一种用于淀粉样病变研究的 Caenorhabditis elegans 模式系统

摘要

我们介绍了在秀丽隐杆线虫（C. elegans）中研究淀粉样蛋白病相关特征的方法。我们展示了如何构建在神经元中表达人源Aβ₄₂的转基因线虫，以及如何通过行为学实验检测其功能。此外，我们还展示了如何获取可用于药理学测试的原代神经元培养物。

摘要

淀粉样病变是指随时间推移在组织中出现淀粉样蛋白β（Aβ）的异常合成与积聚。Aβ是阿尔茨海默病（AD）的标志性特征，也见于路易体痴呆、包涵体肌炎和脑淀粉样血管病。 ^1-4. 淀粉样变性疾病会随着时间推移而逐渐进展。因此，寿命较短的简单生物体可能有助于阐明这些疾病的分子机制。本文中，我们描述了利用线虫研究Aβ介导的神经退行性变的实验方案 秀丽隐杆线虫因此，我们通过注射编码人 Aβ 的 DNA 来构建转基因蠕虫₄₂ 转入成年雌雄同体的合胞体性腺中。通过诱变诱导的整合使转基因品系稳定. 线虫通过收集和接种其卵进行年龄同步。表达 Aβ 的神经元的功能₄₂ 在适当的动物行为学实验（趋化性实验）中进行检测。通过获取胚胎的原代神经元培养物来补充行为学数据，并用于检测抗凋亡化合物的神经保护作用。

引言

淀粉样蛋白β（Aβ）是一种由36-43个氨基酸组成的多肽，由淀粉样前体蛋白（APP）经β和γ分泌酶连续切割后生成¹。γ分泌酶作用于Aβ多肽的C端，决定了其长度的可变性⁵。最常见的Aβ形式为Aβ₄₀和Aβ₄₂，其中后者更常与阿尔茨海默病（AD）等病理状态相关⁵。在高浓度下，Aβ形成β片层结构，并聚集成为淀粉样纤维⁶。纤维沉积物是神经元周围老年斑的主要成分。目前认为，老年斑以及可溶性非斑块状Aβ寡聚体均是Aβ致病的核心形式。

神经性淀粉样病变的实验室研究因这类疾病具有随时间推移而进展的特点而变得复杂。因此，开发具有较短寿命、可进行遗传操作且作为小鼠补充的动物模型显得尤为重要。这些模型可用于阐明淀粉样病变的特定方面——通常是细胞和分子层面的机制——并因其结构简单，有助于揭示问题的本质。线虫 秀丽隐杆线虫 属于这一类别的生物具有较短的生命周期，约20天，且其基本的细胞过程（包括基因表达调控、蛋白质转运、神经元连接、突触形成、细胞信号传导以及细胞死亡）与哺乳动物相似。 ⁷蠕虫的独特特征包括强大的遗传学工具以及缺乏血管系统，这使得研究人员能够独立于血管损伤来研究神经元损伤。然而，其缺乏大脑的结构限制了该模型的使用 秀丽隐杆线虫 研究神经退行性变的多个方面。此外，无法在此生物体中重现和....

方案

1. 转基因线虫的构建

1. 转化。
   1. 制备显微注射垫。将一滴热的、溶于水的2%琼脂糖滴加到玻璃盖玻片上。迅速将另一张盖玻片覆盖在液滴上并轻轻按压。待琼脂糖凝固后，将两张盖玻片分开，并将盖玻片垫置于80 °C真空烘箱中过夜烘烤。
   2. 拉制移液毛细管。我们使用Sutter P-97拉制仪拉制外径/内径为1/0.5 mm、带丝的硼硅酸盐毛细管。移液管尖端封闭，在后续步骤中再将其打开。
   3. 配制注射混合液。配制含有目标DNA（每个构建体20 ng/μl）以及空质粒DNA的注射混合液，使总DNA浓度达到150 ng/μl。离心注射混合液以去除任何污染物。此步骤至关重要，因为污染物会降低转化效率。取上层5 μl液体（碎片和其他污染物沉淀在底部）转移至新离心管中用于注射。
   4. 通过毛细作用加载注射混合液。将移液管底部浸入注射混合液中。通常0.5 μl足以注射100条线虫。
   5. 安装注射移液管。将移液管插入显微操作仪的夹持器中，并通过将其尖端轻轻摩擦载玻片上固定盖玻片的边缘，或摩擦琼脂糖垫上的碎屑，将尖端打开。此步骤非常关键：尖端过大易损伤线虫，过小则容易堵塞。可通过观察尖端形状以及最重要的——液体流速来判断尖端质量。流速可通过在卤代烃700油滴中施加注射压力时，从浸没的开放尖端流出的气泡大小来评估。
   6. 将线虫转移至注射垫。在注射垫上滴加一滴700卤代烃油，并将数条线虫（初学者建议1–2条）转移至油滴中。使用线虫挑....

