我们描述了一种利用斑马鱼幼鱼进行糖皮质激素应激激素信号通路化学筛选的实验流程与数据分析方法：即体内糖皮质激素响应性斑马鱼荧光素酶活性检测（Glucocorticoid Responsive In vivo Zebrafish Luciferase activitY，GRIZLY）实验。该检测方法能够灵敏且特异地识别需要代谢活化或影响内源性糖皮质激素生成的化合物对糖皮质激素信号通路的作用。
本文内容
摘要
摘要
糖皮质激素类应激激素及其人工衍生物是广泛用于治疗炎症的药物，但长期使用糖皮质激素可能导致严重副作用。需要建立检测系统以筛选影响糖皮质激素信号通路的新化合物 体内 或用于确定化合物对糖皮质激素信号通路的不良影响。我们建立了一种转基因斑马鱼检测方法，可用来检测糖皮质激素信号通路活性 体内 并且实时地，GRIZLY 检测法（Glucocorticoid Responsive 体内 斑马鱼荧光素酶活性。基于荧光素酶的检测方法可高灵敏度、高特异性地检测对糖皮质激素信号通路的影响，包括需要代谢活化或影响内源性糖皮质激素生成的化合物的作用。本文提供了利用该检测方法进行化合物筛选的详细实验方案，描述了数据采集、归一化处理及数据分析过程，重点强调质量控制与数据可视化。该检测方法操作简便，具有时间分辨性和定量读出功能。既可作为独立平台运行，也可轻松整合至高通量筛选工作流程中。此外，该方法还可广泛应用于化合物筛选之外的多种研究领域，如环境内分泌干扰物监测或应激反应研究。
引言
糖皮质激素（GCs）是由肾上腺分泌的类固醇激素，在应激反应和代谢调控中发挥重要作用1。GCs 可结合细胞质中的糖皮质激素受体（GRs），该受体属于核受体超家族；受体结合后会转位至细胞核内2。在细胞核中，GCs 可通过干扰其他转录因子来抑制转录（反式抑制），或通过糖皮质激素反应元件（GREs）激活基因转录（反式激活）。由于具有抗炎特性，天然和人工合成的 GCs 均被广泛用于治疗多种疾病，如哮喘或关节炎3。然而，长期使用 GCs 可能导致严重的副作用，包括糖尿病和青光眼4。因此，人们迫切寻求能够靶向 GC 信号通路、且可能具有更优治疗效果和耐受性的新型化合物。值得注意的是，在培养细胞中观察到的配体效应可能与体内（in vivo）情况不同5。此类差异可能导致基于传统细胞培养的药物筛选实验结果出现偏差。近年来，利用斑马鱼模型开展的体内（in vivo）化学筛选受到关注，因其能够检测到细胞培养中无法发现的生物学效应6,7。
激素信号通路也可能受到环境污染物的影响。所谓内分泌干扰物（EDCs）可影响多种由激素调控的生理过程8因此，具有类雌激素活性的物质可以调节水生生物的繁殖和性别分化。近年来，人们日益关注环境中的内分泌干扰物（EDCs）可能与代谢紊乱相关的问题。9一种被此类方法靶向的途径 "代谢紊乱" 是糖皮质激素通路，该通路也与外源性物质对发育和免疫功能的影响有关10,11然而，与大量关于干扰性类固醇激素作用的化合物信息相比，通过糖皮质激素受体（GR）介导的内分泌干扰效应的相关研究仍较为有限。因此，亟需开发能够监测污染物对糖皮质激素（GC）信号通路影响的工具。 体内.
