红外神经刺激已被提出作为多种神经类型电刺激的一种替代方法，包括与听觉系统相关的神经。本方案描述了一种膜片钳方法，用于研究红外神经刺激在原代听觉神经元培养物中的作用机制。
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摘要
摘要
近年来已证明，脉冲红外激光可以用于诱发神经组织的电反应，且无需对靶组织进行任何其他修饰。红外神经刺激已在多种外周和感觉神经组织中得到报道。 体内，尤其关注对听觉神经元的刺激。然而，尽管已证明红外神经刺激（INS）在这些环境中有效，但红外光引起神经兴奋的机制（或多种机制）目前尚不明确。本文所述方案介绍了一种全细胞膜片钳技术，旨在促进对培养的原代听觉神经元中红外神经刺激的研究。通过系统表征这些细胞对红外激光照射的反应 体外 在受控条件下，可能有助于更深入地理解红外神经刺激背后的基本物理和生物化学过程。
引言
神经生理学和医学仿生学领域高度依赖能够可控刺激神经组织电反应的技术。尽管电刺激仍是神经兴奋的金标准，但它存在诸多缺点，例如在记录神经反应时会出现刺激伪迹，以及由于电流扩散至周围组织而导致刺激特异性不足1。
过去二十年中，光学介导的刺激技术得到了发展2。其中一些技术需要对靶组织进行改造，无论是通过添加特定分子（例如笼锁分子）3，还是通过某种形式的基因操作（例如光遗传学）4，而这些方法在研究环境之外都难以应用。因此，特别值得关注的是红外神经刺激（INS），即通过脉冲红外激光照射来激发神经组织。INS 有望克服电刺激的诸多局限，实现对神经组织的高度特异性、非接触式刺激2。然而，尽管 INS 已在多种体内环境中成功实现，其确切的激发机制仍不明确。
一些近期发表的研究在揭示INS机制方面取得了进展5-7。由于水吸收激光光能而引起的快速加热似乎起着关键作用。然而，除此之外，目前尚未达成共识。Shapiro et al.7 提出了一种高度普适的机制，即快速加热导致细胞膜附近带电粒子分布发生扰动，从而改变细胞膜的电容并引发后续去极化。此外，Albert et al.5 认为，激光诱导的加热激活了一类特定的温度敏感型离子通道（瞬时受体电位香草素通道），使离子得以穿过细胞膜。目前尚不清楚这些机制如何共同作用，或者是否还存在其他尚未被识别的因素。
尽管已有少量出版物（参考文献 5,7-9) 已对 INS 进行了研究 体外，该领域已发表的绝大部分工作均已完成 体内 (例如 参考文献 1,6,10-18红外刺激听觉神经因其在人工耳蜗植入中的潜在应用而成为备受关注的研究领域 10,14-18。尽管 体内 实验对于验证该技术在不同环境中的有效性至关重要，其所提供的更高水平的控制能力 体外 研究有望加深对导致听觉神经同步（INS）机制的详细理解。本报告描述了用于膜片钳实验的培养螺旋神经节神经元的制备方法，这些神经元可用于研究基本机制，同时还能与听觉系统已有的大量数据建立关联。
膜片钳技术是研究电生理现象的优秀工具，可记录单个细胞的电活动，并用于研究单个基础电流的贡献19当该技术应用于稳定体系时 体外 原代神经元（如培养的螺旋神经节神经元）的制备为深入研究神经活动的调控与操纵机制提供了机会。
本研究中所述的实验方案概述了通过膜片钳记录技术研究激光刺激对螺旋神经节神经元电学特性影响的方法。该方法采用光纤耦合激光器而非自由空间激光器，从而实现更安全的操作，并且无需修改标准显微镜配置即可实现更简便、更可重复的光路对准。基于这些实验方案，有望开展多种多样的实验研究，以更清晰地阐明红外神经刺激（INS）背后的一种或多种作用机制。
