一种用于淀粉样病变研究的 Caenorhabditis elegans 模式系统

摘要

我们介绍了在秀丽隐杆线虫（C. elegans）中研究淀粉样蛋白病相关特征的方法。我们展示了如何构建在神经元中表达人源Aβ₄₂的转基因线虫，以及如何通过行为学实验检测其功能。此外，我们还展示了如何获取可用于药理学测试的原代神经元培养物。

摘要

淀粉样病变是指随时间推移在组织中出现淀粉样蛋白β（Aβ）的异常合成与积聚。Aβ是阿尔茨海默病（AD）的标志性特征，也见于路易体痴呆、包涵体肌炎和脑淀粉样血管病。 ^1-4. 淀粉样变性疾病会随着时间推移而逐渐进展。因此，寿命较短的简单生物体可能有助于阐明这些疾病的分子机制。本文中，我们描述了利用线虫研究Aβ介导的神经退行性变的实验方案 秀丽隐杆线虫因此，我们通过注射编码人 Aβ 的 DNA 来构建转基因蠕虫₄₂ 转入成年雌雄同体的合胞体性腺中。通过诱变诱导的整合使转基因品系稳定. 线虫通过收集和接种其卵进行年龄同步。表达 Aβ 的神经元的功能₄₂ 在适当的动物行为学实验（趋化性实验）中进行检测。通过获取胚胎的原代神经元培养物来补充行为学数据，并用于检测抗凋亡化合物的神经保护作用。

引言

淀粉样蛋白β（Aβ）是一种由36-43个氨基酸组成的多肽，由淀粉样前体蛋白（APP）经β和γ分泌酶连续切割后生成¹。γ分泌酶作用于Aβ多肽的C端，决定了其长度的可变性⁵。最常见的Aβ形式为Aβ₄₀和Aβ₄₂，其中后者更常与阿尔茨海默病（AD）等病理状态相关⁵。在高浓度下，Aβ形成β片层结构，并聚集成为淀粉样纤维⁶。纤维沉积物是神经元周围老年斑的主要成分。目前认为，老年斑以及可溶性非斑块状Aβ寡聚体均是Aβ致病的核心形式。

神经性淀粉样病变的实验室研究因这类疾病具有随时间推移而进展的特点而变得复杂。因此，开发具有较短寿命、可进行遗传操作且作为小鼠补充的动物模型显得尤为重要。这些模型可用于阐明淀粉样病变的特定方面——通常是细胞和分子层面的机制——并因其结构简单，有助于揭示问题的本质。线虫 秀丽隐杆线虫 属于这一类别的生物具有较短的生命周期，约20天，且其基本的细胞过程（包括基因表达调控、蛋白质转运、神经元连接、突触形成、细胞信号传导以及细胞死亡）与哺乳动物相似。 ⁷蠕虫的独特特征包括强大的遗传学工具以及缺乏血管系统，这使得研究人员能够独立于血管损伤来研究神经元损伤。然而，其缺乏大脑的结构限制了该模型的使用 秀丽隐杆线虫 研究神经退行性变的多个方面。此外，无法在此生物体中重现和鉴定病变的解剖分布。其他局限性还包括难以评估基因表达谱的差异以及复杂行为和记忆功能的损害。本文描述了生成 秀丽隐杆线虫 淀粉样病变模型

