糖原的生化滴定 体外

摘要

我们在此介绍一种准确、可重复且便捷的生化方法，用于糖原的滴定 体外该技术采用Abcam糖原检测试剂盒，基于将糖原逐步水解为葡萄糖，并通过荧光法测定葡萄糖含量。

摘要

糖原是脊椎动物体内葡萄糖的主要储能聚合物，在整体机体代谢和细胞代谢中均发挥关键作用。目前已存在多种检测糖原的方法，但仅有少数具备定量能力。本文介绍一种采用Abcam糖原检测试剂盒的方法，该方法基于糖苷淀粉酶特异性将糖原降解为葡萄糖。随后，葡萄糖被特异性氧化为一种产物，该产物与OxiRed探针反应生成荧光信号。该滴定法准确、灵敏，可用于细胞提取物或组织切片。然而，与其他技术相比，该方法无法提供糖原在细胞内分布的信息。作为该技术的应用示例，本文描述了在常氧（21% O₂）与低氧（1% O₂）条件下培养的两种细胞系——中国仓鼠肺成纤维细胞CCL39和人结肠癌细胞LS174中糖原含量的测定。我们假设低氧是一种信号，可促使细胞合成并储存糖原以维持生存¹。

引言

糖原是由葡萄糖残基组成的多分支聚合物，存在于多种细胞类型的细胞质中。它是细胞内主要的能量储存形式之一，在葡萄糖代谢中发挥重要作用。大多数哺乳动物细胞均能合成并储存糖原，可在代谢应激期间迅速降解为葡萄糖，以促进糖酵解和ATP的生成。肝细胞可大量合成糖原，通过调节血糖水平，为机体持续提供葡萄糖。相比之下，其他细胞（如肌肉细胞、红细胞）中的糖原浓度较低， 等等。相对较低。然而，在局部范围内，这些数量足以提供能量 短期暴露于营养缺乏环境时，细胞会受到突然影响。

糖原合成与糖原分解在所有组织中遵循相同的步骤图1首先，葡萄糖通过葡萄糖转运蛋白（GLUTs）进入细胞，并由磷酸葡萄糖变位酶迅速将葡萄糖-6-磷酸（G6P）转化为葡萄糖-1-磷酸（G1P）。随后，G1P被修饰为UDP-葡萄糖，UDP-葡萄糖的C1碳原子连接到糖原蛋白（glycogenin）——糖原的锚定蛋白——的酪氨酸残基上。这一分子被视为糖原引物，通过将UDP-葡萄糖连接到引物末端葡萄糖的α(1→4) 键合 通过 糖原合成酶。最后，当形成一条含有超过11个葡萄糖残基的线性链时，分支酶会将至少由6个葡萄糖残基组成的末端寡糖链通过α(1→6)糖苷键转移至邻近链上的另一个葡萄糖残基上。这一过程的重复进行形成具有大量分支的分形结构，其分支以每圈6.5个葡萄糖残基的方式盘绕成螺旋。糖原可通过去分支酶的协同作用被逆向水解为葡萄糖，这些酶可水解 α(1→6) 结合的糖原磷酸化酶，该酶可水解 α(1→4) 糖原分子分支末端的葡萄糖残基与糖原分子之间的糖苷键。这一反应称为糖原分解，可被AMP水平升高（反映ATP消耗）所激活，并被葡萄糖和ATP所抑制^2,3.

通过电子显微镜观察，糖原分子在多种细胞类型中被描述为直径15-30 nm的β自由颗粒（或称糖原单颗粒）。在肝细胞等特定细胞类型中，β颗粒可组装成复合物，形成直径从80 nm到最大200 nm不等的花环状结构，也称为α颗粒⁴。目前尚不完全清楚这些β颗粒如何结合形成更大的α颗粒簇。一些证据表明，β颗粒可能通过共价键⁵、氢键，甚至通过蛋白质-蛋白质相互作用而连接⁶。细胞中储存的糖原量取决于多个因素：（I）细胞内启动糖原合成的糖原蛋白（glycogenin）含量；（II）由蛋白质磷酸化/去磷酸化调控的糖原合酶和磷酸化酶的活性；（III）细胞内葡萄糖浓度，后者受多种因素影响，如血管系统对葡萄糖的供应以及细胞对葡萄糖的摄取。糖原的储存受到生物合成激素通过中间代谢物的变构调节、调控能量代谢的激素以及营养感应信号通路的严密调控⁷。

