我们介绍了在秀丽隐杆线虫(C. elegans)中研究淀粉样蛋白病相关特征的方法。我们展示了如何构建在神经元中表达人源Aβ42的转基因线虫,以及如何通过行为学实验检测其功能。此外,我们还展示了如何获取可用于药理学测试的原代神经元培养物。
方法文章
我们介绍了在秀丽隐杆线虫(C. elegans)中研究淀粉样蛋白病相关特征的方法。我们展示了如何构建在神经元中表达人源Aβ42的转基因线虫,以及如何通过行为学实验检测其功能。此外,我们还展示了如何获取可用于药理学测试的原代神经元培养物。
淀粉样病变是指随时间推移在组织中出现淀粉样蛋白β(Aβ)的异常合成与积聚。Aβ是阿尔茨海默病(AD)的标志性特征,也见于路易体痴呆、包涵体肌炎和脑淀粉样血管病。 1-4. 淀粉样变性疾病会随着时间推移而逐渐进展。因此,寿命较短的简单生物体可能有助于阐明这些疾病的分子机制。本文中,我们描述了利用线虫研究Aβ介导的神经退行性变的实验方案 秀丽隐杆线虫因此,我们通过注射编码人 Aβ 的 DNA 来构建转基因蠕虫42 转入成年雌雄同体的合胞体性腺中。通过诱变诱导的整合使转基因品系稳定. 线虫通过收集和接种其卵进行年龄同步。表达 Aβ 的神经元的功能42 在适当的动物行为学实验(趋化性实验)中进行检测。通过获取胚胎的原代神经元培养物来补充行为学数据,并用于检测抗凋亡化合物的神经保护作用。
淀粉样蛋白β(Aβ)是一种由36-43个氨基酸组成的多肽,由淀粉样前体蛋白(APP)经β和γ分泌酶连续切割后生成1。γ分泌酶作用于Aβ多肽的C端,决定了其长度的可变性5。最常见的Aβ形式为Aβ40和Aβ42,其中后者更常与阿尔茨海默病(AD)等病理状态相关5。在高浓度下,Aβ形成β片层结构,并聚集成为淀粉样纤维6。纤维沉积物是神经元周围老年斑的主要成分。目前认为,老年斑以及可溶性非斑块状Aβ寡聚体均是Aβ致病的核心形式。
神经性淀粉样病变的实验室研究因这类疾病具有随时间推移而进展的特点而变得复杂。因此,开发具有较短寿命、可进行遗传操作且作为小鼠补充的动物模型显得尤为重要。这些模型可用于阐明淀粉样病变的特定方面——通常是细胞和分子层面的机制——并因其结构简单,有助于揭示问题的本质。线虫 秀丽隐杆线虫 属于这一类别的生物具有较短的生命周期,约20天,且其基本的细胞过程(包括基因表达调控、蛋白质转运、神经元连接、突触形成、细胞信号传导以及细胞死亡)与哺乳动物相似。 7蠕虫的独特特征包括强大的遗传学工具以及缺乏血管系统,这使得研究人员能够独立于血管损伤来研究神经元损伤。然而,其缺乏大脑的结构限制了该模型的使用 秀丽隐杆线虫 研究神经退行性变的多个方面。此外,无法在此生物体中重现和鉴定病变的解剖分布。其他局限性还包括难以评估基因表达谱的差异以及复杂行为和记忆功能的损害。本文描述了生成 秀丽隐杆线虫 淀粉样病变模型
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1. 转基因线虫的构建
2. 行为学实验
其中 N,N测试 和 N继续,注明动物总数、实验组动物数量和对照组动物数量。3. 原代胚胎细胞培养
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通过我们的实验方案,我们研究了人源Aβ42寡聚体对神经元功能的影响8。使用引物从构建体PCL129中扩增出编码人源Aβ42的片段以及Fire载体pPD50.52的人工信号肽编码序列,引物在两端引入了Sma I限制性内切酶位点。随后将该片段插入到pPD95.75 Fire载体中的一个构建体中,该构建体包含2,481 bp的flp-6启动子序列,插入位置位于唯一的Sma I位点之间10。利用方案1中描述的转化技术,我们构建了在ASE神经元中表达Aβ42的转基因线虫(FDX(ses25)品系)8。为了标记阳性转化子,我们使用了Pgcy-5::GFP报告基因,该基因特异性驱动右侧ASE神经元(ASER)中的GFP表达11。线虫会粘附在垫片上,因为干燥的琼脂糖会吸收其体内的水分。因此,必须迅速将线虫放置到注射垫上并完成注射操作,否则它们会因脱水而死亡。携带可遗传的染色体外阵列的F1子代比例可能有所变化,典型范围为3–...
