带血管复合组织异体移植（VCA）已成为临床现实。然而，VCA 的广泛应用受到长期多药免疫抑制治疗的限制。作者介绍了一种可靠且可重复的大动物模型，用于转化新型免疫调节策略，以减少甚至可能消除 VCA 中对免疫抑制治疗的需求。
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本文内容
摘要
摘要
手部和面部移植等血管化复合组织异体移植（VCA）是治疗复杂肌肉骨骼创伤和严重组织缺损的有效治疗选择。尽管早期和中期功能结果良好且令人鼓舞，但VCA中高度免疫原性的皮肤成分可能发生排斥反应，以及长期多药联合免疫抑制可能带来的不良反应，仍阻碍着VCA的广泛临床应用。因此，这一新兴领域的研究需要聚焦于与VCA独特免疫学特征相关的转化研究，并致力于开发新的免疫调节策略，以在无需长期免疫抑制的情况下实现移植后的免疫调节和免疫耐受。
本文描述了一种可靠且可重复的转化型大动物VCA模型，该模型由主要组织相容性复合体（MHC）定义的猪异位后肢同种异体移植中的骨-肌-皮瓣组成。简言之，使用近红外激光血管造影技术在股前内侧区域识别出具有良好血供的皮瓣。在股血管蒂的基础上，获取其下方的肌肉、膝关节、股骨远端及胫骨近端。该异体移植物因其独特的免疫豁免特性，可同时被视为一种血管化复合组织移植（VCA）和血管化骨髓移植。移植物被移植至受体动物的腹壁皮下袋中，其皮肤部分外置于背部外侧区域，以便进行免疫监测。
三个外科团队以高度协调的方式同时开展手术，以缩短麻醉和缺血时间，从而提高该模型的效率，并减少实验方案中潜在的混杂因素。该模型为未来治疗策略的建立奠定了基础，旨在减少甚至消除血管化复合组织移植（VCA）中对长期多药免疫抑制治疗的需求。
引言
手部和面部移植等带血管复合组织异体移植（VCA）如今已成为临床现实，全球已成功实施了多例手部和面部移植手术12。尽管早期和中期结果良好且令人鼓舞2，但长期多药联合免疫抑制治疗的需求仍限制了其广泛临床应用。小鼠VCA模型的进展，包括超显微外科吻合技术和无缝线套管技术13, 3，为深入理解VCA中的同种免疫反应奠定了基础。基于对VCA免疫机制的进一步认识，已提出多种免疫调节方案用于临床应用，但这些方案需在大型动物模型中加以验证，以合理预测其在人体中的效果7。鉴于人类与猪在生理学和免疫学系统上的相似性6，猪VCA模型可被视为比犬类9和非人灵长类模型1更为可靠且经济的替代方案。
本文详细介绍了我们用于MHC定义的异种异位后肢移植猪模型的方法学，该模型为当前和未来旨在诱导对血管化复合组织移植（VCA）免疫耐受的免疫调节策略奠定了基础，从而拓展其临床应用。我们采用经过充分表征的近交系猪，其在猪白细胞抗原（SLA）基因座上具有纯合性，专为移植相关研究而培育11。基于股动静脉构建一个带血管的骨-肌-皮瓣，该皮瓣包含远端股骨和近端胫骨中完整的带血管骨髓。移植物还包括股前内侧的大腿皮肤，并将其移植至受体动物背外侧部位，以便对VCA中免疫原性最强的组分进行免疫监测。将皮肤移植物置于背外侧位置有利于在站立和坐卧体位下进行临床检....
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方案
在本视频出版物中，所有动物实验操作均依照约翰斯·霍普金斯大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的动物实验方案进行。
1. 术前规划
- 在我们的肢体异体移植转化研究中，使用MHC定义的MGH近交系微型猪（15-20 kg），其中一只雄性供体为两只雌性受体提供肢体（图1）。手术前，由兽医对供体和受体动物进行全面的临床评估。
- 为尽量减少麻醉和缺血时间，供体和受体手术在同一专用大型动物手术室内，于三张手术台上同时进行。手术团队与兽医人员之间的团队协作与协调对于整个手术的成功至关重要。手术计划将在手术日前1-2周内与兽医团队召开正式会议进行讨论。
- 在移植前，为每只受体动物的外部或内部颈静脉置入带隧道的中心静脉导管（7 Fr双腔Hickman导管），用于免疫抑制药物浓度监测以及免疫抑制和/或免疫调节药物的静脉给药。这些导管通过直视下静脉切开技术置入，并经隧道从背部颈后上方穿出，使用单丝不可吸收缝线和颈部粘性绷带包扎固定。
- 术前至少12小时禁食（可自由饮水，但禁止固体食物）。
- 手术当天，通过肌内注射给予氯胺酮20 mg/kg和赛拉嗪2 mg/kg以实现动物镇静。
- 插入合适尺寸的气管插管，并连接至麻醉机和呼吸机（维持异氟烷浓度0.5-3%）。
- 在耳缘静脉置入静脉导管，并在整个手术过程中根据体重持续输注0.9%生....