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方案
1. 螺旋神经节神经元的培养
- 灭菌小型圆形（例如 将直径为10 mm的玻璃盖玻片和弯头镊子放入高压灭菌器中进行灭菌。使用已灭菌的镊子将灭菌后的盖玻片转移至无菌的35 mm四孔培养皿或4孔板的各个孔中。在盖玻片上表面加入150 μl多聚-L-鸟氨酸（500 μg/ml）和小鼠层粘连蛋白（0.01 mg/ml），然后置于37 °C培养箱中孵育最多48小时。确保盖玻片不会从孔底漂浮起来。
- 为每种神经元培养物准备 50 ml 无菌神经基础培养基（NBM）：47.5 ml 神经基础培养基 A，0.5 ml N2 补充剂：1 ml B27 补充剂、0.5 ml L-谷氨酰胺和 0.5 ml 青霉素-链霉素。注意：补充剂可分装冷冻，于 -20 °C 保存，并在需要当天加入培养基中。
- 从出生后第4至7天的大鼠幼崽中分离螺旋神经节神经元，方法如前所述 20,21，采用酶解法（0.025% 胰蛋白酶和 0.001% DNase I）与机械法相结合的方式。参见 Whitlon 等 22 和 Vieira 等 23 有关螺旋神经节神经元培养的详细步骤，或 Parker 等 24 用于演示蜗轴的分离。
- 吸除盖玻片上残留的多聚-L-鸟氨酸/层粘连蛋白溶液，并用NBM短暂洗涤。
- 将150–200 μl解离的螺旋神经节神经元悬液加入盖玻片中，并置于培养箱（37 °C，10% CO₂）内2）。注意：从一窝平均8只幼鼠中最多可制备20张盖玻片。
- 铺板神经元4小时后，吸去溶液以去除细胞碎片，更换为150–200 μl温热的新鲜NBM。注意：培养基可能需要每天补充，以避免脱水。
- 将盖玻片放回培养箱中，待需要进行电生理记录时再取出。注意：分离的螺旋神经节神经元培养物在解离后4小时即可用于电生理实验，此后最多可维持两天。时间 体外 在分析结果时应考虑上述因素。每隔24-48小时更换一次NBM。
2. 膜片钳记录的准备工作
- 配制溶液
- 细胞内（微电极）溶液：115 mM K-葡萄糖酸盐，7 mM KCl，10 mM HEPES，0.05 mM EGTA，2 mM Na2ATP，2 mM MgATP，0.5 mM Na2GTP（用KOH调节pH至7.3；用蔗糖调节渗透压至295 mOsmol/kg）。将溶液经无菌滤膜（0.2 μm）过滤后，分装为200 μl等份，于-20 °C保存，直至记录当天使用。
- 细胞外（灌流）溶液：137 mM NaCl，5 mM KCl，2 mM CaCl2，1 mM MgCl2，10 mM HEPES，10 mM葡萄糖（用NaOH调节pH至7.4；用蔗糖调节渗透压至300–310 mOsmol/kg）。该溶液在记录当天配制。
- 制备电阻为2–6 MΩ的记录微电极。我们使用CO2激光拉制仪（P-2000；Sutter Instruments）和硼硅酸盐玻璃毛细管（外径1.0 mm，内径0.58 mm，长度75 mm）。
- 准备激光系统。本方案适用于光纤耦合激光器，例如OptoTech P/L公司的1,870 nm红外神经刺激器。实验中用于光传递的光纤为芯径/包层直径200/220 μm、数值孔径0.22、两端带FC-PC接头的石英光纤（AFW Technologies MM1-FC2-200/220-5-C-0.22）。将跳线光纤对半剪断，得到两条一端带接头、另一端切割好的光纤尾纤（i.e. 一端连接器化，另一端切割平整）。Thompson et al. 25 已详细讨论光纤芯径和数值孔径对激光诱导温度变化的影响。