斑马鱼长期以来一直是发育生物学中广受欢迎的模式生物，近年来也吸引了内分泌学等领域研究人员的关注12。与其他硬骨鱼类相比，斑马鱼的糖皮质激素（GC）信号系统更类似于哺乳动物，因为斑马鱼基因组中仅含有一个糖皮质激素受体（GR）基因，而许多其他鱼类物种则具有重复的受体基因13-15。此外，下丘脑-垂体-肾上腺轴在5日龄的斑马鱼幼鱼中已具备功能，能够响应应激源而增加内源性GC的产生14,16-18。
我们最近构建了一种转基因斑马鱼品系 GRE:Luc，可用于监测糖皮质激素受体信号通路的活性 体内 实时地18。该细胞系携带一个由最小TATA框启动子和四个串联重复的GRE（糖皮质激素反应元件）调控的荧光素酶报告基因构建体图1a可从96孔微孔板中的单个GRE:Luc幼虫测量GC诱导的生物发光 体内 长时间。该 GRIZLY 检测法（用于 "糖皮质激素应答 体内 斑马鱼荧光素酶活性") 可应用于多个不同的研究领域，例如应激研究、环境监测和药理学筛选18我们能够检测单个幼体在渗透压应激后内源性皮质醇水平的升高，并追踪该反应在发育过程中的成熟变化。此外，我们还可监测需经幼体代谢才能发挥效应的有机锡化合物对糖皮质激素（GC）信号通路的影响。重要的是，该品系能够在环境相关浓度下检测到这些效应。最后，在一次初步筛选中，GRIZLY检测法从化合物库中灵敏且特异地识别出具有GC活性的化学物质，其中包括一种可刺激幼体内源性皮质醇生成的化合物。本文中，我们描述了使用GRIZLY检测法进行化学筛选的详细实验方案。
方案
1. 准备化合物文库的工作稀释液
预稀释待测药物文库中的化合物（例如 FDA 批准的药物，ENZO Life Science）加入 E3（5 mM NaCl，0.17 mM KCl，0.33 mM CaCl2）与一台自动化液体处理工作站（例如 Multiprobe II，8根针头配一次性尖端适配器，PerkinElmer）。合适的浓度为 例如 40 μg/ml，溶于3% DMSO中，但具体浓度取决于所用文库的类型。下述步骤对应的Multiprobe II设置如下所示 表1表格中描述的方案可同时制备四块分装板。
- 用移液器将10 μl储备文库（2 mg/ml，溶于DMSO）分装至深孔板中（例如 96孔储存板，圆底孔，0.8 ml，ABgene）。第1列和第12列应保持空置——用于加入板内阳性和阴性对照。
- 使用Multiprobe II将490 μl含1% DMSO的E3加入准备好的文库分装管中。稀释过程使用固定针头，无需丢弃吸头。
- 向第1列加入10 μl DMSO，向第12列加入10 μl溶于DMSO的5 mM地塞米松溶液，作为板内对照。此时所有孔中DMSO的终浓度为3%，阳性对照孔中地塞米松的终浓度为100 μM（溶于E3/3% DMSO）。
- 使用耐DMSO的粘性封板膜密封板孔，将板置于-80 °C保存，直至使用。
2. 报告基因鱼的繁育
从GRE:Luc转基因鱼的群体交配自然产卵中收集胚胎。将胚胎（不超过60枚）置于含有E3培养基的9 cm培养皿中，E3培养基中添加1 mg/ml抗真菌剂亚甲蓝，在28 °C培养箱中培养至受精后4天（dpf）。定期更换E3培养基。
3. 荧光素酶培养基（E3L）的制备
通过向含有荧光素粉末的小瓶中加入去离子水（dH2O），配制50 mM的荧光素水溶液储备液。该储备液可在-80 °C下保存数月。将荧光素储备液用E3培养基稀释至终浓度为0.5 mM，得到E3L培养基。
4. 将幼虫分配至96孔板
- 通过切掉移液器吸头尖端约5 mm，并短暂灼烧锋利边缘，制备具有宽孔的1 ml移液器吸头。
- 将多个杂交组合的幼虫小心地从培养皿倒入烧杯中进行汇集。每次轻轻将幼虫倒入筛网（孔径0.25 mm）上收集约50只幼虫，并立即将筛网放入盛有E3L培养基的小型培养皿（直径5.5 cm）中。
