本文描述了利用萤火虫荧光素酶-GFP融合蛋白进行研究的方法 体内 蛋白质折叠在 酿酒酵母利用该试剂，可通过荧光显微镜和酶学检测方法同时监测模型热变性蛋白的复性过程，以探究蛋白质稳态网络组分在蛋白质质量控制中的作用。
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摘要
摘要
蛋白稳态，即蛋白质折叠/生成、重折叠/修复和降解等过程的总和，是一种精细的细胞平衡状态，必须维持以避免产生有害后果 1外部或内部因素破坏这种平衡，可导致蛋白质聚集、毒性产生以及细胞死亡。在人类中，这是引发亨廷顿病、帕金森病和阿尔茨海默病等神经退行性疾病相关症状的主要因素之一。 10因此，鉴定参与蛋白质稳态维持的蛋白质对于开发这些致残性疾病的治疗方法至关重要。本文描述了用于监测 体内 利用近实时分辨率研究模型蛋白萤火虫荧光素酶与绿色荧光蛋白融合蛋白（FFL-GFP）的蛋白质折叠。FFL-GFP 是一种独特的嵌合模型蛋白，其中 FFL 部分对胁迫诱导的错误折叠和聚集极为敏感，从而导致酶失活 12通过酶学检测法监测荧光素酶活性，同时利用GFP基团通过自动化显微镜对可溶性或聚集态的FFL进行可视化观察。这两种联用方法结合了两个平行且技术上相互独立的分析手段，用于研究酶在应激后的重折叠及功能恢复过程。酶活性的恢复可直接与去聚集和再溶解的动力学过程相关联，从而更深入地理解蛋白质质量控制因子（如分子伴侣）如何协同完成这些功能。此外，还可利用基因敲除或突变来检验特定蛋白质或蛋白质亚基在该过程中的作用。本文中，我们重点探讨蛋白去聚集酶Hsp104的贡献 13，已知可与Hsp40/70/核苷酸交换因子（NEF）重折叠系统协同作用 5，用于蛋白质复性以验证该方法。
引言
在人类中，阿尔茨海默病、帕金森病和亨廷顿病等神经退行性疾病已与蛋白质错误折叠和聚集相关联 10细胞利用分子伴侣防止细胞内蛋白质在折叠过程中陷入错误折叠的非活性结构 6分子伴侣参与细胞内复杂的相互作用网络，但这些相互作用的总和如何影响生物体的蛋白质稳态尚未完全阐明。在细胞质蛋白质折叠过程中起主要作用的分子伴侣之一是70 kDa热休克蛋白（Hsp70）家族。 19已发现，在酵母中Hsp70的缺失会降低其折叠新生异源表达的FFL以及重折叠内源性蛋白鸟氨酸转氨甲酰酶的能力。 体内 18, 7以接近实时的分辨率分析折叠过程的能力将有助于理解其他细胞因子如何影响这一依赖于Hsp70的过程。此外，折叠/再折叠反应可能并非完全依赖于这些辅助蛋白，因此检测方法必须具备足够的灵敏度，以检测动力学和效率上的大幅或细微变化。
酵母细胞去聚集酶 Hsp104 在修复聚集的错误折叠蛋白中发挥关键作用。尽管已在真菌和植物中鉴定出 Hsp104 的同源物，但该蛋白家族似乎在后生动物中缺失。有研究提出，其他分子伴侣（如 Hsp110 家族蛋白）可能在哺乳动物中执行部分已知的 Hsp104 功能16。Hsp104 是一种属于 AAA+ 家族的六聚体蛋白复合物，在酵母中可重塑蛋白聚集体，促进其重折叠与修复13。在酵母细胞中，Hsp104 与酵母 Hsp70 蛋白 Ssa1 以及酵母 Hsp40 蛋白 Ydj1 共同参与变性 FFL 的恢复过程5, 8。此外，小热休克蛋白 Hsp26 也被证明是 Hsp104 介导 FFL 去聚集所必需的2。
FFL 是一种具有两个结构域的蛋白质，可在活性位点结合底物荧光素，并在需要 ATP 和氧气的构象变化后，催化底物脱羧，释放出氧化荧光素、二氧化碳（CO2）、单磷酸腺苷（AMP）和光11, 9, 3。 commercially available FFL 底物 D-荧光素在反应中产生的发光波长范围为 550–570 nm，可使用发光仪检测15。FFL 对化学或热处理引起的变性极为敏感，去折叠后会迅速聚集。当暴露于 39–45 °C 温度条件下时，FFL 会发生可逆的去折叠和失活12。相比之下，GFP 及其衍生物对蛋白质去折叠应激具有高度抗性14。因此，将这两种蛋白质融合，可使 FFL 作为实验上不稳定的结构域，引导功能性 GFP 定位于细胞内聚集体，进而通过荧光显微镜在群体和单细胞水平上进行可视化观察。将酶学检测方法与半自动多功能酶标仪联用，并结合自动显微成像技术，可前所未有地实现对复性反应动力学和产率的同步评估。此外，模式真核生物 Saccharomyces cerevisiae 具备便捷的分子遗传操作体系，既可精确调控蛋白质质量控制网络，也为发现参与细胞应激反应和蛋白质稳态调控的新组分提供了基于探索的研究途径。