- 使用标准技术切割光传递光纤的尖端，并通过光学显微镜观察确保切割质量良好（i.e. 尖端应垂直于光纤轴线，肉眼观察呈平整状态）。使用合适的直通连接器（e.g. Thorlabs ADAFC2）将光传递光纤连接至刺激激光器的光纤耦合输出端。
- 使用适当的仪器（e.g. Coherent FieldMate配LM-3探测器头）测量光传递光纤切割端的激光输出功率。建议每次切割光纤或对激光器进行重大调整（e.g. 从一个实验室转移至另一个实验室）后均检查激光功率。
- 将光传递光纤插入光纤夹持器或等效装置，并将夹持器固定在相应的微操纵器上。准确确定光纤与盖玻片之间夹角θ至关重要。可通过拍摄实验装置照片，并使用图像处理软件（e.g. ImageJ）测量该角度。夹角θ（或可能的角度范围）主要受实验装置空间限制（尤其是显微镜结构）的约束。在我们的实验中（基于直立显微镜），θ的典型值约为36°，但其他实验配置（e.g. 使用倒置显微镜）的最优角度可能显著不同。
- 按照图2所示，连接激光器与膜片钳数据采集系统（e.g. Digidata 1440A，Molecular Devices）。应通过外部函数发生器将膜片钳数据采集系统的数字输出连接至激光器，从而可独立于数据采集系统设定激光脉冲参数。或者，也可将该输出直接连接至激光驱动器（此时需由数据采集软件设定脉冲持续时间和重复频率）。无论采用何种方式，用于触发激光的信号均应反馈连接至数据采集系统的输入端口，以确保激光脉冲的时序和持续时间能够与电生理信号同步记录。
3. 用于研究 INS 的膜片钳记录
- 用细胞外液填充灌流系统的适当容器，并调节流速，使灌流液以1-2 ml/min的速度灌注浴槽。我们使用重力驱动系统（抽吸瓶、夹管阀和PE管）配合串联加热器，以实现溶液的快速加热，同时使用蠕动泵通过负压吸引去除废液。
- 将带有培养细胞的盖玻片放入直立显微镜的记录室（灌流槽）中。使用高倍水浸物镜（例如 40倍）和相差（例如 微分干涉对比或Dodt梯度对比）下，在培养物中视觉定位螺旋神经节神经元。典型的螺旋神经节神经元在相差显微镜下呈亮相，圆形，直径约15 μm，具有明显的细胞核，如图所示 图1a.
- 一旦定位到神经元，切换至较低倍率的物镜（例如 10倍）并在视野中定位目标神经元。
- 使用以下步骤（或等效步骤）将光递送光纤移至指定位置：
- 使用微操纵器移动输出光纤，直至其尖端在水平和垂直平面上均接近目标神经元。通过上下移动物镜（扫描焦平面）可确认光纤尖端的垂直位置。
- 切换回高倍物镜，将光纤尖端移至神经元附近的目标位置（参见 图2 插图）。调整光纤的垂直位置时，必须确保光纤的底边落在（即 轻轻接触盖玻片，以最大程度减少纤维位置的不确定性。在水平面上的最佳对齐程度取决于纤维与盖玻片之间的夹角 θ 以及纤维的半径。 r为了使光纤定位，使得目标神经元的中心位于光纤轴线上，光纤上边缘与目标细胞之间的水平距离应为
Δ目标 = r (cosec θ - 2 sin θ)
其中负值表示光纤伸出超过细胞。在对准光纤时，Δ 距离目标 纤维上边缘与神经元中心之间的距离可通过目测大致确定。然而 Δ目标 仅用作粗略参考。应调整光纤位置，使光纤上边缘与神经元中心之间的实际距离 Δ 明显不同于 Δ目标 （如 图1) 可以揭示径向位移的影响即 从光束中心）和轴向位移（即 沿纤维轴方向）的光束相对于目标神经元的位置。例如，设定 Δ ≈ 0 预计会提高细胞周围区域的局部温度— 即 由于典型多模光纤的光束轮廓可很好地近似为平顶帽分布 26与将光纤端面移近细胞所导致的吸收能量增加相比，因偏离光束中心而引起的局部吸收能量（温度）降低微乎其微。
