一种表征视觉缺陷的激光诱导小鼠慢性眼压升高模型

摘要

采用激光光凝法对小鼠眼睛的房水引流系统进行处理，以诱导慢性高眼压。激光处理后，眼内压（IOP）可升高并持续数月。通过视觉运动反应测试监测实验动物的视力和对比敏感度下降情况。

摘要

青光眼常与眼内压（IOP）升高相关，是导致失明的主要原因之一。我们旨在建立一种眼压升高小鼠模型，以模拟人类高眼压性青光眼。在此模型中，通过激光照射角膜缘，使房水流出通路发生光凝，从而诱导房角关闭。激光处理前后，使用回弹式眼压计监测IOP的变化。采用视觉运动反应行为学实验评估相应视觉功能的改变。文中展示了一只激光照射后出现持续性眼压升高的小鼠的代表性结果。该眼高压小鼠表现出视力和对比敏感度下降。综上所述，本研究建立了一个有价值的模型系统，可用于研究青光眼小鼠中神经元变性及其潜在的分子机制。

方案

实验步骤

C57BL/6J 小鼠（Jackson Laboratory，缅因州巴港）在西北大学动物护理中心饲养。所有动物的使用均遵循西北大学机构动物护理和使用委员会批准的方案，并符合美国国立卫生研究院（NIH）《神经科学研究中动物使用指南》的规定。

1. 激光光凝术

激光光凝术的操作步骤是在先前已发表的方案基础上修改而成^5-7。

1. 通过腹腔注射氯胺酮（100 mg/kg，Butler Schein Animal Health，OH）和赛拉嗪（10 mg/kg，Lloyd Inc. of Iowa，Shenandoah，IA）对一只40至60日龄的小鼠进行麻醉。
2. 通过在实验动物右眼局部滴加一至两滴1%硫酸阿托品溶液（Alcon Labs, Inc.，Fort Worth，TX）以扩大瞳孔。
3. 散瞳后，压平前房以增强激光诱导效果⁶。在裂隙灯（SL-3E，Topcon，Oakland，NJ）下将带有锐利尖端的玻璃微移液管（World Precision Instruments Inc，Sarasota，FL）插入前房空间，排出前房内的液体。
4. 将小鼠固定于塑料锥形固定器（Braintree Sci Inc.，MA）中，并绑在自制平台上（见图1A）。用手握住固定器，使小鼠右眼朝向裂隙灯后方的光源。将麻醉后小鼠的右眼在裂隙灯下对准定位。
5. 双手持住小鼠固定器的同时，使用氩离子激光器（Ultima 2000SE，Coherent，Santa Clara，CA）对角膜缘进行激光照射。在小梁网周围垂直方向施加约80–100个激光点（514 nm，100 mW，50 msec脉冲，200 μm光斑）。C57BL/6小鼠具有色素性虹膜，可作为潜在散射能量的屏障⁷。
6. 在眼球表面局部滴加0.5%莫西沙星（Alcon Labs, Inc.，Fort Worth，TX）以消毒激光处理区域，并滴加0.5%丙帕卡因（Bausch & Lomb，Rochester，NY）以缓解疼痛。
7. 将动物置于加热垫（Sunbeam Products Inc，Boca Raton，FL）上约一小时，直至其完全苏醒。
8. 左眼不做处理，作为对照。

2. 眼内压测量

1. 将清醒的小鼠放入管中，装入塑料锥形固定器，然后将其固定在平台上（见图2A）。
2. 让小鼠适应固定器位置5至10分钟。将回弹式眼压计（TonoLab，Colonial Medical Supply，Franconia，NH）移近小鼠眼睛，直至探针尖端距离角膜表面2-3 mm¹⁴。
3. 按下测量按钮，使探针尖端轻柔地接触角膜中心表面。对同一只眼睛连续进行三组各六次的眼压（IOP）测量，取平均值作为该眼的眼压值。未处理的对照眼始终先测量，以获得后续激光处理眼测量时的基线读数。

3. 视动反应测试

视敏度和对比敏感度通过^14,15方法进行检测。通过反转漂移光栅的方向，分别检测小鼠的两只眼睛；即，使用顺时针漂移的光栅评估左眼的视觉功能，使用逆时针漂移的光栅评估右眼的视觉功能¹⁶。每次测试约需15分钟，并由两名观察者独立重复进行。

