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方法文章

海马体小鼠脑片的改良制备与保存方法以实现长期增强作用的非常稳定且可重复的记录

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DOI：

10.3791/50483

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2013年6月26日

 , 
1Department of Neurosciences, Research Institute for Biosciences, University of Mons

本文内容

摘要

本文介绍了一种完整的方法，用于制备和保存 体外 成年小鼠急性海马脑片。该方案可实现超过8小时的稳定持久长时程增强（LTP）记录，成功率高达95%。

摘要

长时程增强（LTP）是一种突触可塑性，其特征是突触强度增加，被认为参与了记忆的编码过程。在急性海马脑片CA1区诱导的LTP已被广泛研究。然而，这一现象维持阶段的分子机制仍不清楚。这在一定程度上可能归因于不同实验室所采用的各种实验条件。事实上，LTP的维持阶段高度依赖于氧气供应、温度和湿度等外部参数，同时也受切片平面方向以及解剖后脑片活性等内部参数的影响。

优化所有这些参数能够诱导出高度可重复且非常稳定的长期增强效应。该方法为深入探究海马脑片中突触强度稳定增强所涉及的分子机制提供了可能，同时也强调了实验条件的重要性。 体外 神经生理学现象的研究

引言

如今，人们对复杂记忆在神经环路水平上如何存储和提取的理解仍然有限。然而，关于记忆存储存在一个统一且被广泛接受的假说：记忆以中枢神经系统中神经元之间突触连接强度的改变形式进行存储。突触可塑性的研究在很大程度上得益于两项突破性发现。（1）在一项具有里程碑意义的实验中，Bliss 和 Lomo 1，利用麻醉的完整兔发现，对海马的穿通纤维通路施加短暂的高频刺激（1秒，100赫兹），可导致相关突触连接出现持久性（数小时）增强。这一引人注目的现象于1975年由Douglas和Goddard命名为“长时程增强”（Long-Term Potentiation，LTP） 2（2）随后发现，在人工维持存活的脑切片（0.4 mm）中也可诱发类似现象 体外最广泛研究的LTP被观察到 体外 通过向一束轴突（即所谓的Schaffer侧支）施加一次或多次强直刺激，同时记录在所谓的CA1区锥体神经元中诱发的场兴奋性突触电位。LTP诱导的机制已基本阐明。本质上，Ca2+ NMDA受体介导的离子内流会激活酶，产生两个结果：AMPA受体的磷酸化（增强其功能效率）以及额外AMPA受体插入突触后膜 3相比之下，LTP维持阶段的机制在很大程度上仍不清楚，尤其是因为从实验操作上而言，将脑片在健康状态下维持数小时远比维持30至60分钟困难得多。

大量研究致力于揭示长时程增强（LTP）的机制，多年来已提出多种有趣的理论4-11。然而，直到目前，突触强度稳定增强背后的精确分子机制仍未被阐明。这在一定程度上可能归因于不同实验室在制备和维持海马脑片时采用的技术不同，导致先前的研究结果难以重复。Sajikumar 等12在其方法学论文中强调了实验条件在大鼠海马脑片制备及稳定LTP记录中的重要性。在本视频中，我们将展示我们实验室多年来逐步优化的各项步骤，以实现在小鼠海马脑片中记录出高度稳定的LTP。

该优化方案基于其他实验室已开发并成功用于研究小鼠13和大鼠11长时程增强（LTP）机制的实验方案。该方法使有经验的研究人员能够在成年小鼠中以高成功率诱导并记录持续时间极长的LTP。所诱导LTP的生理学基础已得到严格验证和证实14。在本方法学论文中，我们表明实验条件的任何改变，例如温度或供氧情况，均可能对LTP的维持产生显著影响，而脑片制备过程则可能显著改变脑片的兴奋性。还必须强调的是，对上述所有参数进行精确控制需要初学者经过数月的系统培训。

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方案

所有动物实验均依照美国国立卫生研究院关于实验动物护理与使用的法规以及当地伦理委员会的同意进行。

1. 人工脑脊液的制备

在静息期和电生理记录期间，使用相同的灌流液进行脑片的分离、切割和灌注（1 ml/min）。该灌流液的成分为 124 mM NaCl、4.4 mM KCl、26 mM NaHCO3、1 mM NaH2PO4、2.5 mM CaCl2、1.3 mM MgSO4 和 10 mM D-葡萄糖。

