用于无创热疗癌症治疗中评估射频与金纳米颗粒及生物系统相互作用的实验方案

摘要

我们描述了用于研究13.56 MHz射频（RF）电场与金纳米颗粒胶体在非生物和生物系统（体外/体内）中相互作用的实验方案。这些相互作用正在被探索用于癌症治疗的应用。

摘要

相较于现有疗法，毒性更低且侵入性更小的癌症治疗方法备受期待。目前，研究正在探索一种可行的非侵入性癌症治疗手段，即利用能够深入穿透人体组织并产生极小毒性的射频（RF）电场。人们设想，射频能量与细胞内化的纳米颗粒（NPs）相互作用后可释放热量，进而导致细胞过热（热疗），最终引发细胞坏死。

对于非生物系统，我们提供了与高浓度纳米颗粒胶体释放热量的定量分析相关的详细实验方案。对于生物系统，在以下情况下 体外 实验中，我们描述了必须遵循的技术与条件，以在有效将癌细胞暴露于射频能量的同时，避免因培养基整体加热而产生显著干扰，从而影响数据准确性。最后，我们提供了一套详细的方法学方案 体内 具有异位肝癌肿瘤的小鼠模型

引言

生物组织由于其固有的电容率，会吸收射频（RF）能量，导致组织温度随时间升高，最终因过热而引起细胞死亡。据推测，通过使用靶向纳米材料，使其进入癌细胞内部并作为射频-热能转换器，可在不损伤邻近健康正常细胞的前提下，优化癌症的热疗效果。已有若干研究报告表明，多种纳米颗粒（NPs）可作为有效的射频热源，促进癌组织坏死^1-4。

在这些方面，金纳米颗粒（AuNPs）^3-5碳纳米管¹，以及量子点^{6, 7} 在用于两者时表现出令人兴奋的特性 体外 和 体内 射频实验。尽管这些纳米颗粒在暴露于射频场时的确切加热机制仍存在争议，但一系列使用金纳米颗粒（AuNPs）的基础实验已表明，纳米颗粒的尺寸和聚集状态均具有重要意义。研究表明，只有直径大于一定阈值的金纳米颗粒才表现出显著的加热效应。 <10 nm 在暴露于射频场时会发热⁸此外，当金纳米颗粒（AuNPs）发生聚集时，这种加热机制会显著减弱。该聚集状态也在以下条件下得到验证： 体外 在内涵体-溶酶体细胞内区室中注重优化金纳米颗粒胶体稳定性的模型，以实现有效的射频治疗⁴然而，用于收集和评估此类数据的技术与实验原理可能存在一些问题，尤其是在验证来自纳米颗粒胶体的射频热分布时。

已有若干研究报告表明，纳米颗粒（NPs）所悬浮的背景离子溶液在焦耳加热过程中可能是射频（RF）热产生的主要来源，而非纳米颗粒本身^9-12。尽管我们近期发表的论文⁸已证实了射频相互作用可用于产生直径小于10 nm的金纳米颗粒（AuNPs）的热效应，但本文旨在更详细地描述这些实验方案。

我们还展示了评估金纳米颗粒（AuNPs）作为热疗热敏剂有效性的所需方案与技术，适用于体外和体内环境。 体外 和 体内 用于肝癌模型的实验。尽管我们主要关注柠檬酸盐包被的金纳米颗粒（AuNPs）的简单胶体，但这些技术同样可应用于其他AuNP杂合体，例如抗体偶联和化疗药物偶联的复合物。遵循这些原则，实验人员应能快速评估任何纳米材料作为射频诱导热疗剂的有效性潜力。

