腺病毒转导初始CD4 T细胞以研究调节性T细胞分化

摘要

利用表达柯萨奇腺病毒受体的转基因技术，通过腺病毒介导的基因转移将外源基因导入初始CD4 T细胞，可实现对调节性T细胞分化的分子机制分析 体外.

摘要

调节性T细胞（Tregs）对于维持对自身抗原以及某些外来抗原的免疫耐受至关重要。Tregs可由初始型CD4 T细胞诱导产生 体外 在TGFβ和IL-2存在下通过TCR和共刺激诱导。这一过程对未来治疗具有巨大潜力，然而调控分化的分子及信号通路在很大程度上仍不清楚。

初始T细胞可通过外源基因表达进行操控，但常规方法无法有效靶向T细胞在初次接触抗原前最重要的初始状态。本文提供了一种在初始CD4 T细胞中表达外源基因的实验方案 体外 在诱导Treg分化之前，采用复制缺陷型腺病毒进行转导，并阐述该腺病毒的构建与生产方法。腺病毒可容纳较大的插入片段（最多可达7 kb），并可携带启动子以实现T细胞中高水平且瞬时的过表达。若T细胞表达转基因的柯萨奇腺病毒受体（Coxsackie adenovirus receptor, CAR），则该病毒可高效转导初始小鼠T细胞。重要的是，感染后T细胞仍保持初始状态（CD44低表达）^低CD62L^高）和静息状态（CD25^-CD69^-）并可被激活和分化为调节性T细胞（Tregs），其分化行为与未感染细胞相似。因此，该方法能够从最初阶段即对CD4+ T细胞的分化进行操控，确保在初始TCR刺激所引发的早期信号事件导致细胞发生最终导向Treg分化的改变时，外源基因的表达早已建立。

引言

调节性T细胞（Tregs）对于维持免疫耐受以及抑制过度的免疫反应至关重要。Tregs能够抑制旁观者T细胞的活化。因此，若清除Tregs将导致由活化的T细胞驱动的致命性自身免疫和自我组织破坏¹。Tregs在胸腺中CD4单阳性前体细胞经历阴性选择时发育形成，但也可在外周由初始CD4 T细胞在低剂量抗原刺激及次优共刺激条件下分化而来^1,2。胸腺来源的Tregs似乎主要抑制针对自身抗原的组织自身免疫反应，而外周诱导的Tregs则被认为在肠道或肺部耐受的建立中发挥重要作用。这些诱导产生的Tregs能有效防止T细胞在黏膜部位识别外来抗原后发生活化，这些外来抗原包括食物和空气中的环境抗原、共生细菌以及过敏原^3,4。此外，Tregs在母体对胎儿肽段产生免疫耐受⁵以及预防移植物抗宿主病⁶过程中也具有关键作用。然而，Tregs同时也会产生不利影响，例如通过削弱对肿瘤细胞的免疫监视功能而促进肿瘤免疫逃逸^7,8。Tregs的标志性特征是表达决定其亚群特性的转录因子Foxp3，这是一种含有叉头结构域的转录因子，对赋予Tregs功能具有必要性和充分性^9,10。目前已有部分可诱导Foxp3表达的信号通路被揭示，但T细胞受体激活后调控Treg分化的分子机制仍尚不明确。

Tregs 可被非常有效地诱导 体外 通过在TGFβ和IL-2存在下，....

方案

1. 将目的基因克隆至入门载体

1. 将目的基因克隆至入门载体中。通过PCR扩增目的基因，随后进行平末端连接至拓扑异构酶偶联载体例如 pENTR/D-TOPO）或限制性酶切介导的克隆可用于此实验步骤。

2. 将目的基因转入 pCAGAdDu 靶向载体

1. 通过LR重组反应将目的基因从入门载体转移至目的载体（例如 Gateway LR Clonase II 酶混合物）。这将构建出腺病毒表达载体 （图1）.
2. 线性化10 μg的腺病毒表达载体 PacI 限制性酶切后，将DNA沉淀并重悬于水中，浓度为每100 μl含3 μg DNA。线性化可释放病毒的反向末端重复序列（ITR），该序列是病毒DNA复制及包装至病毒颗粒所必需的。

3. 初始病毒裂解物的制备

1. 在6孔板的一个孔中接种1 × 10⁵个HEK293A细胞，加入2 ml细胞培养基（DMEM，10% FBS，5% PenStrep），于37 °C、10% CO₂培养箱中培养6 – 14小时，使细胞贴壁。此时细胞融合度应约为50%。
2. 脂质体转染：将6 μl jetPEI试剂加入94 μl 50 μM NaCl中，短暂涡旋....