  1. 称取配制 2 L ACSF 所需的各组分，但 MgSO4 除外（因其已配制成 1 M 溶液）。使用标准溶液可确保 Mg2+ 浓度准确，因为粉末状 MgSO4 具有强吸湿性。Ca2+ 与 Mg2+ 的比例对长时程增强（LTP）的诱导和维持具有显著影响14，因此必须严格保持其比例。
  2. 将除 CaCl2 外的所有组分加入一个玻璃量筒中，并用蒸馏 H2O 定容至 2 L。
  3. 剧烈搅拌。待所有成分完全溶解后，通过连接在容器上的鱼缸曝气头和管路通入碳氧混合气体（95% O2，5% CO2）。待碳酸氢盐缓冲系统将 pH 值稳定在 7.4 后，再加入氯化钙。
  4. 将 600 ml 溶液保存在一个矩形玻璃培养皿中，并在培养皿周围放置冰块，将其冷却至 4 °C。该培养基将用于海马体解剖。
  5. 将剩余的 1,400 ml 溶液过滤后保存于锥形瓶中。

2. 电生理设备与脑片记录室的准备

灌流系统由两个蠕动泵组成，其中一个将新鲜液体从储液罐泵出，另一个将使用过的液体从记录室泵入废液桶。新鲜液体被加入一个自制的灌流系统，在重力作用下，液体在此系统中重新氧合并加热后，流入界面记录室（图1A）。界面记录室由FST（Fine Science Tools，加拿大温哥华，图1B）设计。脑片置于固定在可拆卸井圈上的编织网滤膜上，通过调节吸液井针的高度，可在界面条件下持续维持脑片。一根末端封闭、侧面有孔（0.5 mm）的自制塑料管固定在吸液针上，以提高记录室中液面的稳定性。记录头安装在一个水浴装置上方，水浴中装有气体分散石，通过记录头上的偏转孔通入湿润空气，以维持湿润环境（减少水滴形成）。水浴和灌流液的温度通过调节嵌入水浴中的硅橡胶加热元件的直流电流大小进行连续控制。水浴和记录井中的热敏电阻可对这些位置的记录室温度进行设定和精确监测。

腔室的加热系统由一个全局加热系统完成，该系统可控制整个装置的温度。爱丁堡大学研究人员开发的软件（www.etcsystem.com）可监测并均衡氧合空气、脑片、电极以及其余装置部分的温度，从而为长期记录提供稳定的环境（图1C）。小鼠海马脑片实验所用温度为28 °C。

  1. 用蒸馏水冲洗整个灌流管路2至少20分钟内关闭并启动加热系统。
  2. 在回路中开始通入碳合气。碳合气通过滤芯进入自制的灌流管，并进入记录室下方的水浴中。水浴中的气体流速由流量计控制。若流速过慢，组织可能缺氧；反之，若流速过高，气体可能未能充分加温和湿化，导致组织干燥。过高的气体流速还可能增加水浴中的水溅到组织上的风险，引起渗透压冲击。可通过在偏转出口处添加尼龙网片（100 μm）来防止此问题。
  3. 排出回路中的液体，并用过滤后的ACSF灌注充满。
  4. 将用于支撑脑片的环状支架放入孵育室中。使用双组分环氧树脂胶将网孔直径在500至750 μm之间的编织网滤膜固定在环状支架上。该编织网滤膜由87%聚酰胺和13%弹性纤维（15旦尼丝）制成。涂抹胶水时需谨慎操作，避免在环状支架表面形成凸起。
  5. 仔细清除管路中的所有气泡。
  6. 使用吸管的螺丝调节记录室中人工脑脊液（ACSF）的液面高度。将蠕动泵的流速调节至进液泵1 ml/min，出液泵5 ml/min。

灌注系统置于坚固的防震台上，并用法拉第笼包围。

3. 解剖区域的准备

手术器械：带#11刀片的手术刀、小型标准解剖剪、弹簧剪、弯头镊子、两把海德曼刮匙和一把勺子。

补充材料：一把剪刀、一块垫巾、带有剃须刀片的McIlwain组织切碎机、滤纸、带橡胶头的玻璃巴斯德吸管、两根塑料巴斯德吸管（其中一根为宽口）、培养皿、直径为7 mm的金属圆筒（图2A）。

  1. 在装有冷的ACSF（步骤1中配制）的解剖皿中，浸入一个用滤纸包裹的冷藏染色缸玻璃盖。小心去除气泡，并通过水族箱曝气器对ACSF进行氧合（图2A）。
  2. 按使用顺序摆放器械。在组织切片机载物板上放置三层滤纸，并安装一片用蒸馏水和乙醚清洗过的新剃刀刀片（图2B）。刀片接触滤纸时必须保持水平。刀片力度调节至最大值的一半，速度调节至最大值的约三分之一。
  3. 仔细检查所有物品是否准备就绪（器械、温度等），因为之后将没有时间进行准备。
  4. 请他人使用装有冷ACSF的巴斯德移液管对解剖区域进行喷洒。
  5. 在断头前，通过腹腔注射戊巴比妥钠（100 mg/kg）对小鼠进行麻醉。也可使用氟烷麻醉。我们比较了这两种方法，结果相同。断头必须在麻醉状态下进行，但也可采用颈椎脱位法。然而，颈椎脱位需要非常熟练的操作，以避免动物遭受痛苦。
  6. 在冷ACSF持续冲洗条件下，尽快在垫板上进行解剖。