方案

1. 转基因线虫的构建

1. 转化。
   1. 制备显微注射垫。在玻璃盖玻片上滴加一滴热的、2%的琼脂糖水溶液。迅速将第二片盖玻片覆盖在液滴上并轻轻按压。待琼脂糖凝固后，将两片盖玻片分开，并在80 °C真空烘箱中过夜烘烤盖玻片垫。
   2. 拉制毛细玻璃针。使用Sutter P-97拉针仪拉制外径/内径为1/0.5 mm的含丝硼硅酸盐毛细管。毛细针尖端封闭，在后续操作中再将其打开。
   3. 配制显微注射混合液。将目的DNA（每个构建体20 ng/μl）与空质粒DNA混合，使总DNA浓度达到150 ng/μl。离心注射混合液以去除任何污染物。此步骤至关重要，因为污染物会降低转化效率。将上层5 μl液体（杂质和其他污染物沉淀在底部）转移至新离心管中用于注射。
   4. 通过毛细作用加载注射混合液。将毛细针的底部浸入注射混合液中。通常0.5 μl足以注射100条线虫。
   5. 安装显微注射针。将毛细针插入显微操作仪的针夹中，并通过将其尖端在载玻片上固定盖玻片的边缘摩擦，或在琼脂糖垫上的碎屑上摩擦，使针尖破裂打开。此步骤至关重要，因为过大的针尖会损伤线虫，而过小的针尖容易堵塞。可通过观察破裂后针尖的形状，尤其是通过流速来判断其质量。流速可通过在卤代烃700油滴中，施加注射压力后从开放针尖流出的气泡大小来评估。
   6. 将线虫转移至注射垫。在注射垫上滴加一滴700卤代烃油，并将数条线虫（初学者建议1–2条）转移至油滴中。使用线虫挑取工具将线虫压向垫面，使其粘附在琼脂糖上。线虫应排列成行，腹面朝向同一方向。避免触碰线虫头部。若多次尝试后线虫仍无法粘附，应更换新的注射垫，或增加琼脂糖厚度和/或浓度。
   7. 将注射针插入线虫体内。移动载物台，将线虫置于注射针下方。将注射针插入性腺中央区域，因为该区域的细胞质为多个生殖细胞核所共享，这有助于将注射的DNA传递给更多后代。注射针应几乎与线虫平行（约15°–25°夹角）。垂直向下推动针尖进入线虫体内，直至体壁出现凹陷。然后轻敲操作仪，促使针尖插入。为获得最佳效果，应注射两侧性腺。
   8. 注入DNA溶液。对注射针施加压力，直至性腺膨胀。停止供液，将线虫从针尖移开。测试针尖是否通畅，然后移动至下一条线虫并重复注射步骤。
   9. 恢复线虫活性。在线虫上加入一滴恢复缓冲液（约10 μl），孵育至线虫开始游动。加入等体积M9缓冲液，待线虫恢复游动后重复数次，直至溶液主要为M9。将线虫逐个转移至接种有细菌的培养板中。
2. 整合。
   1. 将40条健康、饱食的L4期线虫转移至新鲜培养板中。
   2. 用4,000 rads的γ射线照射40分钟。将照射后的线虫（P0代）转移至新鲜的、接种OP50大肠杆菌的培养板中（每板4条）。也可选择使用300 J/m²的紫外线照射。
   3. 从每块板中挑选10–20条F1代转基因线虫，分别转移至独立的培养板中，并标记对应P0代来源。
   4. 从每个F1代中挑选2–4条F2代转基因线虫，分别转移至不同培养板。检查F3代后代中转化标记的遗传是否达到100%。通常，经照射的单条线虫后代中约有1–3%会发生整合事件。
   5. 建立三个或更多独立转基因品系的冻存种群。

