人类心肌细胞的生成：从无饲养层人诱导性多能干细胞分化的心肌细胞制备方案

摘要

多能干细胞，包括胚胎干细胞或诱导性多能干细胞（iPS细胞），是获取人类分化细胞（包括心肌细胞）的重要来源。本文将重点介绍iPS细胞向心脏细胞的诱导分化，展示如何通过基于拟胚体的方案获得功能性人类心肌细胞。

摘要

为了研究驱动心脏发育的过程并确定导致人类心肌疾病的分子机制，首先必须获得功能性人类心肌细胞（CMs）。在药物发现和毒理学研究中使用这些细胞也将带来显著益处，可使针对心脏疾病的新型药理学分子在临床前阶段即可在人类来源的细胞上进行验证。在所有可能的心肌细胞来源中，诱导性多能干细胞（iPS细胞）是最具前景的来源之一，因为这些细胞可直接从易于获取的患者组织中获得，并具有分化为体内所有细胞类型的内在潜能¹。目前已有多种方法被提出用于将iPS细胞分化为心肌细胞，其范围从经典的拟胚体（EBs）聚集法到化学成分明确的分化方案不等^2,3。本文中，我们提出一种基于拟胚体的分化方案，并展示该方法如何有效地从无饲养层培养的iPS细胞中高效生成具有功能的心肌样细胞。

引言

从历史上看，对驱动人类发育和疾病的遗传与分子机制的研究主要依赖于构建基因修饰的动物模型。然而，许多人类表型无法在小鼠中成功复制，主要原因在于这两个物种之间存在的生物学差异。另一方面，获取人类组织可能受到限制，且通常难以获得足够的材料用于深入的实验研究。心血管生物学领域正面临上述双重局限：人类心脏的生理特性与小鼠存在显著差异，而大量心脏组织仅能在死亡后或心脏手术期间获得。因此，寻找一种理想的可分化为功能性人类心肌细胞（CMs）的细胞来源已成为心血管生物学的核心课题，科研人员已为此付出大量努力。已有多种细胞类型被提出作为候选，包括骨骼肌成肌细胞、局部心脏干细胞、骨髓单个核细胞、内皮祖细胞以及间充质干细胞。然而，利用这些细胞所获得的研究数据并不一致⁴。

人类胚胎干细胞（ESC）的分离最初 ⁵ 山中伸弥（Yamanaka）和汤姆森（Thomson）在诱导性多能干细胞（iPS细胞）领域的开创性发现 ^6,7 随后似乎提供了解决方案：这些细胞具有无限增殖的能力，并具备分化为三个胚层所有细胞衍生物的潜能，包括心肌细胞（CMs）。诱导多能干细胞（iPS细胞）的使用具有进一步优势：由于其来源于自体成体细胞，因此携带与供体个体或患者相同的基因组。这使得iPS细胞能够用于开发 体外 有助于研究人类遗传性疾病和发育机制的模型。由于这一特性，iPS细胞还能克服与免疫排斥和伦理问题相关的难题 ⁸因此，....

方案

1. 人类iPS细胞系的无饲养层维持与传代

1. 准备Matrigel包被的培养皿。将一管适用于人胚胎干细胞的基质胶置于冰上解冻一小时，然后用25 ml DMEM-F12培养基稀释。每35 mm培养皿中加入1 ml（若使用其他规格培养皿，则按表面积等比例添加），操作过程中保持所有试剂和器皿处于冰上预冷状态。用铝箔纸包裹培养皿避光。

注意：Matrigel 的储存浓度因批次而异。稀释说明见产品数据表。

2. 将培养板置于冰上过夜，次日从冰上取出。培养板可在冰箱中保存最多一周后再使用。
3. 根据下表配制 mTESR1 完全培养基（或解冻一管 Nutristem 培养基）和 H-ESM（人胚胎干细胞培养基）。 ....

   H-ESM	终浓度	配制 500 ml 所需量
   Knockout 血清替代物（KSR）	20%	100 ml

结果

在我们的研究中，我们利用多个人诱导多能干细胞（iPS）系生成了心肌细胞（CMs）。这些细胞系最初是在小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）饲养层上建立的，但随后立即转移至Matrigel基质上，并使用定义明确的培养基（mTESR1或Nutristem）进行培养。通过多种检测方法验证了这些细胞形态学特征的维持情况、多能性细胞标志物（OCT-4、SSEA4和TRA1-60）的表达以及基因组稳定性（图1）。

通过将iPS细胞聚集形成拟胚体（EBs），并在特定类型的血清和AA存在下进行培养，诱导其向心肌谱系分化（图2A和图2B）。根据所使用的细胞系不同，出现收缩区域的比例占总体的20-35%（图2C和视频1）。通过酶消化法从这些区域分离出的收缩性心肌细胞（CMs）（视频2）表达典型的心肌细胞结构蛋白（心肌肌钙蛋白、α-肌节肌动蛋白、肌球蛋白重链α和β）、缝隙连接蛋白（连接蛋白-43）以及主要的离子通.......