准确量化生物样品中的糖原含量对于深入理解糖原代谢在整体机体及细胞水平上的重要性至关重要。本文介绍了一种精确、可重复且便捷的生化方法 体外 糖原测定法。该技术基于在糖原特异性水解前后对葡萄糖荧光的定量分析。

目前存在其他方法可用于估计细胞内糖原的含量，但大多数方法不具备定量能力。最早用于细胞糖原定量的技术之一是基于测量[¹⁴C]-葡萄糖掺入糖原的量^8,9。该方法涉及放射性物质的使用，操作较为复杂，但其优势在于能够提供葡萄糖掺入糖原的速率，并可区分葡萄糖残基在糖原分子外支链与核心区域的分布（该方法还需额外进行β-淀粉酶解和色谱步骤）。另一种较新开发的技术基于2-NBDG（2-{N-[7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑-4-基]氨基}-2-脱氧葡萄糖）——一种荧光标记的2-脱氧葡萄糖衍生物——掺入糖原的过程¹⁰。所测得的荧光强度反映了生成糖原的量，可通过荧光读板仪进行检测。此外，还可通过共聚焦显微镜评估细胞内荧光的分布情况。

在其他非定量技术中，过碘酸-希夫染色法（PAS）可能是最常用的一种。该方法可用于检测固定细胞、石蜡包埋组织切片或冰冻组织切片中的糖原。这种组织化学技术可非特异性地将多糖、糖脂、糖蛋白、纤维素和中性黏液物质染成紫色。通过在染色前用淀粉酶处理固定细胞或组织切片，可提高该检测的特异性，因为淀粉酶能特异性降解糖原。随后，可通过比较未经水解的样本（含所有糖类修饰的大分子）与经水解处理的样本（除糖原外的糖类修饰大分子）来定性评估糖原水平。与生化法测定糖原不同，PAS染色结合显微镜分析可提供糖原在细胞内分布的信息，这种分布可能是弥散的，也可能集中在细胞的特定区域。然而，尽管PAS染色能够估计不同条件下糖原积累的差异，但它并不具备定量能力¹¹。

一种最初以下颌髁软骨作为抗原制备的单克隆小鼠抗体已被证实可与细胞内的糖原及纯化的糖原发生反应 体外¹²由于该抗体可特异性识别糖原相关的糖链，因此在免疫组织化学中用于糖原检测时，其特异性优于PAS染色法。

电子显微镜是另一种可用于观察细胞内糖原颗粒并评估糖原储存程度的技术。事实上，糖原β颗粒在电子显微镜下易于识别，表现为电子密度高的颗粒¹。

方案

糖原的生化滴定

1. 细胞裂解

1. 以每100 mm直径培养皿0.5–2 × 10⁶的浓度接种细胞。
2. 处理：将细胞在低氧浓度（缺氧）条件下于厌氧工作站（Bug-Box anaerobic work station，Ruskinn Technology Biotrace International Plc，Bridgend，UK）中培养24、48或72小时，气体环境设置为1%或0.1% O₂、94%或94.9% N₂以及5% CO₂。同时，将对照组细胞置于常氧条件（21% O₂，5% CO₂）下培养。每24小时更换一次培养基（含25 mM葡萄糖的培养基），以尽量减少实验期间葡萄糖浓度的变化。
3. 处理结束后，用PBS洗涤细胞2次，以去除培养基中残留的葡萄糖。用预冷的PBS刮取细胞。
4. 将细胞悬液在1,000 rpm下离心5分钟，弃去上清液，并用PBS洗涤沉淀一次。沉淀物可在继续实验前于-20 °C冷冻保存。
5. 将沉淀重悬于100 μl蒸馏水中。加入Glycogen Assay Kit（Abcam）提供的100 μl糖原水解缓冲液。将裂解液在95 °C下煮沸5分钟，以灭活酶活性。
6. 涡旋振荡后，在13,000 rpm下离心10分钟，去除不溶性物质，保留上清液。
7. 为将糖原水平归一化至各样本间的蛋白含量，可取25–35 μl上清液，使用双辛可宁酸法（BCA-Interchim）进行蛋白质定量。