本研究中，表达 FFL-GFP 的野生型（WT）和 HSP104 缺失菌株经受使蛋白质变性的热激处理。通过酶活性检测和显微镜观察来监测 FFL-GFP 的复性情况，以此作为在恢复过程中对表达蛋白组修复能力的间接评估指标。与野生型细胞相比，我们发现 Hsp104 缺失菌株对 FFL-GFP 的复性效率降低了约 60%，这一结果支持了先前关于 Hsp104 在变性 FFL 复活中发挥作用的研究结论2。
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方案
1. 含FFL-GFP质粒菌株的构建
本研究中 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） 菌株 BY4741 (MATa, his3Δ1, leu2Δ0, met15Δ0 ura3Δ0) 与一个 HSP104 来自酵母基因敲除文库（Open Biosystems/Thermo Scientific）的缺失菌株。通过Hsp104特异性抗体进行蛋白质印迹分析，确认了基因缺失。
FFL-GFP 由质粒 p426MET25-FFL-GFP 表达，该质粒构建于来自多伦多大学 Glover 实验室的 LEU2 型源质粒之上17，可应作者要求获取。FFL-GFP 融合蛋白的表达由 MET25 甲硫氨酸可阻遏型启动子调控。该质粒通过参照 Gietz et. al, 1995 年发表的方法进行改造后，转化至各菌株中：
- 将25 ml对数生长期细胞在50 ml锥形管中以4,400 rpm离心2 min，用500 μl双蒸水洗涤20（ddH₂O）2O），弃去上清液。
- 将细胞重悬于250 μl TE/LiAc（10 mM Tris-HCl，pH=7.5，1 mM EDTA，0.1 M醋酸锂）中。在30 °C下静置孵育20分钟，不进行混匀。
- 将50 μl感受态细胞转移至新离心管中，加入5 ml（50 μg）载体DNA和5 μl（0.1–5 μg）质粒DNA。向该混合物中加入300 μl PEG/TE/LiAc（与TE/LiAc相同，另含40%聚乙二醇），于30 °C孵育细胞30分钟。
- 向该混合物中加入1/10体积（v/v）的DMSO（36 μl），并在42 °C下热激6 min。
- 以 6,000 rpm 离心混合物 30 秒，弃上清液。将细胞重悬于 100 μl 无菌 ddH₂O 中。20，并将细胞铺板于缺乏尿嘧啶的合成完全培养基（SC-URA）上。
2. FFL-GFP 的诱导
当细胞进入对数生长期后，FFL-GFP 即被诱导表达，因此在热激前的大部分蛋白均为新合成的蛋白，从而避免因细胞随年龄增长而功能下降所导致的蛋白质随时间推移发生终末聚集。
- 第1天：将细胞在5 ml SC-URA培养基中，30 °C旋转培养过夜。
- 第2天：测定OD600，并以OD600~0.2接种5 ml新鲜SC-URA培养基进行培养。
- 在30 °C下旋转培养，直至细胞进入对数生长期，OD600达到~0.8–1.0。
- 将细胞在15 ml锥形离心管中以4,400 rpm离心3分钟，弃上清，用500 μl ddH2O重悬细胞沉淀，并转移至微量离心管中。
- 以6,000 rpm离心，弃上清。
- 用5 ml SC-URA-MET培养基重悬细胞，于30 °C旋转培养1小时。
- 离心细胞，并用ddH2O重复洗涤一次，弃上清。
- 将细胞重悬于5 ml含100 μg/ml环己酰亚胺的SC-URA培养基中，以抑制蛋白质表达，并立即进入第3步。
3. 酶法 FFL-GFP 恢复实验