讨论

多能干细胞具有自发分化为心肌细胞（CMs）的潜力，但效率较低，且不同细胞系之间的变异性较大。因此，新型诱导方法的开发主要集中在提高分化效率，并朝着更明确的方案发展。然而，大多数这些新分化方法较为复杂，需要精细的培养条件、对试剂添加时间和浓度的精确控制，以及使用昂贵的细胞因子和生长因子进行处理。此外，不同iPS细胞系内源性细胞因子信号水平的差异使得细胞因子浓度的标准化变得困难，通常需要针对每个细胞系将其调整至适当水平。

获得的iPS来源心肌细胞的成熟度在利用iPS细胞进行心脏分化以应用于疾病建模和药物发现时，是一个需要重点考虑的关键因素。人类ESC和iPS细胞的分化通常产生具有胎儿表型的心肌细胞 即 结构尚未完全成熟。当采用单层培养方法时，这一特点尤为明显，因此这类方法更适用于特定心脏前体细胞群体的生成、扩增与分离 ^2,3.

在此情况下，用于疾病建模的“经典”拟胚体（EBs）聚集方法似乎更符合实验需求。该方法操作简便、经济、易于实施，且适用于所有细胞系。该方法无需额外添加生长因子或细胞因子.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
<强>培养基与试剂
人ESC专用基质	BD 生物科学	354277	将5 ml瓶在4℃解冻 °在冰上孵育过夜，按照说明书的稀释说明，在冰上分装至预冷的冻存管中，并于 -20 ℃ 保存 °C .
人血浆纤维连接蛋白，0.1% 溶液	Sigma	F0896-2MG	工作浓度：5 μg/cm2
层粘连蛋白	Sigma	L2020-1MG	工作浓度：5 μg/cm2
PBS（不含 Mg 和 Ca），10×	Lonza	BE17-515F
PBS（含 Mg 和 Ca），10×	生物血清	XC-S2067/500
Dispase II，中性蛋白酶，II型	罗氏	4942078001	储备液：10 mg/ml，溶于DMEM-F12，-20℃保存 °C，工作液：1 mg/ml，溶于不含镁/钙的 PBS 中
0.5% 胰蛋白酶/EDTA	Sigma	T3924
II型胶原酶	沃辛顿	4176	稀释至 480 U/ml（例如 1.6 mg/ml，在含 Mg 和 Ca 的 PBS 中
DMEM-F12	Life Technologies	21331-020
敲除DMEM	Life Technologies	10829-018
无血清替代物（KSR）	Life Technologies	10828-028	4℃解冻 °C，分装后于 -20 保存 °C
F–南美洲来源胎牛血清	Invitrogen	10270-106	应检测各批次的心源性分化潜能。在4℃下解冻 °C，在56℃下热失活 °C 反应 30 分钟，分装后于 -20 保存 °C
青霉素-链霉素溶液（PenStrep），100倍浓缩液	Life Technologies	15140-122
GlutaMAX，100倍浓缩液	Life Technologies	35050-038
MEM 非必需氨基酸，100X	Invitrogen	11140-135
N2 补充剂，100 倍浓缩液	Life Technologies	17502-048
B27添加剂，50倍浓缩液	Life Technologies	12587-010
2-巯基–乙醇	Invitrogen	31350-010
猪皮明胶	Sigma	G1890-100G	在水中配制1%的储备液，-20℃保存 °C. 用 PBS 稀释至 0.1%，并于 4℃ 保存 °C
mTeSR1	干细胞技术	5850	将5倍浓缩补充剂与基础培养基混合，分装后于-20℃保存 °C. 不要将完全培养基置于4℃保存 °C 超过 1 周
Nutristem hESC XF	Stemgent，来自 Biological Industries	05-100-1A	4℃解冻 °C O/N，分装后于 -20 保存 °C，直至使用。分装样品可保存于 4 °C，不超过一周。
mFreSR	干细胞技术	5853
抗坏血酸	Sigma	A4544-25G	以水配制 10 mg/ml 的储存液。分装后于 -20 ℃ 保存。 °避光，加入 EBM 至终浓度（500X）
<强>塑料器皿
35 mm 培养皿	Becton Dickinson	353001
细胞刮刀	康宁公司	3008
12孔板	Becton Dickinson	353043
Permanox 2孔腔室载玻片	赛默飞世尔科技	177437
玻璃双孔板载玻片	赛默飞世尔科技	177380
6孔板，超低吸附表面	康宁公司	3471
18G 针头	Becton Dickinson	304622
玻璃巴斯德吸管，230 mm	VWR International	612-1702
2.5 ml 注射器	Becton Dickinson	300188
<强>仪器设备
IVF 工作站	尼康 KSystem
尼康 SMZ1500 体视显微镜	尼康