可使用部分裂解液来测定细胞内的游离葡萄糖浓度。

2. 糖原的水解

1. 将50 μl上清液（步骤1）与1 μl水解酶混合液混合。该混合液含有葡萄糖淀粉酶。在室温下孵育30分钟。
2. 使用试剂盒提供的标准糖原（2 mg/ml）用水解缓冲液稀释至10 μg/ml，制备标准曲线。随后，准备六个独立的试管，分别加入0、4、8、12、16和20 μl的10 μg/ml标准品，并用水解缓冲液补足各管至终体积50 μl，使糖原浓度分别为0、0.04、0.08、0.12、0.16和0.2 μg/ml。向各标准品中加入1 μl水解酶混合液，在室温下孵育30分钟。

为了确定细胞内糖原的水平，必须从总葡萄糖浓度（来自糖原水解的葡萄糖 + 游离葡萄糖）的数值中减去细胞系的背景葡萄糖浓度（即游离葡萄糖浓度的数值）。

3. 荧光的产生与读取

1. 每种条件下，准备一个试管（试管1）用于测定游离葡萄糖浓度，以及两个试管（试管2和试管3）用于测定总葡萄糖浓度（每个试管加入不同体积的水解糖原）。
2. 加入15 μl在步骤1结束时提取的上清液 在1号管中，加入35 μl水解缓冲液，使终体积达到50 μl。所得荧光值将反映游离葡萄糖浓度。
3. 添加 X μl 水解糖原（步骤2中获得）加入2号管中。调整终体积至50 μl。样品体积（X μl) 需根据细胞密度和/或细胞类型进行调整，以确保获得的荧光值不超过标准曲线的浓度范围。
4. 加入2X 3号管中加入水解糖原的μl数。调整终体积至50 μl。
5. 通过将每管中加入48.7 μl显色缓冲液、1 μl显色酶混合液和0.3 μl OxiRed探针（均来自糖原检测试剂盒），配制用于样品和标准品的显色溶液。例如，针对2个实验条件，需配制12管混合液（6管用于标准品，2管用于游离葡萄糖，4管用于总葡萄糖荧光检测）。
6. 向每支试管中加入50 μl该混合液，于室温避光孵育30分钟。
7. 测量荧光强度 激发波长为535 nm，发射波长为587 nm（按推荐设置），激发和发射狭缝均为3 nm。

结果

肿瘤中的低氧水平（缺氧）会向肿瘤细胞发出信号，提示其需要储存能量以应对后续的营养耗竭，从而维持生存。由于糖原是哺乳动物细胞中葡萄糖主要的能量储存多聚体，我们研究了缺氧条件下糖原储存的调控机制。细胞裂解液中糖原浓度的计算与标准化必须基于荧光原始数据进行，如表1、表2和表3所示。生化糖原检测证实，在CCL39细胞的电子显微照片中观察到的电子致密聚集体（图2A）即为糖原颗粒（图2B）。缺氧条件下糖原的积累依赖于缺氧诱导因子-1（HIF-1）这一转录因子，HIF-1是细胞适应缺氧过程中的主要转录调控因子（图3）。最后，我们在多种癌细胞和非癌细胞系中证明，储存的糖原可在6小时内被细胞迅速代谢（图4A），并且在葡萄糖饥饿条件下，糖原的利用可保护细胞免于死亡（图4B）¹。

讨论

糖原的生化滴定 体外 可实现对细胞糖原含量的精确定量。相较于其他一些技术（PAS染色、使用糖原抗体的免疫荧光染色）， 等等然而，该滴定法具有高度特异性、灵敏性和可重复性。此外，该方法操作便捷，无需使用放射性物质，仅需荧光分光光度计即可完成。但该技术仅为定量分析，无法提供细胞内糖原分布的信息。

本文所述技术适用于细胞提取物，但通过适当的组织糖原提取方法，也可应用于组织切片。该检测用于 体外 应用，且由于糖原的测定是间接的（水解为葡萄糖后测定），因此无法用于动态监测糖原储存情况 体内.

PAS染色已广泛用于诊断多种糖原累积病（von Gierke病、Cori病、McArdle病）， 等等。也可用于检测真菌感染或区分不同类型的肿瘤亚型。理论上，过碘酸-雪夫染色（PAS染色）可与图像分析仪联用以测定糖原浓度。然而在实际操作中，该技术难以实施，且相较于本文所述方法存在以下不足：首先，PAS阳性染色（紫红色）与阴性染色（苏木精-蓝色）存在颜色重叠，技...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂
DMEM	Invitrogen	31966.047
糖原检测试剂盒	Abcam	ab65620
PBS
仪器
荧光分光光度计	PerkinElmer	LS 50B