1. 将小鼠放置于一个由四台计算机显示器环绕的高架平台上，允许小鼠在平台上自由活动（图3A-B).
2. 将显示器设置为呈现水平移动的正弦光栅作为视觉刺激，其平均亮度为39 cd/m²。²光栅的移动方向应交替变化 顺时针和逆时针依次交替。
3. 分析动物的运动。在视觉刺激开启并逐渐增强后的15秒内，若动物的运动与漂移光栅同步，则视为“阳性”反应。能够引发最强反应的视觉刺激即定义为该动物的视敏度。 ¹⁷.
4. 在三个预设的空间频率（0.075、0.16 和 0.3 周/度，cpd）下检测对比度敏感度。每只眼的对比度阈值定义为在预设频率下引发视觉反应的最低对比度。对比度敏感度为阈值的倒数。 ¹⁷.

结果

如实验步骤所述，激光照射的目标是角膜缘区域的巩膜静脉窦，以光凝阻塞房水流出通道，从而诱导房角关闭（图1）。大多数接受激光处理的眼睛未出现明显物理损伤、色素脱落或感染，这与既往研究结果一致⁶。当少数小鼠（少于所有激光处理动物的5%）出现严重损伤的体征，如眼球塌陷、严重白内障、明显色素脱落或出血时，我们立即实施了安乐死。约30%的激光处理眼睛出现了轻微角膜瘢痕，但大多数在激光治疗后1至2周内自行恢复。

在一百余只小鼠中，我们发现几乎所有经激光处理的眼睛均出现眼内压升高。实验动物的眼内压通过回弹式眼压计进行监测（图2）。图2B展示了一例激光处理前后眼内压变化的示例。在激光处理前，小鼠双眼的眼内压基线无显著差异：右眼为15.7 mmHg，左眼为14.7 mmHg（第0天，图2B）。激光处理7天后，经处理眼（右眼）的眼内压几乎升高至原来的2倍，达到30.7 mmHg，而未处理眼为15.7 mmHg。激光处理眼的眼内压在约4个月内持续维持...

讨论

我们此前报道过，通过激光照射可在小鼠眼睛中诱导持续性的眼内压升高。与需要较高显微外科技术的生理盐水注射模型¹⁸和静脉烧灼模型¹¹相比，激光照射方法相对简单且易于操作。通常我们可在2至3小时内完成4到6只小鼠的激光照射。实现持续性眼内压升高的关键步骤包括激光照射前的前房压平以及激光照射参数的设置。排出前房内的液体有助于将激光精准靶向至小梁网区域，并尽量减少对邻近睫状体和血管的损伤⁶。已有不同类型的激光被报道使用；例如，一些研究采用波长为532 nm的半导体激光^5,6，而另一些研究则采用810 nm的能量脉冲⁷，以靶向角膜缘区域的小梁网和巩膜上静脉。为了最大程度地造成房角损伤，我们相较于先前报道的激光模型^5-7增加了激光照射点的数量。在我们的实验条件下，几乎所有接受激光处理的小鼠在治疗后第一周内眼内压升高超过50%，其中约60%的小鼠眼内压升高持续超过2个月。相比之下，向小鼠眼内单次注射微珠仅能引起眼内压约30%的升高，持续数周时间⁸（另有研究提示眼内压升高的效应可能更持久^9,1...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
<强>试剂
moxifloxacin	Alcon Labs, Inc.	NDC 0065-4013-03	0.5%，仅限处方
盐酸丙帕卡因	博士伦	NDC 24208-730-06	0.5%，处方药
眼科用溶液USP	博士伦	NDC 24208-730-06	0.5%，仅限处方
氯胺酮	巴特勒·施恩动物健康	NDC 11695-0550-1	100 mg / kg
赛拉嗪	爱荷华州 LLOYD 公司	NADA 139-236	10 mg / kg
硫酸阿托品溶液	Alcon Labs, Inc.	NDC 61314-303-02	1%，仅限处方
<强>仪器设备
裂隙灯，TOPCON	Visual Systems Inc	SL-3E	由 PS-30A 驱动
OptoMotry 1.8.0 虚拟系统	CerebralMechanics 公司
光动测试系统	CerebralMechanics 公司
用于小鼠的眼压计，TonoLab	Colonial Medical Supply
加热垫	Sunbeam Products Inc	722-810
氩离子激光器	相干公司	Ultima 2000SE
DECAPICONE 塑料锥形瓶架	Braintree Sci Inc.	MDC-200	用于小鼠