方案

完整的实验概述如图1所示。

更多细节见下文步骤1-3。

1. 评估纳米颗粒胶体的射频加热效应：以金纳米颗粒为例

1. 通常情况下，针对每种待研究的纳米颗粒（NP）样品，首先使用去离子水（DI水）通过离心过滤法对样品进行多次洗涤，以去除背景离子和污染物。当洗脱液的射频加热速率（HRs）与去离子水相近时，表明金纳米颗粒（AuNP）悬浮液中的所有离子和污染物已被清除。该纯化过程还有助于获得更高浓度的纳米颗粒。值得注意的是，尽管本示例中使用的是AuNPs，但其基本 原理 同样适用于其他纳米颗粒材料。
2. 以一个具体示例说明：对一瓶500 ml市售的直径为5 nm的AuNPs进行纯化，随后将其暴露于频率为13.56 MHz、电场强度为90 kV/m的射频（RF）场中。
   1. 从原始AuNP溶液中取出约125 ml，平均分装至六个50 kDa的离心过滤管中，以3,000 rpm离心2分5秒。弃去滤出的缓冲液，并重新加入原始溶液至各滤管中。重复此步骤，直至全部500 ml溶液完成过滤。
   2. 将滤出的缓冲液替换为等体积的去离子水，并重复洗涤约8次（或直至滤出液的射频加热速率与去离子水相当）。注意，也可采用紫外-可见光谱（UV-Vis）分析来监测污染物的吸收峰。当缓冲液中的污染物完全去除后，向每个滤管中加入约0.5 ml去离子水，并通过反复吹打使AuNPs充分重悬，以确保AuNPs完全从滤膜上洗脱下来。将六个重悬液合并至一个15 ml离心管中。
   3. 在AuNPs完成纯化和浓缩后，使用电感耦合等离子体发射光谱法（ICP-OES）和/或电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）、紫外-可见光谱（UV-vis）以及Zeta电位分析，分别测定其浓度和纳米颗粒稳定性。此外，也可采用扫描电子显微镜（SEM）和/或透射电子显微镜（TEM）分析获取形貌信息。这些技术的详细样品制备方法可参考相关文献⁴。
3. 使用先前研究中描述的Kanzius射频系统⁸或其衍生系统，将一个1.3 ml圆柱形石英比色皿置于射频场中，确保在无样品条件下空气中比色皿内部的射频电场强度约为90 kV/m。对于标准生理盐水样品（0.9 % NaCl），电场强度将降低至约1.1 kV/m。这些近似条件可用于不同系统之间的结果比较。
   1. 用移液器将1.3 ml浓度为1,000 mg/l的纯化AuNP胶体溶液加入石英比色皿中，并将其置于射频场内。可使用定制的聚四氟乙烯（Teflon）样品支架完成此操作。将样品暴露于射频场中120秒，或直至温度升至70 °C，以避免发生电弧放电或剧烈沸腾。使用红外热成像相机及配套软件采集热成像数据（同时包括对照区域）。重复该过程三次。
   2. 将样品通过另一个50 kDa离心过滤管，以从去离子水缓冲液中回收AuNPs。再次将滤出的缓冲液暴露于射频场中，同样重复三次。AuNP胶体与背景去离子水缓冲液之间的加热速率差异，即为AuNPs本身所产生的加热速率。预期可获得约0.3 °C/sec和0.05 °C/sec的加热速率，从而计算出AuNPs依赖性的加热速率约为0.25 °C/sec。将滤膜上剩余的AuNPs重新悬浮于1.3 ml水中，用于体外/体内（in vitro/vivo）实验。

