的成熟度在利用iPS细胞进行心脏分化以应用于疾病建模和药物发现时，是一个需要重点考虑的关键因素。人类ESC和iPS细胞的分化通常产生具有胎儿表型的心肌细胞 即 结构尚未完全成熟。当采用单层培养方法时，这一特点尤为明显，因此这类方法更适用于特定心脏前体细胞群体的生成、扩增与分离 2,3.

在此情况下，用于疾病建模的“经典”拟胚体（EBs）聚集方法似乎更符合实验需求。该方法操作简便、经济、易于实施，且适用于所有细胞系。该方法无需额外添加生长因子或细胞因子...

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致谢

BS 得到了米兰比可卡大学暑期学生科研培训项目的支持；本研究得到了意大利卫生部、意大利教育大学与研究部以及人类健康基金会向 GC 提供的资金支持；我们感谢 Michael V.G. Latronico 对稿件的审阅。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
<强>培养基与试剂
人ESC专用基质BD 生物科学354277将5 ml瓶在4℃解冻 °在冰上孵育过夜，按照说明书的稀释说明，在冰上分装至预冷的冻存管中，并于 -20 ℃ 保存 °C .
人血浆纤维连接蛋白，0.1% 溶液SigmaF0896-2MG工作浓度：5 μg/cm2
层粘连蛋白SigmaL2020-1MG工作浓度：5 μg/cm2
PBS（不含 Mg 和 Ca），10×LonzaBE17-515F
PBS（含 Mg 和 Ca），10×生物血清XC-S2067/500
Dispase II，中性蛋白酶，II型罗氏4942078001储备液：10 mg/ml，溶于DMEM-F12，-20℃保存 °C，工作液：1 mg/ml，溶于不含镁/钙的 PBS 中
0.5% 胰蛋白酶/EDTASigmaT3924
II型胶原酶沃辛顿4176稀释至 480 U/ml（例如 1.6 mg/ml，在含 Mg 和 Ca 的 PBS 中
DMEM-F12Life Technologies21331-020
敲除DMEMLife Technologies10829-018
无血清替代物（KSR）Life Technologies10828-0284℃解冻 °C，分装后于 -20 保存 °C
F–南美洲来源胎牛血清Invitrogen10270-106应检测各批次的心源性分化潜能。在4℃下解冻 °C，在56℃下热失活 °C 反应 30 分钟，分装后于 -20 保存 °C
青霉素-链霉素溶液（PenStrep），100倍浓缩液Life Technologies15140-122
GlutaMAX，100倍浓缩液Life Technologies35050-038
MEM 非必需氨基酸，100XInvitrogen11140-135
N2 补充剂，100 倍浓缩液Life Technologies17502-048
B27添加剂，50倍浓缩液Life Technologies12587-010
2-巯基–乙醇Invitrogen31350-010
猪皮明胶SigmaG1890-100G在水中配制1%的储备液，-20℃保存 °C. 用 PBS 稀释至 0.1%，并于 4℃ 保存 °C
mTeSR1干细胞技术5850将5倍浓缩补充剂与基础培养基混合，分装后于-20℃保存 °C. 不要将完全培养基置于4℃保存 °C 超过 1 周
Nutristem hESC XFStemgent，来自 Biological Industries05-100-1A4℃解冻 °C O/N，分装后于 -20 保存 °C，直至使用。分装样品可保存于 4 °C，不超过一周。
mFreSR干细胞技术5853
抗坏血酸SigmaA4544-25G以水配制 10 mg/ml 的储存液。分装后于 -20 ℃ 保存。 °避光，加入 EBM 至终浓度（500X）
<强>塑料器皿
35 mm 培养皿Becton Dickinson353001
细胞刮刀康宁公司3008
12孔板Becton Dickinson353043
Permanox 2孔腔室载玻片赛默飞世尔科技177437
玻璃双孔板载玻片赛默飞世尔科技177380
6孔板，超低吸附表面康宁公司3471
18G 针头Becton Dickinson304622
玻璃巴斯德吸管，230 mmVWR International612-1702
2.5 ml 注射器Becton Dickinson300188
<强>仪器设备
IVF 工作站尼康 KSystem
尼康 SMZ1500 体视显微镜尼康

参考文献

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