结果

病毒制备

为了获得高滴度的病毒，HEK293A细胞在初级病毒生产或病毒扩增过程中的收获时间至关重要。图3展示了具有病毒产生典型视觉特征的代表性荧光图像和相差显微镜图像。在将无插入片段的对照质粒pCAGAdDu转染至HEK293A细胞后10天可观察到细胞病变效应（CPE）。CPE的特征表现为出现细胞变大、变圆并开始脱落的区域，同时感染标志物GFP表达水平较高。CPE的程度反映了病毒生成的效率。表现出类似CPE的细胞培养板可在24至72小时内进行收获，并通过反复冻融循环制备粗制病毒裂解液。随后可通过病毒裂解液的系列稀释测定病毒滴度，以便使用相同的感染复数（MOI）进行感染实验的比较（图4）。在呈线性关系的范围内，可利用回归分析方程计算每毫升未稀释病毒裂解液中的感染性病毒颗粒数量。在本示例中，当x = 1 μl时，滴度为30,016,535 μl^-1 ≈ 3 × 10¹⁰ ml^-1。

评估腺病毒感染对T细胞活化与.......

讨论

病毒的制备与滴定

为了获得最佳的转染效果，线性化载体的质量和用量似乎最为重要。我们发现，初始培养物的过度生长对初级裂解液的制备没有负面影响，因为一旦病毒高效产生，感染过程将迅速进行。然而，插入片段过长可能会影响HEK293A细胞的病毒产量，从而降低效率。实际上，某些开放阅读框被发现会干扰病毒的产生。这些病毒储备液通常可通过多轮扩增得以挽救，仅有少数开放阅读框被发现与病毒产生不兼容。根据我们的经验，在病毒扩增感染后48小时内出现细胞病变效应（CPE），通常可获得约1 × 10⁹ - 5 × 10¹⁰ 个感染性颗粒/mL的病毒裂解液。

初始T细胞的腺病毒感染

腺病毒感染初始T细胞不会改变T细胞在刺激前后活化状态，这使得该转导系统成为研究T细胞从初始TCR刺激开始分化的有力实验工具。我们已确定，在感染后T细胞静息40小时时，目标基因可实现高效异位表达，此时细胞仍处于初始状态，且无活化迹象。这意味着在后续T细胞活化过程中，目标基因已在早期过表达，能.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
pENTR/D-TOPO 克隆试剂盒	Invitrogen	K240020
Gateway LR Clonase II 酶混合物	Invitrogen	11791020
PacI	New England Biolabs	R057S
jetPEI	Polyplus-transfection	101-10N
HEK293A 细胞系	Invitrogen	R705-07
A549	ATCC	CCL-185
6 孔板	BD Falcon	353046
14 cm 组织培养皿	Nunc	168381
BALB/cJ-Tg(DO11.10)10Dlo Tg(CARΔ1)1Jdgr	Taconic Farms	Model Nr. 4285
初始型 CD4+ T 细胞分离试剂盒 II	Miltenyi Biotech	130-094-131
DMEM	Invitrogen	41966-052
FBS	PAN Biotech	1502-P110704
青霉素-链霉素（PenStrep）	Invitrogen	15140-122
RPMI 1640	Lonza	BE12-167F
丙酮酸钠（NaPyruvate）	Lonza	BE13-115E
非必需氨基酸（NEAA 100x）	Lonza	BE13-114E
L-谷氨酰胺	Invitrogen	25030
HEPES 缓冲液（1 M）	Invitrogen	15630-056
β-巯基乙醇	Sigma-Aldrich	M-7522
MEM 必需维生素混合物（100x）	Lonza	13-607C
Dynabeads 小鼠 T 细胞激活剂 CD3/CD28（用于细胞扩增与激活）	Invitrogen	114-56D
重组人 TGF-β1	R&D Systems	240B
Proleukin S（18 × 10⁶ IE）	Novartis
LIVE/DEAD 可固定蓝色死细胞染色试剂盒	Invitrogen	L-23105
小鼠 BD Fc 封闭剂	BD Pharmingen	553141
抗小鼠/大鼠 Foxp3 PE	eBioscience	12-5773-82
Mmu-miR-155 TaqMan microRNA 检测试剂	Roche Applied Biosystems	4427975
LightCycler 480 探针 Master 混合液	Roche Applied Biosystems	04902343001
TaqMan microRNA 反转录试剂盒	Roche Applied Biosystems	4366596