2. 纳米颗粒辅助射频诱导热疗：体外研究

1. 这些体外研究可应用于形成二维单层的任何类型的癌细胞。本实验使用人肝细胞癌来源的Hep3B细胞。
   1. 在12孔板的前三个孔中各接种约50,000个细胞，每孔加入1 ml培养基。重复6次（其中三块板用于纳米颗粒研究，另三块板作为对照）。在引入纳米颗粒前，于37.5 °C培养24小时。首先使用生物安全柜中的紫外光照射5分钟对纳米颗粒进行灭菌。
   2. 向每个实验孔中加入0.1 ml浓度为1,000 mg/L的AuNP溶液，继续培养24小时。向三个对照组细胞板的每孔中加入0.1 ml水，同样培养24小时。
   3. 24小时后，吸除细胞培养基，并用PBS洗涤以去除表面结合的AuNPs。更换新的细胞培养基。此时细胞已准备好接受射频照射。
2. 将每块12孔细胞板置于射频场中。等待细胞冷却至31 °C。开启射频发生器，照射3.5分钟。细胞培养基的最终温度将达到约37 °C。关闭射频场。取出细胞并放入培养箱中，在分析前继续培养24小时。
   1. 从培养箱中取出细胞，吸除培养基。向每孔加入1.6 ml细胞培养基以及0.4 ml MTT试剂。将细胞孵育4小时。吸除培养基，每孔替换为2 ml二甲基亚砜（DMSO）。将细胞板置于摇床上，静置10分钟，使DMSO充分溶解MTT产物。最后，用移液器将每孔中的100 μl溶液转移至96孔板中，使用酶标仪（如SPECTROstar Nano酶标仪）在570 nm波长下进行光吸收检测。

3. 纳米颗粒辅助射频诱导的热疗：体内研究

1. 这些 体内 该研究可应用于在原位或异位小鼠模型中形成实体瘤的任何类型癌症。本实验采用异位肿瘤BALB/C Nude小鼠模型，接种Hep3B肝癌细胞。
2. 注意：所有 体内 实验均遵照所有相关指南、法规及监管机构的要求进行。此外，本实验方案是在德克萨斯大学M.D. Anderson癌症中心机构动物照护与使用委员会（IACUC）的指导和批准下实施的。
   1. 在组织培养瓶中使用适当的生长培养基培养适量的细胞（约100,000个），于37 °C、5 % CO₂的培养箱中孵育。₂ 细胞培养的整个持续期间。
   2. 用胰蛋白酶处理细胞（使其从培养瓶上脱落），每25 μl制备含200万个细胞的细胞悬液。加入等体积预冷的Matrigel，充分混匀以制备最终的注射液。将该溶液注射至小鼠背部所需位置，并等待适当时间使肿瘤生长至目标大小（大多数细胞需2–4周）。在射频暴露前，BALB-C Nude小鼠应形成直径为0.5–1 cm的实体异位肿瘤。
3. 1. 通过腹腔注射氯胺酮和赛拉嗪混合溶液对实验用小鼠（此处为BALB-C Nude小鼠）进行麻醉。在小鼠进入麻醉状态期间，将其置于37 °C恒温控制的培养箱中。共需20只携带肿瘤大小相近的小鼠。其中10只小鼠将用于金纳米颗粒（AuNPs）处理组（另一组仅注射PBS），另外10只小鼠分为射频暴露组与非射频暴露对照组，均不注射AuNPs。
   2. 充分麻醉后，使用1 cc注射器配合27 G针头将AuNPs直接注射至肿瘤内。AuNP溶液应为每0.1 ml PBS中含有200 mg/L的Au。注射完成后，用外科纱布吸收血液，并以酒精棉片擦拭注射部位。
   3. 然后将待处理的小鼠固定在射频发生器的接收端，确保肿瘤部位最接近发射端。使用铜箔胶带屏蔽无需处理的区域以及眼睛、耳朵和脚趾等敏感部位。务必确保铜箔胶带与接地平面充分接触，以避免电荷积聚。此外，照射区域应留出至少比目标治疗部位大1 cm的间隙。
   4. 将红外热成像仪置于可观察到肿瘤及治疗区域的位置。开启射频治疗持续5分钟，记录相应的温度变化曲线。若治疗过程中温度超过42 °C，应立即停止治疗。
4. 1. 射频暴露后，将小鼠置于温暖的恢复室中从麻醉状态复苏，直至其恢复意识。
   2. 48小时后用同一批小鼠重复实验（步骤3.3.1 - 3.4.1）。
   3. 实验结束后，按照机构规定的方案对小鼠实施安乐死。记录肿瘤的重量。用于组织学分析时，使用甲醛固定肿瘤组织并进行石蜡包埋。肿瘤切片通常采用苏木精和伊红染色，并针对评估治疗效果相关的靶点进行检测。 例如 Ki-67、cleaved caspase-3 等等.