该检测是一种用于定量测定群体中活性酶水平的方法。
- 该实验的准备工作：
- 测定每个样品的 OD600。
- 根据样品数量、所需重复次数，另加约 1,200 μl 用于管路，计算所需 D-荧光素的总量。D-荧光素的终浓度约为每 100 μl 细胞悬液中含 23 μg。初始时将其溶于水，配制成 7.5 mg/ml 的储存液，实验前用 SC 培养基稀释至 455 μg/ml。在 图 2 中，每个样品分析了三个重复，共使用了 2.4 ml 的 D-荧光素。
- 设置酶标仪进行闪光型发光检测程序（参考 BioTek Gen5 的“带注射功能的闪光型发光检测”；其他仪器请参照制造商说明）
- 将温度设置为 30 °C
- 设置酶标仪，使其依次向各孔加入 D-荧光素、振荡并单独读取每孔信号。
- 读取发光值（终点读数，积分时间为 5 秒，灵敏度设为 180）
- 在恢复实验中，每次读数之间需振荡 5 分钟，延迟 20 分钟，再额外振荡 5 分钟。
- 通过注射器向每孔加入 50 μl D-荧光素。
- 热激前发光值的测定：在将细胞加入含环己酰亚胺的培养基以终止蛋白质合成后，立即进行测量。
- 将每个样品的细胞各取 100 μl，按所需的重复数转移至白色不透明 96 孔板中。
- 对照组应包括水空白对照和含空载体的细胞对照。
- 按照上述参数启动读数程序。
- 为使 FFL-GFP 中的 FFL 结构域变性，将 5 ml 培养物置于玻璃试管中，在 42 °C 下振荡孵育 25 分钟。
- 恢复实验的发光检测从细胞离开培养箱后立即开始，此时间点记为零时。首次检测按上述方法进行，之后每 30 分钟检测一次，共持续 90 分钟。
- 将各时间点的发光值归一化处理：以经 OD600 校正后的热激前发光值为基准（即将热激前的发光值除以对应的 OD600 值）。
4. 荧光显微镜
该实验是一种半定量方法，用于测定细胞群体中随时间推移聚集体的溶解情况。
- 诱导操作同方案中第2节，步骤1-8所述。
- 取样时间点与上述相同（第3节，步骤4），但用于显微镜观察时，需在热激前及每个恢复时间点收集1 ml细胞，并将样品置于培养管中，在30 °C下旋转孵育。
- 观察：
- 取1 ml细胞以6,000 rpm离心30秒，弃上清液。
- 将细胞沉淀重悬于2 μl ddH2O中。
- 在载玻片上混合2 μl细胞与2 μl 2%低熔点琼脂糖，加盖盖玻片。为获得单层细胞，用手指轻轻按压盖玻片中心，并旋转至盖玻片难以移动为止。
- 使用荧光显微镜的100倍油镜观察细胞；采用微分干涉差（DIC）观察细胞形态，使用FITC滤光片观察GFP荧光。
- 对每个菌株在每个时间点拍摄多张图像以进行定量分析。每幅图像应包含约15–30个细胞，以便于实验后的定量分析。
- 计算含有聚集体的细胞百分比时，总计数50–100个细胞，并将含聚集体的细胞数除以总细胞数。
5. 单细胞显微镜技术
该方法用于追踪单个细胞中单个聚集体随时间的溶解过程。
- 按照第2节，步骤1-8所述诱导FFL-GFP表达。
- 热激后，将细胞在15 ml锥形管中以4,400 rpm离心2分钟。
- 用500 μl水洗涤细胞，并重悬于20 μl ddH2O中。
- 对于每种菌株，剪取一块5×5 mm的SC-URA琼脂平板区域，利用曾与培养皿接触的表面，用移液器加入4 μl细胞，并用枪头在琼脂表面涂布均匀。静置约1分钟。
- 使用镊子将琼脂块有接触面朝下放置于一个直径约55 mm、底部为玻璃（No. 0）的培养皿上，并轻轻按压。
- 观察：
- 参见第4节中的i-iii。
- 根据培养物密度，为每种菌株设置2-4个焦面坐标点。
- 设置相机在90分钟内每隔5分钟拍摄一次Z轴层扫图像，扫描范围适当（-/+ 15 μm，切片厚度0.5-1.0 μm）。
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结果