- 使用宽孔移液器吸头，将含有单个幼虫的225 μl培养基分别转移至白色96孔板（OptiPlate, PerkinElmer）的各孔中。
- 用粘性封板膜（例如 TopSeal-A, PerkinElmer）密封板孔，并在28 °C下过夜孵育。此预孵育步骤可避免在加入荧光素后立即记录到生物发光的瞬时变化，该现象在培养细胞中也会发生19。
5. 药物处理
- 从-80 °C冰箱中取出含有文库工作稀释液的板，置于室温约4小时后使用。轻轻涡旋振荡板，然后在离心机中短暂离心，使液体沉降至板孔底部。
- 从幼虫培养板上移除粘性密封膜。
- 使用手动96通道移液装置（例如 使用多通道移液器（Liquidator，Steinbrenner）将药物溶液上下吹打混匀3次，然后取25 μl化学文库的工作稀释液加入含有幼鱼的孔中（以上述示例为例，最终浓度为4 μg/ml，溶于含0.3% DMSO的E3溶液中）。每块文库板需制备10块子板（最少5块），每板均含幼鱼。
- 用粘性封板膜密封板孔，并用条形码标签标记每块板。
6. 发光记录
- 将含有幼虫的培养板放入具有增强型发光灵敏度的 EnVision 发光检测仪（PerkinElmer）的堆叠单元中。或者，可使用机器人化孵育系统，例如用于哺乳动物细胞培养筛选系统的自动化孵育设备，并与检测仪联用。
- 使用与 EnVision 检测仪 表2 中所述相似的仪器设置，连续记录两天的生物发光信号。根据运行中所用培养板的数量，调整实验重复次数，以匹配所需的运行时间。
- 运行结束后，检查培养板中是否存在死亡幼虫，以评估化合物的总体毒性。
7. 数据分析
所有数据分析均使用自定义脚本在统计编程环境 R 中进行。
- AUC 计算
为了鉴定能够激活GC信号通路的化合物，无论其动力学特性如何，均以记录的发光轨迹（生物发光原始计数 vs. 时间）曲线下面积（AUC）作为筛选参数。AUC采用梯形法则进行估算（参见 图2a 和 a'). - 归一化
对AUC值进行对数转换，以确保数据具有更高的正态性（图2b 和 b'）。然后使用稳健方法对每个文库板的对数转换后的AUC值进行归一化 Z-评分法（参见 20）。这种归一化处理得到的数值表示各数据点与所有数据点中位数之间的标准差倍数。通过该方法，可消除数据中的系统误差，例如不同运行批次间的变异。此后，可通过绘制稳健均值来可视化数据 Z每个孔的重复样本得分（图2c 和 c'). - 质量指标
- 热图
为了可视化与酶标板相关的效应，使用热图绘制每块板的数据 例如 的 heatmap.2 gplot 包的功能21通过这种方式，可轻松检测边缘效应或化合物残留（例如 比较 图3a 与 3b）。将不符合标准的平板排除在后续分析之外。 - ROC曲线
为确定该检测方法的灵敏度和特异性，需绘制受试者工作特征（ROC）曲线 例如 借助 ROC bioconductor 软件包22 使用7.2中确定的Z分数值（图3c随后，计算该曲线下面积（AUC）。AUC值接近1表明该检测具有高灵敏度和特异性。
- 热图
- 命中识别
为优化活性化合物识别的截断值，确定约登指数。为计算该指数，从受试者工作特征（ROC）曲线中不断上升的假阳性率（FPR）中减去估计的真阳性率（TPR） Z-评分截断值。采用稳健的 Z以最高约登指数（真阳性率减去假阳性率）对应的得分为截断点。真阳性率/假阳性率可通过检测阳性对照孔或文库中已知活性化合物来估算。使用阳性对照孔时，需确保其强度与预期命中化合物的活性水平相匹配。
8. 重新检测
- 使用不同供应商提供的化合物，通过系列稀释法处理幼虫，并采用上述相同的记录装置重新评估呈阳性的化合物。真正的阳性化合物在此检测中也应能诱导发光，且理想情况下呈剂量依赖性。
结果
在之前的一项研究中18我们对一个包含640种经美国食品药品监督管理局（FDA）批准药物的小分子库进行了初步筛选，以评估GRIZLY检测方法的性能。该药物库包含12种 真正 GCs，从而使得我们能够确定该检测方法的敏感性和特异性等质量指标。
