我们描述了用于研究13.56 MHz射频（RF）电场与金纳米颗粒胶体在非生物和生物系统（体外/体内）中相互作用的实验方案。这些相互作用正在被探索用于癌症治疗的应用。
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本文内容
摘要
摘要
相较于现有疗法，毒性更低且侵入性更小的癌症治疗方法备受期待。目前，研究正在探索一种可行的非侵入性癌症治疗手段，即利用能够深入穿透人体组织并产生极小毒性的射频（RF）电场。人们设想，射频能量与细胞内化的纳米颗粒（NPs）相互作用后可释放热量，进而导致细胞过热（热疗），最终引发细胞坏死。
对于非生物系统，我们提供了与高浓度纳米颗粒胶体释放热量的定量分析相关的详细实验方案。对于生物系统，在以下情况下 体外 实验中，我们描述了必须遵循的技术与条件，以在有效将癌细胞暴露于射频能量的同时，避免因培养基整体加热而产生显著干扰，从而影响数据准确性。最后，我们提供了一套详细的方法学方案 体内 具有异位肝癌肿瘤的小鼠模型
引言
生物组织由于其固有的电容率，会吸收射频（RF）能量，导致组织温度随时间升高，最终因过热而引起细胞死亡。据推测，通过使用靶向纳米材料，使其进入癌细胞内部并作为射频-热能转换器，可在不损伤邻近健康正常细胞的前提下，优化癌症的热疗效果。已有若干研究报告表明，多种纳米颗粒（NPs）可作为有效的射频热源，促进癌组织坏死1-4。
在这些方面，金纳米颗粒（AuNPs）3-5碳纳米管1，以及量子点6, 7 在用于两者时表现出令人兴奋的特性 体外 和 体内 射频实验。尽管这些纳米颗粒在暴露于射频场时的确切加热机制仍存在争议，但一系列使用金纳米颗粒（AuNPs）的基础实验已表明，纳米颗粒的尺寸和聚集状态均具有重要意义。研究表明，只有直径大于一定阈值的金纳米颗粒才表现出显著的加热效应。 <10 nm 在暴露于射频场时会发热8此外，当金纳米颗粒（AuNPs）发生聚集时，这种加热机制会显著减弱。该聚集状态也在以下条件下得到验证： 体外 在内涵体-溶酶体细胞内区室中注重优化金纳米颗粒胶体稳定性的模型，以实现有效的射频治疗4然而，用于收集和评估此类数据的技术与实验原理可能存在一些问题，尤其是在验证来自纳米颗粒胶体的射频热分布时。
已有若干研究报告表明，纳米颗粒（NPs....
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方案
完整的实验概述如图1所示。
更多细节见下文步骤1-3。
1. 评估纳米颗粒胶体的射频加热效应：以金纳米颗粒为例
- 通常情况下，针对每种待研究的纳米颗粒（NP）样品，首先使用去离子水（DI水）通过离心过滤法对样品进行多次洗涤，以去除背景离子和污染物。当洗脱液的射频加热速率（HRs）与去离子水相近时，表明金纳米颗粒（AuNP）悬浮液中的所有离子和污染物已被清除。该纯化过程还有助于获得更高浓度的纳米颗粒。值得注意的是，尽管本示例中使用的是AuNPs，但其基本 原理 同样适用于其他纳米颗粒材料。
- 以一个具体示例说明：对一瓶500 ml市售的直径为5 nm的AuNPs进行纯化，随后将其暴露于频率为13.56 MHz、电场强度为90 kV/m的射频（RF）场中。
- 从原始AuNP溶液中取出约125 ml，平均分装至六个50 kDa的离心过滤管中，以3,000 rpm离心2分5秒。弃去滤出的缓冲液，并重新加入原始溶液至各滤管中。重复此步骤，直至全部500 ml溶液完成过滤。
- 将滤出的缓冲液替换为等体积的去离子水，并重复洗涤约8次（或直至滤出液的射频加热速率与去离子水相当）。注意，也可采用紫外-可见光谱（UV-Vis）分析来监测污染物的吸收峰。当缓冲液中的污染物完全去除后，向每个滤管中加入约0.5 m....