酵母依赖于解聚酶 Hsp104 来高效地重折叠热变性的蛋白质。通过发光闪光检测法，在25分钟热激后监测了 FFL-GFP 的活性。 图1该自动化检测的结果如图所示 图2 在90分钟内表现出逐步增强的活性，最终导致 >WT 细胞中回收率为 80%。 hsp104Δ 菌株在相同时间范围内恢复了原始活性的19%。此外，分子伴侣突变株的初始失活程度明显更高（野生型为26%活性，突变株为11%活性） hsp104Δ这表明Hsp104可能在热应激前发挥保护作用，或在热失活步骤中迅速与变性的FFL-GFP结合，以减少酶活性的丧失。
群体显微镜观察结果与酶活性测定结果一致。hsp104Δ 突变株中几乎所有细胞在热激后均至少含有一个FFL-GFP聚集体，而野生型（WT）菌株中的聚集体数量在热激后90分钟内减少了62%（图3）。尽管两种菌株在热激后均立即形成了大量聚集体，但含有聚集体的野生型细胞数量迅速减少，而hsp104Δ
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讨论
本文使用模型蛋白 FFL-GFP 证明了酵母去聚集酶 Hsp104 在蛋白质重溶解和修复过程中的作用。通过酶学检测和显微镜技术，对同一底物蛋白的不同状态进行分析，以确定其重折叠效率和产率。酶活性恢复实验结果表明，不仅在 hsp104Δ 突变株中最大恢复效率较低，而且该突变株所受的初始去折叠压力也更大（图2）。分析还显示，尽管 hsp104Δ 细胞似乎试图进行修复，但其蛋白质重折叠速度不及野生型细胞。该方法实现了对 FFL-GFP 活性的灵敏且定量的分析，揭示了 Hsp104 在该蛋白修复过程中的关键作用。
显微镜结果表明，变性的FFL酶修复效率低下的原因是蛋白质被 trapping 在聚集体中。群体分析显示，在缺乏Hsp104的细胞中，没有任何细胞能在90分钟内完全清除所有聚集体（图3）。此外，单细胞分析揭示聚体会随时间发生融合，提示较小聚集体合并为较大结构可能有助于修复和重折叠过程（图4）。尽管这一现象在静态图像中并不明显，但延时录像可追踪各...
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本研究得到了美国国立卫生研究院（NIGMS-074696）向 K.A.M. 提供的资助，以及美国微生物学会 Robert D. Watkins 研究生研究奖学金对 J.L.A. 的支持。我们还感谢多伦多大学的 John Glover 提供 FFL-GFP 源质粒。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 试剂 | |||
| Synergy MX 微孔板读板仪 | BioTek | ||
| Olympus IX81-ZDC 共聚焦倒置显微镜 | Olympus, Tokyo Japan | ||
| Lumitrac 200 白色 96 孔板 | USA Scientific | ||
| SlideBook 5.0 数字显微成像软件 | Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO, USA | ||
| 仪器 | |||
| Tris Base | Fisher | BP152-1 | |
| (LiAc) 乙酸锂 | Sigma | L6883 | |
| PEG（聚乙二醇） | Fisher | BP233-1 | |
| EDTA | Fisher | BP120-1 | |
| DMSO | Malinckrodt | 4948 | |
| SC | Sunrise | 1300-030 | |
| SC-URA | Sunrise | 1306-030 | |
| 放线菌酮（cycloheximide） | Acros Organics | 357420050 | |
| D-荧光素（D-luciferin） | Sigma | L9504 | |
| 低熔点琼脂糖 | NuSieve | 50082 | |
| 浸油 | Cargille | 16484 |
参考文献
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