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本文介绍了一种结合使用 C. elegans 研究淀粉样病变细胞与分子机制的综合方法。该方法的优势包括:1)成本低。C. elegans 可在室温下、以接种细菌的普通培养皿进行培养。2)强大的遗传学工具。可在数月内获得转基因动物,并拥有大量可用的启动子序列,以实现目标基因在特定神经元中的表达。3)结构简单且已被充分研究的神经系统。C. elegans 拥有极为简单的神经系统(共302个神经元),这种简洁性使其神经系统得到了深入表征,包括细胞谱系、每个神经元的特定功能/作用及其突触连接。然而,C. elegans 也存在局限性,包括细胞体积小,限制了免疫组织化学等常规生化技术的应用;以及具有较厚的外层结构(角质层),使神经元与外界环境隔离,因此药理学方法在 C. elegans 中可能效果有限。原代细胞培养是一种可部分缓解该问题的有效策略。
实验方案中的关键步骤包括使用大量线虫作为起始材料,并密切监测制备过程,以避免丢失卵和胚胎 等等掌握注射过程中如何正确操作动物也至关重要。...
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作者声明不存在任何竞争性经济利益。
我们感谢刘爽博士对本文稿的审阅。PCL12 载体由 Christopher D. Link 博士惠赠。本研究得到了美国国家科学基金会两项资助(0842708 和 1026958)以及美国心脏协会资助(09GRNT2250529)对 FS 的支持。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1. NGM | |||
| 氯化钠 | Sigma-Aldrich | S5886 | 3 g |
| 细菌用琼脂 | AMRESCO | J637 | 17 g |
| 蛋白胨 | AMRESCO | J636 | 2.5 g |
| 蒸馏水 | 加至 975 ml | ||
| 经高压灭菌后,加入以下试剂并充分混匀 | |||
| 硫酸镁 | Sigma-Aldrich | M2643 | 1 ml 的 1 M 储液 |
| 氯化钙 | Sigma-Aldrich | C5670 | 1 ml 的 1 M 储液 |
| 胆固醇 | Sigma-Aldrich | C3045 | 1 ml 的 5 mg/ml 储液(溶于乙醇) |
| 磷酸钾缓冲液 | 25 ml 的 1 M 储液 | ||
| 2. 磷酸钾缓冲液 | |||
| 磷酸二氢钾 | Sigma-Aldrich | P5655 | 108.3 g |
| 磷酸氢二钾 | Sigma-Aldrich | P3786 | 35.6 g |
| 蒸馏水 | 加至 1 L | ||
| 经高压灭菌 | |||
| 3. M9 缓冲液 | |||
| 磷酸二氢钾 | Sigma-Aldrich | P5655 | 3 g |
| 磷酸氢二钠 | Sigma-Aldrich | S5136 | 6 g |
| 氯化钠 | Sigma-Aldrich | S5886 | 5 g |
| 硫酸镁 | Sigma-Aldrich | M2643 | 1 ml 的 1 M 储液 |
| 蒸馏水 | 加至 1 L | ||
| 经高压灭菌 | |||
| 4. 卵缓冲液(pH 7.3,340 mOsm) | |||
| 氯化钠 | Sigma-Aldrich | S5886 | 118 mM |
| 氯化钾 | Sigma-Aldrich | P5405 | 48 mM |
| 氯化钙 | Sigma-Aldrich | C5670 | 2 mM |
| 氯化镁 | Sigma-Aldrich | M4880 | 2 mM |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310 | 25 mM |
| 蒸馏水 | 加至 1 L | ||
| 经高压灭菌 | |||
| 5. CM-15 | |||
| L-15 培养基 | Gibco | 11415 | 450 ml |
| 胎牛血清 | Gibco | 10437-028 | 50 ml |
| 青霉素 | Gibco | 15140 | 50 单位/ml |
| 链霉素 | Gibco | 15140 | 50 g/ml |
| 用蔗糖调节至 340 mOsm,然后经无菌滤器过滤至已高压灭菌的瓶中,4 °C 保存 | |||
| 6. 其他试剂 | |||
| 卤代烃 700 油 | Halocarbon Products | 9002-83-9 | |
| 5 μm Acrodisc 注射器滤器 | PALL Co. | 4199 | |
| 几丁质酶 | Sigma-Aldrich | C6137-5UN | |
| 凝集素(花生) | Sigma-Aldrich | L0881-10MG | |
| 氢氧化钠 | Fisher Scientific | S320 | |
| 赖氨酸 | Sigma-Aldrich | L5501 | |
| 生物素 | Sigma-Aldrich | B4639 | |
| 次氯酸钠溶液 | Sigma-Aldrich | 425044 | |
| 叠氮化钠 | Sigma-Aldrich | 71289 | |
| 蔗糖 | Sigma-Aldrich | S0389 | |
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