图2展示了来自本实验的原始数据分析与归一化的典型示例。图2a描绘了地塞米松对照孔的典型结果，说明了数据提供的时间信息。处理后约12小时出现的生物发光峰值，在随后36小时的测量期间缓慢下降。图2a'重点展示了使用梯形法估算曲线下面积（AUC）值的过程。该计算对所有孔及每个技术重复均进行。图2b和b'显示了对数转换的结果。此处，阳性对照的均值被绘制在正态Q-Q图中。对数转换使数据点更接近由红色对角线表示的理论正态分布值。实现数据正态分布的转换可提高后续分析的统计效能。最后，图2c和2c'展示了稳健Z-分数归一化对板间变异的影响：图2c中不同板获得的不同基线值，在图2c'的稳健Z-分数图中得到归一化。
稳健的 Z-score 值可用于通过可视化各孔板中阳性结果的分布来识别数据中的系统性误差。图3a 展示了一个文库孔板热图的示例，其中稳健的 Z-score 值以颜色编码的形式对应绘制在孔位上。可以明显识别出第12列为板内阳性对照。文库中呈阳性评分的化合物出现在F8孔，以及较弱的E2孔。图3b 展示了一块存在系统性误差的孔板。可以观察到在多列中A行和E行出现一系列 Z-score 值递减的化合物。这些孔中的化合物在复测中均未呈现阳性结果。由于呈现这种递减型GRIZLY检测活性的孔位恰好位于移液机器人在分装文库孔板时的移液路径上，因此该模式提示在自动化移液过程中发生了阳性化合物的交叉污染（携带效应）。
稳健的 Z-分数标准化，结合文库中已知糖皮质激素（GCs）的存在，使我们能够为该筛选实验计算受试者工作特征（ROC）曲线18。图3c展示了在不同稳健 Z-分数阈值下，估计的真阳性率与估计的假阳性率的关系图。估计的真阳性率定义为在给定的稳健 Z-分数阈值下被识别出的真阳性命中化合物（此处指文库中存在的已知糖皮质激素）所占的百分比。相应的估计假阳性率则表示在此阈值下被错误命中的非阳性化合物所占的百分比。该曲线的曲线下面积（AUC）为0.95，表明该筛选具有高灵敏度和特异性，且检测性能优异。此外，还利用AUC曲线通过计算不同稳健 Z-分数下的约登指数（Youden index）来估算命中识别的最佳阈值。我们发现稳健 Z-分数1.49对应的约登指数最高。该阈值在图2c'中以一条黑色直线标出，用于将命中化合物与大部分非命中化合物区分开来。
在我们的筛选中18，我们能够鉴定出文库中存在的几乎所有已知GC。12个中的仅3个 真正 未检测到糖皮质激素（GCs）。对于醋酸美伦孕酮，该结果为假阴性，因为该化合物在更高浓度下的复测中呈阳性，而初筛时库中所用浓度较低。其余两种GCs在复测中仍为阴性。皮质酮是啮齿类动物主要的糖皮质激素，但在鱼类和人类中并非主要糖皮质激素。1，而前体药物泼尼松可能无法被幼体系统有效代谢。有趣的是，筛选中还发现了两种未被注释为糖皮质激素的药物，其中一种在复测中未能得到验证（螺内酯，一种盐皮质激素受体拮抗剂）。另一种化合物孕烯醇酮是类固醇生物合成的前体物质，可由肾上腺转化为皮质醇。事实上，用孕烯醇酮处理可刺激幼体产生皮质醇18所有这些结果均证实了该检测方法的高效性：初筛结果中仅出现一个假阴性和一个假阳性化合物，且在11个经确认具有GC信号激活活性的化合物中，有10个已在初筛中被识别。
图1. 检测的总体原理及筛选流程的工作流程。 a) GRIZLY检测报告基因构建体的示意图。荧光素酶（黄色）的表达由一个最小启动子（Pmin，橙色）和四个串联重复的糖皮质激素反应元件（(GRE)4，白色）控制，后者可被配体激活的GR同源二聚体（GR，蓝色）结合。红色方框表示Tol2转座酶识别位点，有助于将构建体整合到基因组中。粉色方框代表多聚腺苷酸化位点（pA）。携带该构建体的转基因幼鱼被置于不透光的96孔微孔板中进行生物发光检测。b) 荧光素酶反应示意图。荧光素酶催化荧光素氧化为氧荧光素，从而产生光发射（hν）。