结果

1. 评估纳米颗粒胶体的射频加热效应：以金纳米颗粒（AuNPs）为例。

完成1.1至1.2.3节的操作后，应获得高度浓缩、稳定且纯化的5 nm和10 nm直径AuNPs溶液。从500 ml的原始购入储备液中，预期至少可获得4 ml浓度为1,000 mg/L的溶液。在此浓度下，AuNPs与背景DI水缓冲液之间的升温速率（HRs）差异应分别为约0.25 °C/sec和0.1 °C/sec，对应5 nm和10 nm AuNPs，如图2所示。

2. 纳米颗粒辅助射频诱导热疗：体外研究

理想情况下，结果应显示暴露于射频场且已内化金纳米颗粒（AuNPs）的细胞，其存活率低于未内化金纳米颗粒但暴露于射频场的细胞。此类预期结果的示例如图3所示。

3. 纳米颗粒辅助射频诱导热疗：体内研究

在注射...

讨论

这些实验方案使研究者能够全面分析纳米材料（本实验中为AuNPs）在射频诱导的热疗用于癌症治疗时所起的作用程度。第一个方案专门针对高浓度且高纯度AuNP样品的产热情况进行分析。尽管其他研究组主要报道了AuNPs悬浮缓冲液本身的产热效应，而非AuNPs自身的产热^9-11，但这些研究使用的AuNP浓度较低，粒径>10 nm，同时射频系统的运行功率较低，电场强度<90 kV/m，不足以观察到AuNPs明显的射频加热效应。只有严格遵循本报告中列出的实验方案和参数，研究者才能观察到这种纳米尺度的产热现象。

的 体外 该部分可用于研究细胞-射频-纳米颗粒界面的构建，以优化射频/纳米颗粒诱导的热疗效果。在加入AuNPs并进行射频照射之前，应观察到相关癌细胞系（此处为Hep3B）形成良好的二维单层贴壁生长。然而，每种细胞系所需的合适射频照射时间需在正式实验前通过在不同时间点对细胞施加射频场来预先确定。 例如 2-8 分钟），并在 24 小时后观察其存活率。应选择细胞存活率约为 80% 的射频暴露时间。对于 Hep3B 细胞，该时间...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂/材料
500 ml 金纳米颗粒（5 nm）	Ted Pella, INC	15702-5
Amicon Ultra-4/-15 离心过滤装置（50 kDa）	Millipore	UFC805024/UFC910096	（4 ml 和 15 ml 容量）
MEM X1 细胞培养基	Cellgro	10-101-CV	（根据需要添加额外营养成分）
胎牛血清	Sigma	F4135-500 ml
铜胶带	Ted Pella	16072
设备
Kanzius 射频系统（13.56 MHz）	ThermMed, LLC, Inc. (Erie, PA, USA)
红外相机	FLIR SC 6000, FLIR Systems, Inc. (Boston, MA, USA)	联系 FLIR
1.3 ml 石英比色皿	ThermMed, LLC, Inc. (Erie, PA, USA)
带旋转台的聚四氟乙烯样品架	ThermMed, LLC, Inc. (Erie, PA, USA)
SPECTROstar Nano 微孔板读取仪	BGM Labtech
紫外-可见光谱仪	Applied Nanofluorescence, Houston, TX	NS1 NanoSpectralyzer
ICP-–S	PerkinElmer	Optima 4300 DV
Zetasizer	Malvern	Zen 3600 Zetasizer