基于手机的宽场荧光显微镜与荧光成像流式细胞术

摘要

我们回顾了近期在手机上利用紧凑且低成本的光流控附件集成荧光显微镜与成像流式细胞术工具的研究成果。这些基于手机的微分析装置可能适用于细胞计数分析，例如执行多种细胞计数任务，或在资源有限的环境中对水样等样品进行高通量筛选。

摘要

荧光显微镜与流式细胞术是生物医学研究与临床诊断中广泛使用的工具。然而，这些设备通常体积较大且成本较高，限制了其在资源有限环境中的应用。为应对这些局限，我们近期已证明可通过紧凑、轻便且经济的光电微流控附件，将宽场荧光显微镜与成像流式细胞术功能集成于手机平台。在我们的流式细胞术设计中，荧光标记的细胞经由一条位于手机摄像头单元上方的微流控通道流过。由电池供电的发光二极管（LED）紧耦合至该微流控芯片侧面，芯片本身作为多模平面波导，使激发光被引导并均匀激发荧光标记的目标。手机摄像头记录荧光细胞流经微流控通道的延时影像，通过对影像的数字帧进行处理，可统计目标溶液中荧光标记细胞的数量。采用类似的光电微流控设计，我们亦可在静态模式下对这些荧光标记细胞进行成像。 例如 将荧光颗粒夹在两张载玻片之间，并利用手机摄像头捕获其荧光图像，可实现的空间分辨率为 例如 约 10 μm，覆盖约 81 mm 的大视野范围²基于手机的荧光成像流式细胞术与显微镜平台在资源有限的环境中可能特别有用，用于 例如 CD4+ T细胞计数用于监测HIV阳性患者，或用于检测饮用水中的水源性寄生虫。

引言

显微镜和流式细胞术是生物医学与科学研究以及临床诊断中广泛使用的技术^1-12，用于对各类细胞进行计数和表征。然而，传统的显微镜和流式细胞仪相对复杂且昂贵，限制了其主要在设备完善的中心实验室中使用。最近，我们开发出一种紧凑轻便的荧光成像细胞仪与显微镜装置，并将其集成于手机上^13,14，有望以较低成本将荧光显微镜、流式细胞术及相关微分析技术应用于资源有限的环境，推动影响全球健康的多种远程医疗应用。

在光流控流式细胞仪配置中（参见 例如 图1C 和 1D），一个定制设计的基于聚二甲基硅氧烷（PDMS）的微流控通道被放置在手机相机单元前方，发光二极管（LEDs）与通道的边缘直接耦合。该微流控芯片连同样品液体共同构成一个光流体平面波导（例如由PDMS-液体-PDMS组成），使得激发光能够被引导并均匀地激发微通道内荧光标记的样本。这些标记物发出的荧光信号， 例如 细胞随后通过紧接在手机相机单元后方的附加透镜进行成像，并投射至手机互补金属氧化物半导体（CMOS）图像传感器上。由于荧光发射光的收集方向垂直于激发光光路，因此仅需使用低成本的塑料吸收滤光片即可有效去除散射的激发光，从而为荧光成像提供所需的良好暗场背景。采用类似的光电微流控设计，我们还可以在静态模式下对荧光物体进行成像（参见 图1A 和 1B），其中荧光微粒被夹在两块玻璃载片之间，而非流经微流控通道，荧光微粒的发射光由手机CMOS图像传感器捕获，用于微粒计数与表征。根据不同的应用需求，可选择流式细胞术或宽场荧光显微镜技术。例如，基于手机的流式细胞仪装置在筛查大量液体样本时可能特别有用（例如 少量（几毫升）即可用于稀有细胞或病原体的检测。

本文综述了我们近期在利用紧凑且低成本的光电微流控附件，将荧光显微镜和成像流式细胞术工具集成于手机上的部分研究成果。这些基于手机的微分析、成像细胞术和传感平台可为远程医疗和即时诊断提供多种可能性，尤其有助于应对全球资源有限地区面临的重大健康挑战。