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结果
1. 评估纳米颗粒胶体的射频加热效应：以金纳米颗粒（AuNPs）为例。
完成1.1至1.2.3节的操作后，应获得高度浓缩、稳定且纯化的5 nm和10 nm直径金纳米颗粒（AuNPs）溶液。从500 ml的原始购买溶液中，预计至少可获得4 ml浓度为1,000 mg/L的溶液。在此浓度下，5 nm和10 nm AuNPs与背景去离子水缓冲溶液之间的升温速率（HRs）差异应分别约为0.25 °C/sec和0.1 °C/sec，如图2所示。
2. 纳米颗粒辅助射频诱导热疗：体外研究
理想情况下，实验结果应显示，暴露于射频场且已内化金纳米颗粒（AuNPs）的细胞，其存活率低于未内化金纳米颗粒但同样暴露于射频场的细胞。此类预期结果的示例如图3所示。
3. 纳米颗粒辅助射频诱导热疗：体内研究
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讨论
这些实验方案使研究者能够全面分析纳米材料（本实验中为AuNPs）在射频诱导的热疗用于癌症治疗时所起的作用程度。第一个方案专门针对高浓度且高纯度AuNP样品的产热情况进行分析。尽管其他研究组主要报道了AuNPs悬浮缓冲液本身的产热效应，而非AuNPs自身的产热9-11，但这些研究使用的AuNP浓度较低，粒径>10 nm，同时射频系统的运行功率较低，电场强度<90 kV/m，不足以观察到AuNPs明显的射频加热效应。只有严格遵循本报告中列出的实验方案和参数，研究者才能观察到这种纳米尺度的产热现象。
的 体外 该部分可用于研究细胞-射频-纳米颗粒界面的构建，以优化射频/纳米颗粒诱导的热疗效果。在加入AuNPs并进行射频照射之前，应观察到相关癌细胞系（此处为Hep3B）形成良好的二维单层贴壁生长。然而，每种细胞系所需的合适射频照射时间需在正式实验前通过在不同时间点对细胞施加射频场来预先确定。 例如 2-8 分钟），并在 24 小时后观察其存活率。应选择细胞存活率约为 80% 的射频暴露时间。对于 Hep3B 细胞，该时间.......
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披露
我们没有需要披露的内容。
致谢
本工作由美国国立卫生研究院（NIH，项目号U54CA143837）、美国国立卫生研究院MD安德森癌症中心支持基金（CA016672）、V基金会（SAC）以及Kanzius研究基金会（SAC，宾夕法尼亚州伊利市）提供的一项非限制性研究资助支持。我们感谢MD安德森癌症中心外科肿瘤学系的Kristine Ash在行政事务方面提供的协助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 试剂/材料 | |||
| 500 ml 金纳米颗粒（5 nm） | Ted Pella, INC | 15702-5 | |
| Amicon Ultra-4/-15 离心过滤装置（50 kDa） | Millipore | UFC805024/UFC910096 | （4 ml 和 15 ml 容量） |
| MEM X1 细胞培养基 | Cellgro | 10-101-CV | （根据需要添加额外营养成分） |
| 胎牛血清 | Sigma | F4135-500 ml | |
| 铜胶带 | Ted Pella | 16072 | |
| 设备 | |||
| Kanzius 射频系统（13.56 MHz） | ThermMed, LLC, Inc. (Erie, PA, USA) | ||
| 红外相机 | FLIR SC 6000, FLIR Systems, Inc. (Boston, MA, USA) | 联系 FLIR | |
| 1.3 ml 石英比色皿 | ThermMed, LLC, Inc. (Erie, PA, USA) | ||
| 带旋转台的聚四氟乙烯样品架 | ThermMed, LLC, Inc. (Erie, PA, USA) | ||
| SPECTROstar Nano 微孔板读取仪 | BGM Labtech | ||
| 紫外-可见光谱仪 | Applied Nanofluorescence, Houston, TX | NS1 NanoSpectralyzer | |
| ICP-–S | PerkinElmer | Optima 4300 DV | |
| Zetasizer | Malvern | Zen 3600 Zetasizer |
参考文献
- Gannon, C. J., et al. Carbon nanotube-enhanced thermal destruction of cancer cells in a noninvasive radiofrequency field. Cancer. 110, 2654(2007).
- Curley, S. A., Cherukuri, P., Briggs, K., Patra, C. R., Upton, M., Dolson, E., Mukherjee, P.
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重印与许可