该反应还需要ATP和Mg2+，由幼鱼体内提供。PPi为焦磷酸盐。c) 筛选工作流程。从FDA批准的药物库中在96孔板中制备工作浓度稀释液，其中一列包含板内阴性对照（仅DMSO，绿色），另一列包含阳性对照（地塞米松，红色）（文库设计）。将GRE:Luc转基因幼鱼分配至96孔板中（每组5–11个重复），并用文库中的化合物处理（药物施加）。使用生物发光检测仪连续两天记录生物发光信号轨迹（数据收集）。对生物发光轨迹进行积分（AUC计算），进行对数转换，并采用稳健的Z-score方法进行标准化（标准化处理）。标准化后的数据用于评估质量指标及筛选阳性结果（数据分析）。选出的阳性化合物将在检测中进一步验证其剂量依赖性活性（复测）。 点击此处查看高清大图。
图2. 利用FDA批准药物库筛选数据进行数据分析示例。a) 阳性对照孔的代表性曲线图。 a') 曲线下面积（AUC）采用梯形法则进行估算。用于计算的梯形以不同深浅的红色显示。 b) 阳性对照孔原始AUC值（y轴）与标准正态总体（x轴）在对数转换前的正态Q-Q图。 b') AUC值经对数转换后的正态Q-Q图。对数转换后数据点的线性分布表明数据符合正态分布。 c) 所有在筛选中测试的化合物的对数转换原始数据图。蓝色， 真正 糖皮质激素；灰色，其他所有化合物。 c') 稳健法处理后的屏幕数据图 Z-分值归一化。数据中已去除诸如板间差异等系统性误差。红线表示板内阳性对照的均值 ± 标准误。黑线：通过Youden指数优化确定的阳性筛选阈值（图3）。经许可转载自14，2012年美国化学学会。 单击此处查看大图.
图3. 筛选结果。a) 筛选结果的热图。文库化合物的稳健 Z-得分值被绘制在相应的孔位上。第12列的阳性对照以及F8和E2孔中的两个阳性命中化合物清晰可见。b) 一块微孔板的热图，显示在使用移液机器人进行文库制备过程中阳性化合物的携带污染。沿机器人移液路径可见活性梯度。c) 筛选实验的受试者工作特征（ROC）曲线。随着稳健 Z-得分截断值（颜色编码，右侧y轴）的增加，绘制出估计的真阳性率（左侧y轴）和假阳性率（x轴）。所得曲线的AUC值接近1，表明检测性能良好。经许可转载自14，2012 ACS。d) 表格显示在初筛（prim.）或复筛中具有活性（黄色）或无活性（蓝色）的化合物。Bona fide 糖皮质激素并非总是被复筛（白色）。经许可重绘自14，2012 ACS。 点击此处查看高清大图。
| 常规设置： | |||
| 步骤 1.1 | |||
| 操作 | 类型： | 单一液体 | |
| 模式： | 吹出 | ||
| 每次吸液的分配次数： | 1 | ||
| 优化速度： | 是 | ||
| 系统气隙： | 10 μl | ||
| 传输体积： | 0 | ||
| 冲洗/清洗 | 否 | ||
| 吸液 | 设置类型 | 数值 | 备注 |
| 位置 | B7, B10, B13, B16 | ||
| 吸液体积 | 10 μl | ||
| 速度 | 200 μl/sec | ||
| 液体追踪 | 60% | ||
| 吸液高度 | 耗材默认值 | 22.28 | |
| 分配 | 设置类型 | 数值 | 备注 |
| 位置 | D7, D10, D13, D16 | ||
| 分配体积 | 10 μl | ||
| 速度 | 200 μl/sec | ||
| 液体追踪 | 100 μl | ||
| 分配高度 | 耗材默认值 | 17.01 | |
| 步骤 1.2 | |||
| 操作 | 类型： | 试剂 | |
| 模式： | 废液 | ||
| 每次吸液的分配次数： | 3 | ||
| 优化速度： | 是 | ||
| 系统气隙： | 15 μl | ||
| 传输体积： | 0 | ||
| 冲洗/清洗 | 否 | ||
| 吸液 | 设置类型 | 数值 | 备注 |