尽管应尽可能利用视觉提示准确且可重复地定位光纤，但仍需精确测量光纤位置相对于目标神经元的位置（例如 Δ）比将其定位在预定距离处更为重要。Δ 可通过图像分析确定（估计最大不确定度为 ±3 μm），具体方法见方案第 3.8.2 步。在某些实验中 5,8，已通过光纤耦合白光光源以靶向目标细胞。研究发现，该方法在直立显微镜装置中效果不佳，因为在这些较小的角度（θ）下，来自目标区域的散射光强度相对较低。 - 纤维就位后，将其移出一段已知距离，以便准确定位微移液管。当获得神经记录后，可将纤维恢复至原始位置。
- 用细胞内液填充微量移液管，并牢固安装至放大器的前端装置上（例如 Multiclamp 700B，Molecular Devices)。通过连接在微电极 holder 侧面的管路施加少量正压，以防止微吸管堵塞。
- 使用显微操作仪将微电极移至目标神经元正上方的预定位置。
- 全细胞记录实验方案：
- 施加一个持续时间为10毫秒、+10毫伏的方波脉冲（例如 在放大器的电压钳模式下进行封接测试（Seal Test），并调节微电极电位（电极偏移量）使基线信号电流为 0 nA。封接测试还应用于判断微电极电阻是否处于理想范围内（例如 2 - 6 MΩ
- 在监测电阻的同时，使用显微操作器进行精细调节，轻柔地将微电极移至目标神经元表面。当微电极与神经元接触时，电阻将升高（约0.5至1 MΩ）。电阻升高后，立即撤除正向液压力，并施加轻微的负压。当电阻上升至10 - 20 MΩ时，将膜电位固定于某一钳制水平例如 约 -60 mV。
- 电极电阻应持续上升，直至超过1 GΩ，表明细胞膜与微电极尖端之间已形成有效的密封（称为“吉欧密封”）。此时，应撤除微电极内的所有液体压力。
- 一旦形成吉格封接，使用短促的电流脉冲（25 至 100 μsec；+1 V）或短暂的负压脉冲刺破细胞膜，以获得全细胞记录构型。
- 记录封接测试脉冲期间通过拟合电流指数曲线所确定的膜电容、串联电阻和输入电阻。通过调节放大器上的 CpFast 和 CpSlow 控制参数，最小化电容瞬变，然后将放大器切换至全细胞模式，并进行电容和电阻补偿，直至封接测试期间观察到平坦的电流信号。应用串联电阻补偿（约70%校正；70%预测），同时调节电容和电阻控制参数，以维持平坦的封接测试响应。
- 切换至放大器的电流钳模式。记录静息膜电位（无电流注入时）。设定维持电流，以将膜电位稳定在目标水平例如 -60 mV）。中和移液管电容，并调节电桥平衡以补偿电压降。
- 通过施加去极化电流（+10 至 +200 pA，步长 +10 pA；持续时间 300 毫秒）刺激神经元，检测其放电特性。
-
- 将光纤移回神经元旁边的指定位置。使用与CCD相机连接的成像软件，拍摄光纤相对于目标神经元位置的图像，首先聚焦于神经元所在焦平面，然后聚焦于光纤的上边缘（参见 图1).
- 通过后续对所得图像的分析（例如 图1b 和 1c可以精确定出Δ（光纤上边缘相对于目标神经元中心的位置）。一旦已知Δ，便可确定光纤端面到目标神经元之间的距离（沿光纤轴向）等参数。 z 神经元相对于光束中心的径向位移 δr 可以使用简单的三角关系进行计算：
z = r sin 2θ + Δ cos θ
δr = ((r cos 2θ - Δ sin θ2 + δy2)1/2,
其中，δy 是从上方观察时，光纤轴与神经元中心之间的距离（例如 见 图1).
