原位 横行腹直肌皮瓣：一种皮肌缺血再灌注损伤的大鼠模型

摘要

游离组织移植广泛应用于重建手术中，以在肿瘤切除或创伤后恢复形态与功能。手术前对组织进行预处理可能改善手术效果。本文描述了一种在大鼠体内实施的原位横腹直肌皮瓣（TRAM），用于测试组织预处理策略。

摘要

游离组织移植是修复无法通过局部方法处理或需要复合组织修复的复杂缺损的重建外科金标准。缺血再灌注损伤（IRI）是导致游离皮瓣部分失败的已知原因，目前尚无有效治疗方法。建立该损伤的实验模型通常成本较高，不仅因为传统上需使用较大型哺乳动物，还由于操作技术难度大，通常需要经验丰富的显微外科医生参与。本出版物及视频展示了一种在大鼠中有效建立IRI模型的方法，该方法无需显微外科技术。该手术方案是一种 原位 腹直肌皮瓣（TRAM皮瓣）缺血-再灌注损伤模型，采用无创血管夹模拟该手术相关的缺血-再灌注损伤过程。使用激光多普勒成像（LDI）扫描仪评估皮瓣灌注情况，并利用图像处理软件Image J分析皮肤存活面积百分比，作为损伤程度的主要评价指标。

引言

本实验方案的目的是建立一种可靠且可重复的缺血-再灌注损伤模型，以模拟游离组织移植中观察到的缺血-再灌注损伤，从而为干预策略的研究提供平台。

游离组织移植是指将一块孤立的组织完全离断血管供应，随后通过将皮瓣断离的血管与受区部位的宿主血管进行吻合，实现该组织的自体移植。该手术称为游离组织移植术（FTT），所移植的组织被称为游离皮瓣。

游离组织移植是修复复杂复合缺损的金标准方法，当局部修复方案不适用或不可行时尤应采用此法。^1-4 缺血-再灌注损伤（IRI）在游离组织移植中不可避免，可导致皮瓣失败^5,6，目前尚无有效治疗方法。由于游离皮瓣手术属于择期手术，因此可在术前给予药物干预以诱导对缺血-再灌注损伤的预处理保护作用。

缺血-再灌注损伤（IRI）通过内皮细胞活化和代谢功能障碍⁷ 、毛细血管通透性增加及继发性间质水肿⁷、炎性细胞浸润⁸、炎性介质释放、活性氧物质生成⁹ 以及补体沉积¹⁰ ，导致微循环血流受损。这一复杂的缺氧及随后再灌注损伤过程最终引发细胞死亡。建立肌皮瓣缺血-再灌注损伤模型可用于评估预处理策略对临床结局的有效性。近期研究通过比较人体受试者中观察到的分子变化与现有动物模型数据，已证实动物IRI模型可作为人类IRI的可靠替代模型^10,11。

大鼠横行腹直肌皮瓣（TRAM）最早于1987年以德文¹² 发表，1993年¹³以英文发表。该模型因其成本低廉、稳定性好，被广泛用于研究减轻游离组织移植中缺血-再灌注损伤（IRI）的不同策略^14,17-22，并获得了广泛认可^13-25。大多数研究采用单蒂TRAM皮瓣模型，其血供基于腹壁下深动脉血管蒂^15-18,20-22。然而，由于各研究中使用的皮岛面积不同（10.5 - 30 cm²），术后随访时间长短不一（2 - 10天），导致数据难以直接比较。在这些研究的对照组中，皮瓣平均总坏死面积为69 ± 6.2%（均值 ± 标准误）。需要指出的是，这六项研究均使用腹直肌作为血管蒂的载体，但并未暴露、切断、显微吻合或夹闭血管。Zhang et al.²³ 描述了一种真正意义上的游离大鼠TRAM皮瓣模型，该模型基于腹壁上血管，皮瓣切取后切断血管，并将肌皮瓣转移至腹股沟区域血管进行显微吻合。这一技术难度较高，需吻合管径为0.45 - 0.5 mm的血管。该研究共实施15例，其中67%的皮瓣存活²³。Zhang et al.²³ 所描述的模型是人类游离TRAM皮瓣的良好模拟，因其真实再现了游离组织移植（FTT）过程中所发生的损伤。而其他已发表的大鼠TRAM皮瓣模型更准确地反映了人类带蒂TRAM皮瓣手术中的损伤情况，但未能准确模拟IRI，因为这些皮瓣并未经历缺血期后再灌注的过程——其血管蒂未被夹闭或切断，也未进行显微吻合。本方案及视频介绍了一种新的大鼠TRAM皮瓣游离组织移植模型，通过使用微型血管夹复制IRI过程。该模型对IRI的模拟比带蒂TRAM模型更为真实，同时技术难度低于显微吻合操作。微型血管夹已被移植研究领域广泛用于模拟实体器官移植相关的IRI^26-33；然而，将其应用于大鼠TRAM皮瓣模型尚属首次。