方案

在本节中，我们介绍基于手机的宽场荧光显微镜¹³和光流控成像细胞仪平台¹⁴的实验方案。我们将使用荧光微球和荧光标记的白细胞来测试这些成像平台。

A. 基于手机的宽场荧光显微镜和光流控成像流式细胞仪的制备

基于手机的宽场荧光显微镜或流式细胞仪主要由两部分组成：一部带摄像头的手机和一个紧凑型光流控附加装置。

1. 手机摄像头

尽管所介绍的技术几乎适用于任何手机摄像头，但我们选择索尼爱立信Aino作为这些设备的基础。该手机配备了一个约800万像素的RGB CMOS传感器，以及一个内置镜头，其焦距（f1）约为4.65 mm。

2. 用于宽场荧光显微镜的光流控附件

该光学附件由Autodesk设计，并使用Dimension Elite 3D打印机以ABSplus热塑性材料打印而成。在打印过程中，模型材料和支撑材料在打印机内部的挤出头中被加热，并逐层沉积在建模基座上。此步骤完成后，支撑材料可被溶解，从而留下一个坚固的所需原型三维模型。我们的光学附件设计包括发光二极管（中心波长约为470 nm，Digikey）、塑料滤光片（#NT54-46，Edmund Optics）、样品托盘以及一个平凸透镜 f2=15 mm（#NT45-302，Edmund Optics）。所有发光二极管和塑料滤光片均可根据荧光染料的光谱特性轻松更换。组装该光流控附件的步骤包括：

1. 将镜头放入其特定的镜头支架位置内的附件中。
2. 将塑料滤光片放置在滤光片托盘上，并将其滑入附件中；或者将塑料滤光片用胶带固定在手机摄像头镜头前方。
3. 将LED托盘插入附件中。
4. 将样本玻片放入样本托盘中，再将样本托盘滑入附件内，并使LED面向样本。
5. 将附件夹在手机上，确保附加镜头与手机摄像头镜头直接接触。
6. 使用附件上的开关打开LED灯。
7. 使用手机摄像头的“夜景模式”拍摄目标样本图像。

3. 用于荧光成像流式细胞术的光流控附件

当需要对大量液体样本进行检测以发现稀有事件时，可优先选择光流控流式细胞仪。我们可以改造现有的宽场荧光显微镜设计，将其转变为流式细胞仪，其中采用基于聚二甲基硅氧烷（PDMS）的微流控通道，持续将液体样本输送至成像区域。光学附件由Autodesk设计，并通过Dimension Elite 3D打印机打印而成。该附件还包括发光二极管（中心波长约为470 nm，Digikey）、塑料滤光片（#NT54-46，Edmund Optics）、样本托盘和一个非球面透镜（f = 4.5 mm）（产品编号#C230TME-A；Thorlab）。组装该光流控附件的步骤包括：

1. 将非球面透镜放入附件中。
2. 将塑料滤光片放置在滤光片托盘上，并将其滑入附件中；或者将塑料滤光片用胶带固定在手机摄像头镜头前方。
3. 将微流控通道滑入同一光学-流体附件中。
4. 将附件夹在手机上，使附加透镜直接接触手机摄像头镜头。
5. 使用附件上的开关打开LED灯。
6. 将微流控通道连接至注射泵，并以恒定流速将液体样品注入微流控装置中。
7. 使用手机摄像头的视频模式，拍摄荧光细胞/颗粒流经微流控通道的视频。

B. 样品制备

4. 荧光微粒样品的制备

1. 从 Invitrogen（美国加利福尼亚州卡尔斯巴德）购买直径为 10 μm 的荧光微球（红色微球：产品编号 #F8834，激发/发射波长 580 nm/605 nm；绿色微球：产品编号 #F8836，激发/发射波长 505 nm/515 nm）。
2. 将 10 μl 绿色荧光微球与 10 μl 红色荧光微球混合，并加入 40 μl 去离子水。
3. 使用微量移液器取 10 μl 微球混合液滴加到载玻片上，并在上方覆盖另一张载玻片，形成三明治结构。
4. 将此三明治结构插入样品托盘，并滑入手机附件中。