分析应考虑细胞间的定位差异，因为准确了解这些位置参数可能对于解析刺激过程之间的潜在差异至关重要 25.
4. INS 实验
- 在电流钳或电压钳配置下记录电生理数据的同时，以设定的参数运行刺激激光器（例如 功率、脉冲长度、重复频率等）。使用我们的激光系统时，激光驱动器通过直接输入控制光功率，并在每次记录前手动设定。脉冲长度和重复频率可通过外部信号发生器或数据采集软件进行控制（如步骤2.3.4所述）。确保同时记录膜片钳通道和激光触发通道的数据。
脉冲长度约为500 μsec至15 msec、每脉冲能量约为0.25–5 mJ的激光脉冲通常可产生可测量的电学响应。在初始实验中，将激光脉冲的重复频率设置为1 Hz或更低可能较为有利，因为这可以最小化该参数的影响。下一部分将展示记录信号变化的典型结果。
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结果
螺旋神经节神经元在电压钳和电流钳记录模式下，对激光照射均产生可重复的波形反应。 图3a 在膜电位分别钳制于 -70 mV、-60 mV 和 -50 mV 时，显示细胞膜跨膜电流对持续 2.5 毫秒、能量为 0.8 毫焦的激光脉冲的典型响应（数据为间隔 1 秒重复 6 次激光脉冲后的平均响应）。激光脉冲 consistently 诱发净内向电流，光照结束后电流恢复至初始水平。可见激光诱发电流的波形随膜电位的改变而变化，表明为全面理解红外神经刺激（INS）背后的机制，有必要在一系列钳制电位下开展实验。这些实验可通过对现有方案进行少量修改来实施，并可采用如电荷-电压（Q-V）分析等 established 技术进行分析（参见参考文献） 7 来自 INS 的 Q-V 曲线示例 体外).
所提供的数据 图3b 表明由持续2.5毫秒、能量0.8毫J的激光脉冲引发的膜电位变化（初始膜电位为-73 mV，数据为以4 Hz重复频率施加的16次激光脉冲的平均值）。电流钳记录显示，在激光脉冲期间膜...
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讨论
利用本文所述方案，可提取并培养螺旋神经节神经元，并通过全细胞膜片钳实验检测激光诱发的电活动。当使用时 体外，膜片钳技术提供的实验参数控制水平是其他方法无法达到的 体内激光刺激参数（如波长、脉冲能量、脉冲时长、脉冲形状和脉冲重复序列）可在可重复的实验条件下进行研究。此外，还可研究神经元所处的培养环境（例如 溶液温度、化学因素）可被系统性地调节，从而能够研究膜特性，进而揭示红外神经刺激的潜在机制。电刺激与光刺激模式之间的相互作用也可在受控条件下进行探究。通过引入荧光探针以监测其他参数（如离子浓度或热休克蛋白的表达），这些基础研究可进一步深入。对这些不同参数的清晰理解，不仅对于全面认识该现象至关重要，也有助于通过工艺优化实现更高效的刺激。
由于温度在胰岛素机制中发挥的重要作用 5-7，准确测量激光照射引起的局部加热对于阐明该机制至关重要 27一种通过记录流经敞口膜片电极的电流来获得校准温度测量值的详细方法已被Yao描述 等 28 并被众多作者采用，用于...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由澳大利亚研究理事会资助，项目编号 LP120100264。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养材料与设备 | |||
| 玻璃盖玻片 | Lomb Scientific | CSC 10 1 GP | |
| 四环细胞培养皿 | VWR International | 82050-542 | |
| 多聚-L-鸟氨酸溶液 | Sigma-Aldrich | P4957 | |
| 层粘连蛋白 | Invitrogen | 23017-015 | |
| 弯头镊子 | WPI | 14101 | Dumont #5 镊子（45° 角尖端） |
| CO2 培养箱 | ThermoScientific | Heracell 150i | |
| 表1. 细胞培养材料与设备。 | |||
| Neurobasal 培养基 | |||
| Neurobasal A | Gibco | 10888-022 | |
| N-2 补充剂 | Invitrogen | 17502-048 | |
| B27 无血清补充剂 | Invitrogen | 17504-044 | |
| 青霉素-链霉素 | Invitrogen | 15140-148 | |
| L-谷氨酰胺 | Invitrogen | 25030-149 | |
| 细胞内溶液 | |||