4. 脑组织取出

  1. 用一只手的食指和拇指固定住头部，在颅顶中线处从断头切口边缘开始，向前至额骨方向，用解剖剪做一纵向切口。
  2. 在头部两侧剪开皮肌，充分暴露颅骨骨板，并清除头部尾侧的肌肉组织。
  3. 用解剖剪沿每侧颞骨板剪断颞肌，然后在中线处横向剪开额骨骨板，随后在两骨板之间的枕骨上做一小切口。
  4. 在每一侧，于枕骨板尾侧基部进行剪切。
  5. 用弹簧剪沿矢状缝纵向剪开。
  6. 用镊子将两侧颅骨向两侧分开，移除颅骨半片。
  7. 用手术刀在嗅球后方和小脑前方进行横向切割，随后将取出的脑组织放入盛有冷人工脑脊液（ACSF）的解剖皿中。

5. 海马体解剖

  1. 将脑组织放入解剖皿后，用手术刀从中间插入，将两个半球分离。
  2. 在双目手术显微镜下（×25，图2A），使用解剖刀在视觉控制下进行海马体的解剖。在一侧半球上，小心展开组织结构以暴露侧脑室。去除脑干和间脑，方法是在一侧的额叶皮层和另一侧的间脑处分别施加解剖刀。操作时需注意避免解剖刀接触海马体，并防止在切片过程中牵拉海马体。
  3. 切断穹窿后，将解剖刀插入脑室，轻轻将海马体从皮层中推出（卷离）。
  4. 当海马体被取出后，去除多余的皮层组织及残留的血管。

6. 切片

  1. 使用宽口塑料巴斯德吸管，将海马体转移至勺子中，使其齿状回表面朝上（凸面）。
  2. 用标准塑料巴斯德吸管吸除多余液体。
  3. 将勺子垂直提起，接近切片机的滤纸（图2B），迅速将海马体从勺子上抖落至滤纸上，然后立即将勺子移开。
  4. 调整海马体方向，使用切片机将其横向切成400 μm厚的切片（海马体相对于刀片的方向参见图2C）。操作应尽可能迅速。
  5. 取下带有切片海马体的滤纸，将其包裹在金属圆筒上以略微展开切片。然后用标准塑料巴斯德吸管喷洒ACSF溶液，使切片脱离滤纸，并收集到盛有冷ACSF的培养皿中。

7. 切片在界面条件下的孵育

  1. 使用标准的塑料移液管挑选脑片，并迅速将其放入记录室中。脑片在记录室的界面状态下于28 °C条件下直接恢复因解剖造成的损伤。
  2. 脑片很可能下沉。降低液面至接近脑片位置，然后再升高液面使其漂浮。
  3. 在降低液面的同时将脑片调整至正确位置。脑片始终以相同方向摆放，以便于将电极（两个刺激电极和一个记录电极）准确定位于CA1区。
  4. 当液体达到界面状态时停止调节。脑片周围出现培养基的“弯月面”提示液量充足。网状滤膜必须被培养基充分浸润，但不可完全浸没。
  5. 用置于穿孔盖上的滤纸覆盖记录室。
  6. 让脑片在28 °C条件下静置至少1.5小时。

8. 突触反应的记录

  1. 记录电极：将玻璃毛细管拉制成充满人工脑脊液（ACSF）时尖端电阻为 2-5 MΩ 的电极。在电极尖端周围放置一小片滤纸，并在末端涂抹骨蜡以减少冷凝。刺激电极：从 FHC（美国）购买直径为 12.5 μm 的铂铱双极簇电极。妥善护理下，每个电极至少可使用 30 次（图 1B）。
  2. 将电极置于 CA1 区的辐射层（stratum radiatum），所有电极排成一行（图 3A）。使用 Narishige 微操纵器将电极下降至脑片表面下 75 至 150 μm 处。两个刺激电极分别用于刺激两束不同的Schaffer侧支通路。当电极放置到脑片上后，需小心地在周围放置滤纸以封闭记录腔室。
  3. 采用 Grass 刺激器连接 SIU-V 隔离单元，以恒定电压进行双相刺激（每半波脉冲持续时间为 0.08 msec）。通过将刺激强度从 2 V 逐步增加至最大 12 V 来确认最大反应。场兴奋性突触后电位（fEPSP）信号由 WPI ISO-80 放大器放大 1000 倍，并在 10 Hz 和 10 kHz 进行滤波。随后信号经 National Instruments A/D 转换器传入计算机。刺激、数据采集与分析均使用 WinLTP 程序（www.winltp.com）完成。场兴奋性突触后电位的记录幅度设定为输入-输出曲线中最大响应的 40%。对每一片脑片，其 fEPSP 斜率均以长时程增强（LTP）诱导前 30 分钟内的平均斜率为基准进行归一化处理。
  4. 长时程增强（LTP）通过在一条通路上施加单次高频刺激串（100 Hz）来诱导，同时另一条通路作为对照。