方案

所有手术均遵循英国政府内政部和爱丁堡大学兽医服务部门制定的指南进行。

1. 手术操作设置注意事项

1. 更换为清洁的手术服、手术衣、刷手帽和口罩。使用含2%氯己定的70%异丙醇清洁手术室所有表面及设备。
2. 手术前，将手术中使用的所有手术用品和器械进行高压灭菌。每次手术所需的无菌包应包括：3块手术巾、纱布、棉签、硅胶片及手术器械，参见特定手术材料与工具列表。 图1称重实验大鼠，并计算应皮下注射的布托啡诺剂量（0.04 mg/kg），在手术结束前1小时给予。准备以下物品：用于术中皮下补液的3支1 ml注射器、2根6-0 Vicryl缝线、1根5-0 Ethilon缝线、带刻度的无菌标记笔、10号一次性手术刀片、4–5副无菌手套以及手持电凝仪。
3. 将4个10 ml无菌的0.9%生理盐水小瓶置于37 °C温水浴中，用于皮下补液（1 ml/kg/hr）及冲洗手术部位。设置恒温毯、直肠探头、加热灯、手术显微镜和麻醉装置。打开激光仪及其软件，另设一套麻醉装置，并在动物扫描时所卧的黑色垫子下方放置加热垫。
4. 使用体重为250–300 g的雄性Lewis大鼠，在标准条件下饲养7天，自由摄食和饮水 随意摄取 在任何手术操作之前，均采用12小时光照-12小时黑暗循环。

2. 麻醉与皮肤准备

1. 将大鼠放入麻醉装置的诱导室中，以1 L/min的氧气流速给予4%异氟烷₂ 麻醉2-3分钟。将已麻醉的大鼠从麻醉舱中取出，仰卧置于洁净的加热垫上。通过鼻罩持续给予1.5%异氟烷维持麻醉。涂抹 Lacrilube 或类似制剂以防止术中角膜擦伤。在继续操作前，进行足垫夹捏试验以确认动物已充分麻醉。在手术过程中每个主要步骤前均需重复该测试，并根据结果相应调整吸入性麻醉剂浓度。
2. 使用电动剃须刀仔细剃除前腹部毛发，确保整个腹部表面暴露。根据供应商推荐的时间涂抹脱毛膏。随后去除脱毛膏，并用温热的无菌生理盐水彻底冲洗皮肤，以清除所有残留的脱毛膏。在皮肤上涂抹含70%异丙醇的2%氯己定溶液，待其自然干燥后再进行后续操作。此为本单位基于当前手术部位感染防控证据所采用的标准皮肤准备方法。³⁴ 请在选择皮肤准备方案前，与您所在单位的兽医部门讨论确定标准操作流程。
3. 在大鼠两侧各放置一块无菌巾，并注意保持其无菌状态。戴上无菌手套，在助手协助下打开无菌包装。将所有器械放置于一块无菌巾上，缝线、纱布、棉签、硅胶片以及带刻度的无菌标记笔放置于另一块无菌巾上。
4. 以剑突和尾部作为参考点确定中线。标记中线。在剑突下方0.8 cm处进行测量并标记该点。从该点画一条与中线垂直的线。以中线为中心，在中线左右两侧分别标记出1 cm和2 cm的位置。从这些点画出与中线平行的垂直线。在原始水平线下方4 cm处进行测量，并画出另一条与其平行的线。按照上述步骤，可划定一个4 cm × 4 cm的皮瓣，该皮瓣被均分为4条等宽的条带（见 图2).