| 氯化钾 | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| D-葡萄糖酸钾 | Sigma-Aldrich | G4500 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Na2ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| MgATP | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| NaGTP | Sigma-Aldrich | G8877 | |
| 氢氧化钾 | LabServ | BSPPL738.500 | |
| 蔗糖 | Sigma-Aldrich | S8501 | |
| 细胞外溶液 | |||
| 氯化钠 | Sigma-Aldrich | 310166 | |
| 氯化钾 | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| 氯化钙 | Sigma-Aldrich | 383147 | |
| 氯化镁 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| D-葡萄糖 | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| 氢氧化钠 | LabServ | BSPSL740.500 | |
| 蔗糖 | Sigma-Aldrich | S8501 | |
| 表2. 细胞培养与膜片钳实验用溶液。 a) Neurobasal 培养基。b) 细胞内溶液。c) 细胞外溶液。 | |||
| 直立显微镜 | Zeiss | AxioExaminerD1 | 配备Dodt反差成像系统 |
| 水浸物镜 | Zeiss | W Plan-APOCHROMAT 40x/0.75 | |
| 平台与X-Y位移台 | ThorLabs | Burleigh Gibraltar | |
| 记录室 | Warner Instruments | RC-26G | |
| 防振台 | TMC | Micro-g 63-532 | |
| CCD相机 | Diagnostic Instruments | RT1200 | |
| 相机软件 | Diagnostic Instruments | SPOT Basic | |
| 在线溶液加热器 | Warner | SH-27B | |
| 温度控制器 | Warner | TC-324B | |
| 膜片钳放大器 | Molecular Devices | Multiclamp 700B | |
| 膜片钳数据采集系统 | Molecular Devices | Digidata 1440A | |
| 微操纵器 | Sutter Instruments | MPC-325 | |
| 微电极玻璃管 | Sutter Instruments | GBF100-58-15 | 带细丝的硼硅酸盐玻璃 |
| 微电极拉制仪 | Sutter Instruments | P2000 | |
| 记录软件 | AxoGraph | Lab pack 与电生理学工具 | |
| 抽吸瓶 | Sigma-Aldrich | CLS12201L | 1 L Pyrex 抽吸瓶，带管路出口 |
| PE管 | Harvard | PolyE #340 | |
| Masterflex 蠕动泵 | Cole-Parmer | HV-07554-85 | |
| 表3. 膜片钳设备。 | |||
| 1,870 nm 激光二极管 | Optotech | ||
| 200/220 μm 直径多模光纤跳线（FC/PC） | AFW Technologies | MM1-FC2-200/220-5-C-0.22 | 光传递光纤，石英纤芯与包层，0.22 数值孔径 |
| 光纤直通连接器（FC/PC） | Thorlabs | ADAFC2 | |
| 光纤切割器 | EREM | FO1 | |
| 光纤剥线工具（0.25 - 0.6 mm） | Siemens | 用于去除光纤护套 | |
| 光纤剥线工具（0.6 - 1.0 mm） | Siemens | 用于去除跳线外涂层 | |
| 信号发生器 | 任何可输出所需脉冲波形并支持外部触发的信号发生器 | ||
| 光纤定位器 | 定制定位器。可用标准膜片钳实验用微定位器替代 | ||
| 光纤夹头 | Newport | FPH-DJ | |
| 激光功率计与探测器探头 | Coherent | FieldMate（功率计）配LM-3（探测器探头） | |
| 表4. 激光设备。 |
参考文献
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