9. 实验装置的清洗

  1. 用3%的过氧化氢（H2O2）溶液冲洗整个管路至少10分钟，然后排空。在开始任何实验前，需用蒸馏水仔细冲洗管路。使用H2O2并非绝对必要，因为其他实验室仅使用蒸馏水进行清洗，但我们注意到仅用水清洗时，管路系统中会出现深色残留物沉积。
  2. 更换记录室下方水浴中的水。
  3. 将刺激电极尖端浸入酒精中5分钟。

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结果

该方法已被用于分析从成年C57Bl/6J小鼠（JANVIER SAS，法国）急性海马脑片中诱导的持久性长时程增强（LTP）的特性14。令人意外的是，实验条件的优化促使我们以一种全新的视角来观察LTP。我们发现，突触强度的持久性增强并不依赖新蛋白质的合成。

此处，我们证明长时程增强（LTP）的诱导依赖于脑片的存活率和兴奋性。当海马体解剖过程过慢或造成过多损伤时，脑片的兴奋性会升高，在LTP诱导后可观察到多突触反应（图3B）。在此情况下，LTP的诱导效果显著降低，且增强效应无法维持。

需要强调的是，即使在看似健康的脑片中，技术条件对单次刺激串诱导的长时程增强（LTP）持续时间也有很大影响。在先前的发表文章中，我们的研究组已证明，通过改变脑片的恢复条件，可将短暂的LTP转变为持久的LTP15。在多年的日常实验实践中，我们观察到，随着技术的逐步改进，在标准条件下单次刺激串诱导的LTP持续时间也逐步延长。事实上，2005年记录的实验结果显示，LTP仅短暂维持，...

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讨论

我们在本实验室开发了一种实验方案，该方案结合了其他具有丰富LTP记录经验的实验室所建立和使用的方法11,17。此方案适用于成年小鼠海马组织，可用于任何年龄和任何遗传背景品系的小鼠。同时，该方案也可用于分析在阿尔茨海默病等神经退行性疾病模型的转基因小鼠中LTP的变化18,19。

在大鼠海马脑片中应用本方案可能需要进行一些调整。例如，大多数在大鼠中开展的研究采用32 °C而非28 °C的温度。Mathis et al. 20 提出了一种用于制备老龄小鼠或大鼠海马脑片的替代方法。

材料与方法

C57BL/6J 小鼠来自法国 JANVIER SAS，但使用法国 Charles River 提供的 C57BL/6J 小鼠也可获得相同结果。

将组织浸没在冰冷的ACSF中快速分离海马，以减少细胞损伤。这种方法能够降低兴奋性毒性，但已知会诱导突触增...

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披露

未声明任何利益冲突。

致谢

感谢 Bernard Foucart 提供的技术支持。本工作由比利时科学基金（F.R.S.-FNRS）和伊丽莎白女王医学研究基金资助。Agnès Villers 是比利时科学基金的研究员。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
试剂/材料
NaClSigma - AldrichS7653
NaHCO3Sigma - AldrichS8875
KClSigma - AldrichP9333
D-葡萄糖Sigma - AldrichG7528
NaH2PO4Sigma - AldrichS9638
MgSO4 1MSigma - Aldrich63126
CaCl2Sigma - AldrichC4901
碳合气Air Liquide (比利时)
毛细管WPI, Inc. (英国)TW150-4
刺激电极FHC (美国)CE2B30
手术器械FST (德国)
滤纸 84 g/m2SartoriusFT-3-105-110
网状材料Lycra15 旦
胶水UHUplus endfest300
仪器
放大器WPI, Inc. (英国)ISO-80
界面记录室FST (德国)
蠕动泵Gilson (美国)Minipuls 3
温度控制器爱丁堡大学www.etcsystem.com
组织切片机Mcllwain
刺激器Grass (美国)S88X + SIU-V
数据分析程序WinLTPwww.winltp.com
显微操作器NarishigeMM-3 和 MMO-220A
手术显微镜Leica Microsystem
A/D 转换器National InstrumentsNIPCI-6229 M系列

参考文献

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海马体小鼠脑片的改良制备与保存方法以实现长期增强作用的非常稳定且可重复的记录
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