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结果
采用我们改进的技术，共完成了24例根据SLA定义的猪异位后肢移植，平均缺血时间为78分钟（范围：62–94分钟）。所有动物均顺利完成了移植物植入及背外侧皮瓣的定位。近红外激光血管造影显示，所有受体的移植物灌注良好。最初的12例静脉吻合采用传统缝合技术完成，而后续12例静脉吻合则使用血管耦合装置完成。在采用传统缝合技术的一例动物中，术后即刻发现静脉血栓，需行再次吻合。使用耦合装置完成的所有吻合均未出现并发症。受体动物接受短期（30天）他克莫司单药治疗，部分动物联合供体骨髓（BM）输注及共刺激阻断治疗。他克莫司剂量根据血药浓度调整，目标浓度为10–15 ng/ml。仅接受短期他克莫司治疗及未接受治疗的动物作为对照组。基于共刺激阻断的免疫调节方案使移植后存活时间超过6个月。所有受体均未出现移植物抗宿主病（GVHD）的证据。所有长期存活者（移植后超过150天）在安乐死时均存在有活性的血管化骨髓，表明该模型在研究VCA中骨髓成分独特免疫学特征方面的可靠性（图7）。
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讨论
历史上，异位后肢移植方案包括将皮瓣外置于腹壁腹侧，血管采用端-侧吻合方式（Hettiarachty 2004）。然而，在我们改进的方法中，采用倒置皮瓣嵌入技术及端-端吻合，使皮瓣位置更偏向外侧，从而便于在动物直立状态下进行免疫监测。通过近红外激光血管造影识别腓肠动脉及灌注最充分的区域，进一步提高了皮瓣血供的可靠性。
在我们改进的技术中，通过在股动静脉之间进行端对端吻合，以尽量减少与显微血管吻合相关的技术失败。端对端吻合还使我们能够使用血管连接装置（Synovis St. Paul MN）进行静脉吻合，从而进一步缩短了热缺血时间。根据我们的经验，使用连接装置可使缺血时间更加可预测；由于缺血时间的变异与免疫学结果直接相关，这一改进提高了该模型的可靠性。然而，使用连接装置会增加材料成本，但考虑到手术的总体成本以及避免潜在并发症的优势，仍被认为具有成本效益。
我们的异位下肢移植术后立即产生了循环中的供体来源骨髓细胞，这一点通过针对雄性供体SRY基因的定量PCR分析得到证实。此外，通过免疫组织化学方法证实了长期存活受体中移植物骨髓成分的.......
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
我们谨向以下人士对本项目所做出的贡献表示感谢：Kakali Sarkar博士、Joani Christensen理学学士、Kate Buretta理学学士、Nance Yuan理学学士、William Lehao医学博士、Johanna Grahammer、Georg Furtmüller医学博士、Erin Rada医学博士、Mohammed Al-Rakan医学博士、Karim Sarhane医学博士、Saami Khalifian理学学士、Mao Qi医学博士，以及Angelo Leto Barone医学博士，VCA实验室，约翰斯·霍普金斯大学医学院整形与重建外科系；Janis Taube医学博士、Mark Fischer医学博士，约翰斯·霍普金斯大学医学院皮肤病学与病理学系；Sue Eller，约翰斯·霍普金斯大学医学院微创手术培训中心；以及林承宏医学博士，长庚纪念医院林口院区，中国台湾。
资助来源：军队再生医学研究所（美国国防部 W81XWH-08-2-0032）
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 试剂 | |||
| HTK | Custodial | N/A | |
| 设备 | |||
| 电动摆锯 | Synthes, Westchester PA | 05.001.011 | 往复锯 |
| 血管吻合装置 | Synovis, Newtown PA | 21003B |
参考文献
- Barth, R. N., Rodriguez, E. D., Mundinger, G. S., et al. Vascularized bone marrow-based immunosuppression inhibits rejection of vascularized composite allografts in nonhuman primates. Am. J. Transplant. 11 (7), 1407-1416 (2011).
- Brandacher, G., Gorantla, V. S., Schneeberger, S., et al.
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重印与许可