2. 行为学实验

1. 年龄同步化。
   1. 在标准的 10 cm NGM 平板上培养线虫，加入 OP50 E. coli，直至获得大量处于产卵期的成虫（3–5 天）。
   2. 用 1 ml M9 缓冲液悬浮线虫，收集至 50 ml Falcon 管中。
   3. 加入 5 ml M9 缓冲液，以 450 × g 离心 3 分钟。弃去上清液。重复此步骤 3–4 次。
   4. 最后一次离心后，移除上清液，并向沉淀的线虫中加入 10 倍体积的碱性次氯酸盐溶液（0.5 M NaOH，1% 次氯酸盐，现配现用）。室温孵育约 10 分钟。可通过取一滴裂解液置于盖玻片上并在显微镜下观察线虫状态来监测裂解反应。当约 80% 的线虫破裂时，应终止反应。
   5. 加入等体积的无菌卵缓冲液以终止裂解反应。
   6. 以 450 × g 离心 5 分钟，收集卵（及残余虫体）。
   7. 用无菌卵缓冲液洗涤卵 2–3 次。
   8. 将卵在 M9 缓冲液中过夜孵育，随后接种至标准 NGM 平板上。
2. 趋化性实验。
   1. 准备若干块大小约为 0.5×0.5×0.5 cm 的琼脂块。我们将琼脂倒入 10 cm 培养皿中，再从此琼脂板上切割出所需小块。
   2. 将琼脂块浸泡于含有目标引诱剂（使用饱和或接近饱和浓度）的溶液中，持续 2 小时。常用的引诱剂包括赖氨酸（0.5 M）和生物素（0.2 M）。
   3. 将一块琼脂块置于已标记测试点和对照点位置的 10 cm 实验培养皿中（图 1A）。过夜平衡，使浓度梯度形成（图 1B）。单次实验准备 5 个培养皿。
   4. 实验前，在每个测试点和对照点各加入 10 μl 的 20 mM NaN₃（麻醉剂）。
   5. 将 20 条年龄同步化的线虫放置于培养皿中央，并将培养皿置于 20 °C 培养箱中孵育。
   6. 1 小时后，统计测试点和对照点上的线虫数量，并按下式计算趋化性指数（C.I.）： 其中 N、N_test 和 N_Cnt. 分别表示动物总数、测试点上的动物数和对照点上的动物数。

3. 胚胎原代细胞培养

1. 按照年龄同步化方法裂解线虫。
2. 加入等体积的无菌卵缓冲液终止裂解反应，于450 × g离心5分钟。小心弃去上清液，注意不要丢失沉淀的卵。重复2-3次，直至上清液澄清。
3. 将沉淀的卵（及残体）重悬于2 ml无菌卵缓冲液中，加入2 ml无菌的60%蔗糖卵缓冲液。手动或使用涡旋振荡器混合溶液，直至卵完全重悬（因卵在离心过程中易形成团块）。
4. 于450 × g离心15分钟。
5. 小心将上清液（含卵）转移至无菌离心管中。弃去含有残体及其他裂解副产物的沉淀。
6. 用卵缓冲液重悬卵以去除残留蔗糖，于450 × g离心5分钟。轻柔收集并弃去上清液。重复3次。
7. 在超净工作台中，将沉淀的卵重悬于含1 U/ml壳多糖酶的无菌卵缓冲液中，室温孵育以消化卵壳。30分钟后开始在倒置细胞培养显微镜下监测反应进程。每批壳多糖酶活性略有差异，通常消化过程在1小时内完成。
8. 当约70-80%卵壳被壳多糖酶消化后，加入CM-15培养基（含10%胎牛血清、50 U/ml青霉素和50 μg/ml链霉素的L-15细胞培养基）。使用27号针头的注射器吹打分散细胞。用5.0 μm滤膜过滤细胞悬液，以去除完整胚胎、细胞团块及幼虫。
9. 将分散后的细胞悬液于450 × g离心15分钟，弃去上清液，将沉淀重悬于CM-15细胞培养基中。
10. 将分散的细胞接种于预先以花生凝集素（0.1 mg/ml，溶于水）包被的玻璃盖玻片上。注意：细胞必须黏附于基质表面才能分化。
11. 细胞可在空气环境中室温（16-20 °C）维持培养超过2周。

结果

通过我们的实验方案，我们研究了人源Aβ₄₂寡聚体对神经元功能的影响⁸。使用引物从构建体PCL12⁹中扩增出编码人源Aβ₄₂的片段以及Fire载体pPD50.52的人工信号肽编码序列，引物在两端引入了Sma I限制性内切酶位点。随后将该片段插入含有2,481 bp flp-6启动子序列的pPD95.75 Fire载体中，位于唯一的Sma I位点之间¹⁰。利用方案1中描述的转化技术，我们构建了在ASE神经元中表达Aβ₄₂的转基因线虫（FDX(ses25)品系）⁸。为了标记阳性转化子，我们使用了P_gcy-5::GFP报告基因，该基因可特异性驱动右侧ASE神经元（ASER）表达GFP¹¹。线虫会黏附在垫片上，因为干燥的琼脂糖会吸收其体内的水分。因此，必须迅速将线虫放置到注射垫上并完成注射操作，否则它们会因脱水而死亡。携带可遗传的染色体外阵列的F1代子代比例可能有所变化，典型范围为3–7%。注射混合物（1.1.3）中...