结果

通过我们的实验方案，我们研究了人源Aβ₄₂寡聚体对神经元功能的影响⁸。使用引物从构建体PCL12⁹中扩增出编码人源Aβ₄₂的片段以及Fire载体pPD50.52的人工信号肽编码序列，引物在两端引入了Sma I限制性内切酶位点。随后将该片段插入到pPD95.75 Fire载体中的一个构建体中，该构建体包含2,481 bp的flp-6启动子序列，插入位置位于唯一的Sma I位点之间¹⁰。利用方案1中描述的转化技术，我们构建了在ASE神经元中表达Aβ₄₂的转基因线虫（FDX(ses25)品系）⁸。为了标记阳性转化子，我们使用了P_gcy-5::GFP报告基因，该基因特异性驱动右侧ASE神经元（ASER）中的GFP表达¹¹。线虫会粘附在垫片上，因为干燥的琼脂糖会吸收其体内的水分。因此，必须迅速将线虫放置到注射垫上并完成注射操作，否则它们会因脱水而死亡。携带可遗传的染色体外阵列的F1子代比例可能有所变化，典型范围为3–.......

讨论

本文介绍了一种结合使用 C. elegans 研究淀粉样病变细胞与分子机制的综合方法。该方法的优势包括：1）成本低。C. elegans 可在室温下、以接种细菌的普通培养皿进行培养。2）强大的遗传学工具。可在数月内获得转基因动物，并拥有大量可用的启动子序列，以实现目标基因在特定神经元中的表达。3）结构简单且已被充分研究的神经系统。C. elegans 拥有极为简单的神经系统（共302个神经元），这种简洁性使其神经系统得到了深入表征，包括细胞谱系、每个神经元的特定功能/作用及其突触连接。然而，C. elegans 也存在局限性，包括细胞体积小，限制了免疫组织化学等常规生化技术的应用；以及具有较厚的外层结构（角质层），使神经元与外界环境隔离，因此药理学方法在 C. elegans 中可能效果有限。原代细胞培养是一种可部分缓解该问题的有效策略。

实验方案中的关键步骤包括使用大量线虫作为起始材料，并密切监测制备过程，以避免丢失卵和胚胎 等等掌握注射过程中如何正确操作动物也至关重要。.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1. NGM
氯化钠	Sigma-Aldrich	S5886	3 g
细菌用琼脂	AMRESCO	J637	17 g
蛋白胨	AMRESCO	J636	2.5 g
蒸馏水			加至 975 ml
经高压灭菌后，加入以下试剂并充分混匀
硫酸镁	Sigma-Aldrich	M2643	1 ml 的 1 M 储液
氯化钙	Sigma-Aldrich	C5670	1 ml 的 1 M 储液
胆固醇	Sigma-Aldrich	C3045	1 ml 的 5 mg/ml 储液（溶于乙醇）
磷酸钾缓冲液			25 ml 的 1 M 储液
2. 磷酸钾缓冲液
磷酸二氢钾	Sigma-Aldrich	P5655	108.3 g
磷酸氢二钾	Sigma-Aldrich	P3786	35.6 g
蒸馏水			加至 1 L
经高压灭菌
3. M9 缓冲液
磷酸二氢钾	Sigma-Aldrich	P5655	3 g
磷酸氢二钠	Sigma-Aldrich	S5136	6 g
氯化钠	Sigma-Aldrich	S5886	5 g
硫酸镁	Sigma-Aldrich	M2643	1 ml 的 1 M 储液
蒸馏水			加至 1 L
经高压灭菌
4. 卵缓冲液（pH 7.3，340 mOsm）
氯化钠	Sigma-Aldrich	S5886	118 mM
氯化钾	Sigma-Aldrich	P5405	48 mM
氯化钙	Sigma-Aldrich	C5670	2 mM
氯化镁	Sigma-Aldrich	M4880	2 mM
HEPES	Fisher Scientific	BP310	25 mM
蒸馏水			加至 1 L
经高压灭菌
5. CM-15
L-15 培养基	Gibco	11415	450 ml
胎牛血清	Gibco	10437-028	50 ml
青霉素	Gibco	15140	50 单位/ml
链霉素	Gibco	15140	50 g/ml
用蔗糖调节至 340 mOsm，然后经无菌滤器过滤至已高压灭菌的瓶中，4 °C 保存
6. 其他试剂
卤代烃 700 油	Halocarbon Products	9002-83-9
5 μm Acrodisc 注射器滤器	PALL Co.	4199
几丁质酶	Sigma-Aldrich	C6137-5UN
凝集素（花生）	Sigma-Aldrich	L0881-10MG
氢氧化钠	Fisher Scientific	S320
赖氨酸	Sigma-Aldrich	L5501
生物素	Sigma-Aldrich	B4639
次氯酸钠溶液	Sigma-Aldrich	425044
叠氮化钠	Sigma-Aldrich	71289
蔗糖	Sigma-Aldrich	S0389