3. 激光多普勒成像

1. 将大鼠小心转移至LDI扫描仪处第二个麻醉装置的鼻罩。继续以1.5%异氟烷、1 L/min氧气维持麻醉。₂打开激光器，并按照制造商的说明开始扫描。保存扫描文件后，将大鼠放回第一个装置，使用白色软石蜡作为润滑剂，重新插入恒温毯的直肠探针。

4. 原位 TRAM 皮瓣——IRI 的肌皮模型

1. 重新刷洗双手并戴上新的无菌手套。在剩余的无菌手术单中央剪出一个直径为5 cm的圆孔，将其覆盖在暴露的腹部区域，以形成一个有遮盖的无菌术野。
2. 沿左侧标记的纵向边缘做切口（图3A 和 B），实现止血。沿中线左侧的水平标记线做类似切口，同样完成止血。
3. 应可见覆盖于左侧下腹直肌鞘表面的脂肪组织。使用镊子和精细虹膜剪，小心地进入该脂肪层下方。注意避免损伤穿过左侧前腹直肌鞘的穿支血管。由此解剖分离所打开的层次，位于腹前壁筋膜的正上方。继续在此平面内沿已划定的边界进行解剖分离。在左侧髂窝处可见较大的浅表旋髂血管——可将其结扎或电凝处理。随后谨慎向内侧延伸解剖范围，但仅至左侧腹直肌的外侧缘为止。此时可见明显的颜色变化，由粉红色转为接近白色（图3C）。用无菌生理盐水仔细冲洗该区域，并确认已实现止血，然后用湿纱布覆盖该区域。
4. 在对侧重复上述操作，但此次解剖范围延伸至linea alba（中线）。注意识别并电凝处理从右侧腹直肌中央发出的所有肌皮穿支血管（图3D）。若未妥善处理，可能导致术后血肿及假性结果。同样完成止血、冲洗，并用湿纱布覆盖已掀起的皮瓣。
5. 返回至左侧前腹直肌的下缘（图3E 和 F），电凝最下方可见的穿支血管。使用显微剪刀和尖端弯曲的Graeffe镊子，在前腹直肌鞘上剪开一个小窗（约0.6 cm × 0.6 cm）。沿肌肉外侧缘缓慢钝性分离，直至肌肉变薄，但尚未穿透后鞘。随后旋转镊子，向内侧钝性分离，直至肌肉腹侧位于镊子弯曲部之上，而镊尖自由位于内侧边缘。将约6 cm长的5-0 Ethilon缝线送入镊子钳口中，结扎下腹直肌鞘。完成此步骤后，肌皮瓣即由单一优势血管——腹壁上深动脉和静脉供血。用湿纱布覆盖该区域。
6. 将硅胶片裁剪成边缘光滑的椭圆形（图3G）。其大小应足以覆盖皮瓣筋膜皮下部分暴露区域的大部分面积。但需注意确保皮肤边缘可在无张力状态下闭合，必要时可适当修剪椭圆内侧曲线，以防影响残余穿支血管的血流。随后使用6-0 Vicryl缝线将硅胶片固定（图3H），并用湿纱布覆盖。
7. 使用简单的间断5-0 Ethilon缝线将皮瓣“钉合”固定，以减少热量和水分丢失（图3I）。随后用湿纱布覆盖。
8. 将切口向上延伸至剑突左侧（图3I），并将其缝合固定于左上象限，以改善术野视野。
9. 切除任何覆盖的脂肪组织，暴露左侧上部前腹直肌鞘。在该鞘膜上剪开一个小窗（0.6 cm × 0.6 cm）（图3J）。将切口向内侧延伸，直至观察到肌纤维走向由垂直转为斜行，且组织由致密变为疏松纤细。
10. 小心将弯曲镊子插入这两块肌肉之间，通过钝性分离建立一个解剖平面。仅沿弯曲镊子的上表面小心切开，穿过左侧腹直肌肌腹，以暴露其下方的腹壁上深动脉和静脉（图3K）。
11. 在手术显微镜高倍放大下，使用显微器械小心分离动脉与静脉，并清除周围所有脂肪组织。
12. 在动脉和静脉上应用无创Acland夹（B-1，“V”型），并启动计时器，开始计算30分钟的缺血期。用温热生理盐水冲洗被夹闭的血管蒂，并用纱布覆盖。本研究未使用血管扩张剂如维拉帕米或罂粟碱，但若出现血管痉挛问题，应考虑使用此类药物。
13. 给予布托啡诺（0.04 mg/kg）及温热无菌生理盐水（1 ml/kg/hr）。
14. 从左上角开始，使用6-0 Vicryl皮下缝线将皮瓣缝合固定，至剑突处停止并打结。
15. 当30分钟缺血时间结束后，小心移除血管夹，并用温热生理盐水冲洗血管蒂。检查血流是否已恢复。请注意，该缺血时间由英国动物实验管理机构（UK Home Office）规定。其他地区的研究人员可能允许延长此时间，但延长缺血时间可能导致更差的临床结局。
16. 使用6-0 Vicryl缝线将腹直肌的切开边缘重新缝合复位。注意避免过度张力，以免导致血管扭曲。
17. 完成皮下缝合，注意将所有线结埋入皮肤下方（图3K）。
18. 清洁伤口区域并使其自然干燥。重新在皮瓣上绘制分区标记。
19. 对动物重新进行扫描，获取术后影像。
20. 再次在动物眼部涂抹Lacrilube，并将其置于37 °C温控孵育箱中恢复1小时，之后送回饲养单元。