| 位置 | A4 | ||
| 吸液体积 | 3 × 490 μl | ||
| 气隙 | 15 和 0 | ||
| 速度 | 200 μl/sec | ||
| 液体追踪 | 400% | ||
| 吸液高度 | 液面 | ||
| 分配 | 设置类型 | 数值 | 备注 |
| 位置 | D7, D10, D13, D16 | ||
| 分配体积 | 490 μl | ||
| 气隙 | 15 和 0 | ||
| 速度 | 200 μl/sec | ||
| 液体追踪 | 100% | ||
| 分配高度 | 耗材默认值 | 17.01 | |
表1. 多探针II的设置参数 本方案中的步骤 表1 描述了4块板（每块96孔）的制备过程。这些板位于工作区的板适配器上，位置由机器人指定。例如 B7、B10、B13、B16
| 常规设置： | |||
| 检测重复次数 | 取决于运行时间的长短 | ||
| 酶标板数量 | 无限制 | ||
| 温度控制 | 28 °C | ||
| 实验方案 | 计算方法 | ||
| US Lum 96（cps）读数 | |||
| 测量时间 | 2.5 sec | 串扰校正 | |
| 酶标板与检测器之间的距离 | 0 mm | ||
| 发光（CT2）校正因子 | 0 % | ||
表2. 用于筛选的EnVision设置。
讨论
我们在此介绍用于检测GC活性的化学筛选实验流程及数据分析方法 体内 使用 GRIZLY 检测法18该检测具有与传统基于细胞的筛选相当的质量控制特性和性能指标，这一优势使其在高通量环境中应用尤为重要。此外，然而 体内 该检测方法还可检测那些无法被常规方法获取的化合物 体外 筛选。这一点在筛选结果中出现前体激素孕烯醇酮即为明证。因此，GRIZLY检测法拓展了以鸟苷酸环化酶（GC）信号通路活性为目标的筛选范围。
检测的重要性 体内 通过使用有机锡污染物DBT和TBT在本实验中获得的结果也证明了该检测方法的效果18DBT 能够抑制哺乳动物细胞培养中的糖皮质激素（GC）信号通路，而 TBT 则不能；我们在表达 GRE:Luc 报告基因的斑马鱼细胞培养中也观察到了相同现象。然而，在 GRIZLY 检测中，TBT 显示出对 GC 信号通路的抑制活性，这是因为 TBT 可通过幼体代谢转化为 DBT。该抑制效应在环境相关浓度的 TBT 下即已出现。这些结果进一步说明了 GRIZLY 检测在检测化合物效应方面的潜力，这些效应依赖于活体动物中的器官间相互作用以及化合物的代谢转化。同时也凸显了 GRIZLY 检测在环境监测中的应用前景。因此，可在受体信号传导水平上研究内分泌干扰物的作用，即干扰物对由地塞米松等 GR 激动剂诱导的 GC 信号活性的干扰作用。另一种研究方向是考察化合物对孕烯醇酮刺激的 GC 合成的影响。该检测具备高通量特性，可用于对环境样本库进行快速筛选。
利用荧光素酶作为报告基因，可实现对信号转导活性的高动态范围检测23。事实上，该检测方法的高灵敏度使我们能够检测到单条幼虫中由渗透压应激诱导产生的环鸟苷酸（GC）18。借助荧光素酶报告系统实现的高时间分辨率，可对信号活动进行实时追踪，从而能够进一步分析数据的动力学特征。
对于某些应用而言，该报告系统在空间监测方面的适用性有限可能是一个潜在的缺点。对于需要监测幼虫特定区域的实验，荧光报告系统可能更为合适。然而，此类实验可能因激发光引起背景效应而导致灵敏度较低，这也限制了对荧光化合物的检测。此外，由于荧光蛋白通常具有更高的稳定性，此类系统在动力学分辨率方面可能较差23。 Furthermore，它们在成像设备、数据分析和数据存储方面也存在挑战，可能限制其在规模较小的研究实验室中的应用。
