MBP基于标记策略的Mgm101重组蛋白的制备

Summary

酵母线粒体类核蛋白质，Mgm101，是一种重组蛋白RAD52型，形成大低聚环。甲协议的描述以制备可溶性的重组Mgm101使用麦芽糖结合蛋白（MBP）标记加上阳离子交换和尺寸排阻色谱法策略。

Abstract

20年前被确定MGM101基因维护线粒体DNA中的作用。从几组研究表明，的Mgm101蛋白参与线粒体DNA的重组修复。最近的调查表明，Mgm101 RAD52型重组蛋白家族有关。这些蛋白质形成大的低聚环促进退火同源单链DNA分子。然而，表征阻碍了Mgm101的生产重组蛋白的难度。在这里，用于制备重组Mgm101的一个可靠的程序进行说明。麦芽糖结合蛋白（MBP）标签Mgm101的首先在大肠杆菌中表达。最初是由直链淀粉的亲和层析柱纯化的融合蛋白。在被释放后通过蛋白水解裂解，Mgm101从MBP分离，通过阳离子交换色谱法。然后单分散Mgm101是获得通过尺寸排阻色谱法。可以定期获得的产量为〜0.87毫克每升细菌培养Mgm101。该的重组Mgm101有DNA污染最小。对样品成功地用于生化，结构和单粒子图像分析Mgm101。此步骤也可用于制备其它大的低聚物的DNA结合蛋白，可能会被错误折叠的和细菌细胞毒性的。

Introduction

同源重组是非常重要的双链断裂的修复（DNA双链断裂）和链间交联，并从倒塌的复制叉¹重新开始DNA复制。在常规的同源重组，中央的反应由ATP-依赖的重组酶RecA蛋白在原核细胞中，在真核生物中^1-3的Rad51和Dmc1。这些重组酶形成核蛋白丝的单链DNA，这是必不可少的双链DNA模板（ 图1，左侧面板^）4-7内发起同源搜索和钢绞线入侵。除了 ​​常规的计划，同源重组也可以采取地方在RecA/Rad51-independent的方式（ 图1，右图）。例如，酵母的保守和Rad59蛋白质可以直接催化切除双链DNA断裂露出的互补单链DNA链退火。这个重组过程中，被称为唱乐链退火，一般不涉及同源配对的双链DNA模板。退火后，除去核酸外切酶的异源尾巴刻痕结扎以恢复基因组连续性^8-10。常伴有直接重复区域之间的基因组序列缺失修复由单链退火机制。

RAD52属于普遍噬菌体¹¹的重组蛋白质，是一个多元化的群体。这些蛋白质也被称为单链退火蛋白（会计实务准则），根据他们的活动在促进同源的单链DNA分子退火。最好噬菌体会计实务准则Redβ的的ERF从噬菌体λ噬菌体rac和葡激酶蛋白从噬菌体lactococcal UL36和P22，RECT。的会计准则结构其特征在于由一个典型的β-β-β-α倍，虽然相似，几....

Protocol

以前的研究已经表明，第一个氨基末端的22个氨基酸残基的Mgm101裂解后，导入到线粒体^19。对于在大肠杆菌中的表达，通过PCR扩增MGM101缺乏的前22个密码子的开放读码框放在男性的编码序列的表达载体pMAL-C2E的修改版本，麦芽糖结合蛋白（MBP）的下游。这会产生的MBP-Mgm101的的断前蛋白酶（ 图3）与一个连接器包含一个切割位点的融合。首次构建质粒选择E。大肠杆菌转化，而 ​​不IPTG和的Xgal蓝色/白选择。将得到的质粒pMAL-C2E MGM101然后导入大肠杆菌大肠杆菌菌株BL21-CodonPlus（DE3）-RIL，选择氨苄青霉素和氯霉素抗性菌落。

1。表达，诱导，细胞裂解和DNase I处理

1. 伊诺克ulate新鲜的转化体在10ml补充有葡萄糖（0.2％），氨苄青霉素（100微克/毫升）和氯霉素（50微克/毫升）的LB培养基（1％蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％氯化钠）。在200转摇孵育在37°CO / N。
2. 为2升与上述补充的LB培养基中，接种10毫升的预培养物。成长的细胞在37℃振荡，直到OD ₆₀₀达到0.5。
3. 通过加入异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG），使最终浓度为0.3 mM，的MBP-Mg....

Results

Mgm101是一个RAD52在线粒体相关的重组蛋白。 RAD52已被广泛研究，它的作用在线粒体DNA重组（ 图1）。重组Mgm101可以准备通过三个步骤（ 图2）。这是促进所使用的MBP的标记策略，允许以可溶形式表达在Mgm101从标签的蛋白水解裂解，随后被释放（ 图3）。

在一个典型的制备方法中，约2-3毫克，MBP-Mgm101融合可以被回收后，直链淀粉的亲和层析从细菌培养1升。 SDS-PAGE凝胶上，MBP-Mgm101的〜70 kDa的（ 图4）检测到的一个主要带。如果树脂被适当地洗涤洗脱前，由其他蛋白质的污染是最小的。断前蛋白酶裂解后，MBP和Mgm101的分离和显示为42 kDa和28 kDa的条带分别在SDS-PAGE（ 图5A）。在消化不完全的情况下，如由一〜70 kDa条带的存在下，延伸的额外的断前蛋白酶消化忠告。

对于阳离子交换色谱裂解.......

Discussion

它一直是一个挑战，产生一个稳定的，原生的重组Mgm101蛋白E.大肠杆菌可能是由于其在细菌细胞中的不溶性。在这份报告中，我们表明，MBP融合战略使蛋白质表示在相当高的水平。通过负染色透射电子显微镜和尺寸排阻色谱法，我们以前曾表明，MBP的融合蛋白在体外 ¹⁸形成均匀的低聚物。这是可能的折叠和低聚Mgm101的，可能比较慢线粒体基质相比，细菌细胞中。 unoligomerized Mgm101可迅速形成聚集体， 在体内有毒。 ，MBP的标记可能保持Mgm101一种可溶性的构象，允许生产齐聚，并减少其毒性。

质量好Mgm101制剂的一个重要标准是通过DNA的污染最小。 A ₂₈₀ / A _{的260比用来估算样品中的DNA污染的水平。通常情况下，可以很容易地实现一个比> 1.4，这被认为是质量好，用0.75％的污染核酸。如果A 280 / A 260的比例是低于这个水平，我建议扩展用DNase消化。在未来，这可能是有用的，以查.......}

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
表达载体 pMAL-c2E	New England Biolabs	#N8066S
PreScission 蛋白酶	GE Healthcare Life Sciences	#27-0843-01
BL21-CodonPlus（DE3）-RIL 细胞	Strategene	#230245
亮肽素	Roche Applied Science	#11034626001
胃蛋白酶抑制剂	Roche Applied Science	#11359053001
苯甲基磺酰氟 （PMSF）	罗氏应用科学	#10837091001
DNAse I	Sigma	#DN25-1G
异丙基 β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷 （IPTG）	罗氏应用科学	#11411446001
直链淀粉树脂	New England Biolabs	#E8021L
经济柱	色谱柱BIO-RAD	#7372512
Bio-Scale 小型宏观制备高 S 小柱 （1 ml）	BIO-RAD	#732-4130
VIVASPIN 15R 超滤离心柱 （10,000 MWCO）	Sartorius Stedium	#VS15RH02
Superose 6 制备级色谱柱	Amersham Bioscirnces	#17-0489-01
VIVASPIN 6 超滤离心柱 （5,000 MWCO）	Sartorius Stedium