方案中的关键步骤

该操作的关键在于识别深层的腹壁上血管。这一点在随附的视频中有清晰展示。简而言之，需在腹直肌前鞘上开一个窗口，以暴露其下方呈纵向走行的肌纤维。通过向内侧扩展对腹直肌前鞘的浅层解剖，可观察到肌纤维走向由纵向逐渐转变为斜向。将钝头弯型格拉夫钳（或类似器械）插入这两束肌纤维的交汇处，随后向侧方进行钝性分离。使用显微剪刀，在格拉夫钳所处的肌纤维束之间平面，沿其弯曲的上表面垂直剪开。取出格拉夫钳后，即可在腹直肌肌腹的中点处观察到深层的腹壁上动脉和静脉。使用显微器械剥离覆盖于血管表面的脂肪组织，并上夹止血。

大鼠TRAM皮瓣的筋膜皮部分足够薄，可使其像全厚皮肤移植物一样被吸收。为防止这种情况并确保建立真正的缺血-再灌注损伤（IRI）模型，需在皮瓣的筋膜皮部分下方放置一层薄而柔韧的硅胶片。³⁵ 此步骤已被其他开展大鼠TRAM模型研究的研究人员所采用。^17,21,25

大鼠会啃咬线结，因此务必确保所有缝线均为皮下缝合，且所有线结均埋入皮下。通过精细缝合，可避免其他研究人员所报道的皮瓣自噬现象。²⁴

给予布托啡诺后，将维持麻醉调整为1%异氟烷（1L/min O₂）。

结果

大鼠模型比大型动物模型更经济实惠³⁶，天生具有较强的抗病能力，且可进行基因操作。过去认为，皮肤松弛的动物（如啮齿类）与皮肤紧贴的动物（如人类和猪）在皮肤血供分布上存在差异。在皮肤松弛的动物中，皮肤主要由直接穿行于皮下脂肪层并到达表层皮肤的皮穿支血管供血（图4）；相比之下，皮肤紧贴的动物则通过穿行于深层肌肉中的血管，经肌皮穿支向表层皮肤组织供血（图4）。因此，人们曾担忧皮肤松弛的动物是否适用于皮瓣研究。然而，Taylor 关于血管区（angiosomes）的研究表明，大鼠皮肤中存在一些特定区域，其血供方式与人类相似，均通过肌皮穿支供血。腹前壁即为这样一个区域，临床上常用的横行腹直肌肌皮瓣（TRAM瓣）即基于此区域^37,36,15。