5. 荧光标记白细胞的制备

1. 从冰箱中取出SYTO16核酸荧光标记试剂盒（#S7578，Life Technology）和磷酸盐缓冲液（PBS），使其恢复至室温。
2. 将200 μl全血样本从EDTA采血管转移至1.5 ml聚苯乙烯管（#05-408-129，Fisher Scientific）中。
3. 向200 μl全血样本中加入1 ml红细胞裂解缓冲液（#R7757，Sigma-Aldrich），充分混匀。
4. 5分钟后，离心裂解后的血液样本，并弃去上清液。
5. 将白细胞沉淀重悬于200 μl PBS缓冲液中，并轻轻混匀。
6. 向白细胞样本中加入5 μl 1 mM SYTO16溶液，用铝箔纸包裹样本，在避光环境中孵育约30分钟。
7. 再次离心样本，弃去上清液，将标记后的白细胞沉淀重悬于PBS缓冲液中。
8. 取5–10 μl标记后的白细胞悬液滴加至一张盖玻片上，并在样本上方覆盖第二张盖玻片。
9. 将夹心式样本载片插入样本托盘中，使用手机荧光显微镜进行成像。

或者

10. 使用自动注射泵通过微流控通道持续输送荧光标记的白细胞，同时使用手机摄像头在视频模式下捕获流动细胞的荧光显微视频。我们还应强调，可采用便携式电池供电的注射泵，甚至重力驱动的方式，推动液体流经微流控通道。

结果

采用我们的光流体泵送/激发方案（图1C 和 1D），可使用注射泵持续将荧光标记的细胞注入微流控通道，同时利用手机摄像头记录流动细胞的延时荧光显微影像。随后可使用轮廓检测与追踪算法快速分析这些荧光影像^14,15 以自动确定流经微流控通道的细胞的绝对数量和密度，发挥荧光成像流式细胞仪的功能。基于上述平台（图1C 和 1D）和样本制备方案，我们实现了对人血样本中白细胞总数（WBCs）的准确计数，结果与标准血液分析仪相当。¹⁴ 或者，我们也可以以静态模式对荧光细胞/颗粒进行成像，¹³ 从而在无流体流动的情况下，实现极大的样本视场范围 例如 约 81 毫米² 空间分辨率为约10 μm，如图所示 例如 图2 和 3光学像差的来源可以通过设计更复杂的透镜系统来减少。或者，也可以通过表征像差的来源及其空间分布模式，利用数字图像处理...

讨论

我们介绍了基于手机的宽场荧光显微镜和光学流体成像流式细胞仪的最新研究成果，该技术采用轻便紧凑的光学流体附件连接至手机摄像头。利用这一平台技术，我们对包括微粒和全血样本中荧光标记的白细胞在内的荧光物体进行了成像。因此，这种紧凑且经济高效的基于手机的荧光成像工具集可能适用于现场即时诊断，特别是在资源有限的地区，可用于应对各种全球健康问题，例如对 HIV 感染者进行 CD4+ T 淋巴细胞计数监测。

除了体液分析外，这种基于手机的光流控细胞计数平台还可用于其他传感需求，例如荧光免疫分析的定量检测 例如 在资源有限环境下的水质/食品安全监测。为此，我们近期已实现了对目标物的高灵敏度、高特异性及快速检测 大肠杆菌 O157:H7 (E. coli) 在水和牛奶样品中使用相同的光流控手机附件¹⁶我们利用表面功能化的玻璃毛细管特异性且灵敏地捕获 大肠杆菌 液体样品中流经每根毛细管的颗粒被捕获 E. coli 颗粒进一步用与量子点（QD）偶联的二抗进行标记。随后利用光流控手机成像平台检测...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
手机	Sony	Sony Ericsson Aino
平凸透镜	Edmund Optics	# NT45-302
非球面透镜	Thorlab	# C230TME-A
滤光片	Edmund Optics	#NT54-46
蓝色LED	Digikey	#365-1201-ND
电池	Digikey	#P032-ND
聚苯乙烯管	Fisher Scientific	#05-408-129
红细胞裂解缓冲液	Sigma Aldrich	R7757
SYLGARD 184 SILICONE ELASTOMER KIT	Dow Corning
红色荧光微球（10 μm）	Life Technologies	#F8834
绿色荧光微球（10 μm）	Life Technologies	#F8836
SYTO16 核酸荧光标记试剂	Life Technologies	# S7578