讨论

本文介绍了一种结合使用 C. elegans 研究淀粉样病变细胞与分子机制的综合方法。该方法的优势包括：1）成本低。C. elegans 可在室温下、以接种细菌的普通培养皿进行培养。2）强大的遗传学工具。可在数月内获得转基因动物，并拥有大量可用的启动子序列，以实现目标基因在特定神经元中的表达。3）结构简单且已被充分研究的神经系统。C. elegans 拥有极为简单的神经系统（共302个神经元），这种简洁性使其神经系统得到了深入表征，包括细胞谱系、每个神经元的特定功能/作用及其突触连接。然而，C. elegans 也存在局限性，包括细胞体积小，限制了免疫组织化学等常规生化技术的应用；以及具有较厚的外层结构（角质层），使神经元与外界环境隔离，因此药理学方法在 C. elegans 中可能效果有限。原代细胞培养是一种可部分缓解该问题的有效策略。

实验方案中的关键步骤包括使用大量线虫作为起始材料，并密切监测制备过程，以避免丢失卵和胚胎 等等掌握注射过程中如何正确操作动物也至关重要。...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1. NGM
氯化钠	Sigma-Aldrich	S5886	3 g
细菌用琼脂	AMRESCO	J637	17 g
蛋白胨	AMRESCO	J636	2.5 g
蒸馏水			加至 975 ml
经高压灭菌后，加入以下试剂并充分混匀
硫酸镁	Sigma-Aldrich	M2643	1 ml 的 1 M 储液
氯化钙	Sigma-Aldrich	C5670	1 ml 的 1 M 储液
胆固醇	Sigma-Aldrich	C3045	1 ml 的 5 mg/ml 储液（溶于乙醇）
磷酸钾缓冲液			25 ml 的 1 M 储液
2. 磷酸钾缓冲液
磷酸二氢钾	Sigma-Aldrich	P5655	108.3 g
磷酸氢二钾	Sigma-Aldrich	P3786	35.6 g
蒸馏水			加至 1 L
经高压灭菌
3. M9 缓冲液
磷酸二氢钾	Sigma-Aldrich	P5655	3 g
磷酸氢二钠	Sigma-Aldrich	S5136	6 g
氯化钠	Sigma-Aldrich	S5886	5 g
硫酸镁	Sigma-Aldrich	M2643	1 ml 的 1 M 储液
蒸馏水			加至 1 L
经高压灭菌
4. 卵缓冲液（pH 7.3，340 mOsm）
氯化钠	Sigma-Aldrich	S5886	118 mM
氯化钾	Sigma-Aldrich	P5405	48 mM
氯化钙	Sigma-Aldrich	C5670	2 mM
氯化镁	Sigma-Aldrich	M4880	2 mM
HEPES	Fisher Scientific	BP310	25 mM
蒸馏水			加至 1 L
经高压灭菌
5. CM-15
L-15 培养基	Gibco	11415	450 ml
胎牛血清	Gibco	10437-028	50 ml
青霉素	Gibco	15140	50 单位/ml
链霉素	Gibco	15140	50 g/ml
用蔗糖调节至 340 mOsm，然后经无菌滤器过滤至已高压灭菌的瓶中，4 °C 保存
6. 其他试剂
卤代烃 700 油	Halocarbon Products	9002-83-9
5 μm Acrodisc 注射器滤器	PALL Co.	4199
几丁质酶	Sigma-Aldrich	C6137-5UN
凝集素（花生）	Sigma-Aldrich	L0881-10MG
氢氧化钠	Fisher Scientific	S320
赖氨酸	Sigma-Aldrich	L5501
生物素	Sigma-Aldrich	B4639
次氯酸钠溶液	Sigma-Aldrich	425044
叠氮化钠	Sigma-Aldrich	71289
蔗糖	Sigma-Aldrich	S0389