GRIZLY 检测采用微量滴定板形式进行，便于整合到常规筛选工作流程中。由于操作简便且数据分析容易，该检测也适用于规模较小的研究实验室。同时，该方法可实现较高程度的自动化， 例如 通过移液机器人自动给药或通过胚胎分选装置自动分配胚胎24,25简单的读数方法无需使用自动筛选显微镜或复杂的图像分析软件，即可提供关于所研究信号通路的时间动态和定量特征的丰富数据。
总之，我们提供了一种逐步操作方案，用于一种相对低成本、稳定且易于操作的GC信号活性化学筛选检测方法 体内 并可实时进行。该检测方法可用于确定 体内 在基于细胞培养的检测中无法观察到化合物对GC信号通路的影响。该检测方法的应用领域众多，包括 例如 糖皮质激素信号通路中遗传效应的确定、环境内分泌干扰物对糖皮质激素合成及信号活性影响的监测，以及化合物对糖皮质激素信号通路非预期效应的筛选或新型效应的发现 体内 该重要信号通路的调节因子。
披露
我们没有需要披露的内容。
致谢
感谢 S. Burkhart、C. Hofmann 和 Simone Gräßle 提供出色的技术支持，感谢 M. Ferg 在数据分析方面的帮助。同时感谢 S. Rastegar 对手稿提出的宝贵意见。本研究得到德国人民学术基金会（Studienstiftung des deutschen Volkes，资助号：MW）、德国研究基金会（DFG，项目号：DI913/4-1）以及卡尔斯鲁厄理工学院（KIT）生物界面项目（Helmholtz Program BioInterfaces）的经费支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 缓冲液组成与试剂 | |||
| 二甲基亚砜（DMSO） | Carl Roth GmbH & Co KG | A994.2 | |
| 经FDA批准的药物文库 | Enzo Life Sciences | BML-2841-0100 | |
| 荧光素 | Biosynth | L-8220 | |
| 地塞米松 | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| 亚甲蓝 | Sigma-Aldrich | M9140 | |
| E3 | N/A | N/A | 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2 |
| 仪器 | |||
| Multiprobe II | PerkinElmer | 8通道，配备一次性吸头适配器 | |
| Liquidator 96 | Steinbrenner Laborsysteme | 手动操作96通道移液器 | |
| EnVision XCite 多功能酶标仪 | PerkinElmer | 配备堆叠器自动化系统、温度控制、条形码读取器和增强型发光检测器 | |
| 塑料耗材 | |||
| 96孔储存板 | ABgene | AB-0765 | 圆底孔，0.8 ml |
| 封板膜 | ratiolab | 6018412 | 自粘式，耐DMSO |
| 移液吸头 | Steinbrenner Laborsysteme | LRF-200L | 用于Liquidator 96，200 μl，低吸附 |
| TopSeal-A | PerkinElmer | 6005185 | |
| OptiPlate-96 | PerkinElmer | 6005299 | 白色不透明96孔微孔板 |
| 条形码标签 | PerkinElmer | 1608182 | |
| 带滤芯的聚丙烯IsoTip移液吸头 | Corning | S058.4809 | |
| 实验动物 | |||
| GRE:Luc 鱼 | N/A | ZDB-TGCONSTRCT-120920-1 | 可从德国卡尔斯鲁厄欧洲斑马鱼资源中心（EZRC）获取 |
参考文献
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