相关解剖结构

在大鼠中，腹壁上深血管是主要的血管蒂，有六到十条穿支血管穿过腹直肌前鞘，供应其上方的皮肤组织。^13,15 大鼠的腹壁上深血管在剑突水平进入腹直肌，并向耻骨方向...

讨论

修改与故障排除

本方案在实验系统中重现了游离组织移植中观察到的缺血-再灌注损伤（IRI），有助于进一步理解该过程，并为探索减轻IRI和改善预后的策略提供了途径。若改用非优势的深部下腹壁上血管蒂，或延长缺血时间，可轻易地造成更严重的损伤。

技术的局限性

大鼠的腹前壁皮下脂肪明显少于接受TRAM皮瓣乳房重建手术的大多数女性的腹前壁。本文所述模型专门用于模拟肌皮瓣中的缺血-再灌注损伤，以便通过皮肤坏死和灌注情况作为结局指标来评估预处理疗法的效果。本文详述的手术方法并未专门模拟在人类TRAM皮瓣中出现的脂肪坏死等问题，因为在进行较大乳房重建以形成足够突度时，常有意切取含有显著脂肪成分的皮瓣，从而导致此类问题的发生。

本方案未展示对微循环的直接体内观察，但该技术已在 cremaster 肌肉模型⁴⁸以及骨肌皮瓣模型中有所描述^7,49-51。TRAM 模型是一种肌皮瓣模型，如果...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Moor LD12 激光多普勒成像扫描仪			http://gb.moor.co.uk/product/moorldi2-laser-doppler-imager/8
完整的恒温毯系统，带柔性探头。小型。230 VAC，50 Hz		507221F	www.harvardapparatus.com
Graeffe 钳，0.8 mm 尖端，弯曲		11052-10	2, http://www.finescience.de
Acland钳		00398 V	B-1 ’V’ 用于动脉和静脉的图案钳。 http://www.merciansurgical.com/acland-clamps.pdf
钳夹施加器		CAF-4	http://www.merciansurgical.com/acland-clamps.pdf
双极电凝仪		726067	www.harvardapparatus.com
微血管扩张器 11 厘米 0.3 毫米尖端 00124		D-5a.2	http://www.merciansurgical.com
微型珠宝镊子 11厘米弯头 00109		JFA-5b	http://www.merciansurgical.com
微型珠宝镊子 11 厘米直头 00108		JF-5	http://www.merciansurgical.com
Acland单侧夹 B-1V（一对）		396	http://www.merciansurgical.com
显微剪圆柄 15 厘米直刃		67	http://www.merciansurgical.com
虹膜剪 11.5 cm 弯型 EASY-CUT		EA7613-11	http://www.merciansurgical.com
14厘米直刃斜面剪刀 EASY-CUT		EA7652-14	http://www.merciansurgical.com
德福持针器 12 cm TC		703DE12	http://www.merciansurgical.com
Ethilon 5-0		W1618	http://www.farlamedical.co.uk/
Vicryl rapide 6-0		W9913	http://www.millermedicalsupplies.com/
Instrapac - 阿德森有齿镊（超细）		7973	http://www.millermedicalsupplies.com/
Castroviejo持针器		12565-14	http://s-and-t.ne
加热灯			http://www.chicken-house.co.uk
0.3 毫米半透明硅胶片			http://www.silex.co.uk/
Image J 软件			http://rsbweb.nih.gov/ij/
蔡司 OPMI pico			http://www.zeiss.co.uk/
手术显微镜
兽医技术解决方案 异氟烷设备			http://www.vet-tech.co.uk/
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