小鼠提睾肌微循环中周围干细胞迁移分析的活体显微镜观察

摘要

小鼠提睾肌微循环的活体显微镜观察提供了一种独特且高度标准化的方法 体内 外周骨髓干细胞迁移分析模型

摘要

在再生细胞治疗领域，随着血管内细胞应用方案的发展，干细胞向非骨髓组织迁移的潜在机制尚未完全阐明。本文介绍了将活体显微技术应用于小鼠提睾肌微循环，以分析外周骨髓干细胞迁移的方法。 体内. 提睾肌活体显微技术已广泛应用于炎症研究领域，用于直接观察白细胞与血管内皮的相互作用。由于外周干细胞与祖细胞迁移过程包含类似的初始步骤，即沿内皮表面滚动并牢固黏附于内皮层，因此可合理地将提睾肌模型应用于观察和定量分析经血管内输注的干细胞与内皮之间的相互作用。通过简单的表面灌注技术，可选择性地向靶组织施加多种化学成分，从而在活体动物骨髓外环境中建立干细胞募集所需的关键微环境条件。

引言

本文的目的是描述应用于小鼠提睾肌微循环的活体显微镜技术（IVM），以直接观察和分析外周骨髓干细胞的迁移过程。

基于干细胞的组织和器官再生当前概念涉及骨髓来源的干细胞向受损组织的归巢¹成功干细胞迁移的关键步骤包括干细胞与受损器官内局部血管内皮的相互作用，随后发生跨内皮迁移，最终实现器官定植。²活体分析这些干细胞与内皮细胞的相互作用，是量化不同病理生理条件下基于干细胞的再生反应的理想参数 体内此外，未来有可能在将特定干细胞群体推进到进一步的临床测试之前，先在标准化的微循环环境中对其迁移能力进行活体分析。

活体显微镜最初是在炎症研究领域为观察和量化白细胞与内皮细胞在体内的相互作用而开发的in vivo³。早在19世纪，Cohnheim已首次成功利用光学显微镜对青蛙的舌头和肠系膜进行活体显微观察并记录结果⁴。自首次应用以来，活体显微技术（IVM）经历了巨大的技术发展，如今进行定量IVM研究必须具备某些基本组件：（i）允许光学通路的组织制备方法，（ii）可被显微镜检测的分子探针，（iii）连接检测系统的显微镜，以及（iv）基于计算机的分析系统，用于从图像数据集中提取感兴趣的参数⁴。

已为活体显微镜研究引入了多种组织制备方法，包括小鼠和大鼠的肠系膜及肝脏⁵、小鼠和仓鼠的背部皮肤皱襞腔⁶、兔耳以及仓鼠颊囊等。

然而，在下文中，我们将重点关注小鼠提睾肌，该组织是活体观察的理想材料，因为其制备和可视化可通过一种高度标准化的手术方法实现，且通常不会出现运动伪影问题。提睾肌开放制备模型最早于20世纪70年代由Baez及其同事首次建立⁷。该模型最初用于大鼠，后被成功应用于小鼠⁸。在以往研究主要关注白细胞与血管壁相互作用的基础上，我们课题组近期将小鼠提睾肌制备技术发展为一种可在特定微环境中直接观察并定量分析干细胞-内皮细胞相互作用的重要工具⁹。利用该模型已研究了多种干细胞亚群，包括小鼠c-kit⁺骨髓干细胞和间充质干细胞，以及人CD133⁺骨髓干细胞^10-12。在从供体骨髓中分离细胞并进行荧光标记以实现可视化后，可通过股动脉动脉注射的方式将干细胞选择性地注入提睾肌微循环，从而避免细胞在远端器官中滞留。此外，提睾肌模型具有特殊优势，因为在相应实验条件下，可能介导局部干细胞迁移的多种趋化因子可通过简单的表面灌流技术直接施加于目标组织。

方案

细胞分离后的整个实验方案大约需要2小时。

1. 显微外科准备

1. 根据标准化方案从供体骨髓中分离干细胞，并对分离的亚群进行荧光标记^9,12。在动物手术进行期间，使细胞处于静息状态。我们推荐使用CFDA（羧基荧光素二乙酸盐琥珀酰亚胺酯）进行荧光标记。
2. 使用氯胺酮（75 mg/kg）和赛拉嗪（2.5 mg/kg）对一只体重为20–25 g的雄性小鼠进行麻醉。在整个手术过程和实验流程中，应根据需要（通常每30–60分钟一次）通过腹腔注射补充初始剂量的10%以维持麻醉状态。
3. 轻柔地剃除右侧阴囊的前部以及右大腿和腹股沟区域的毛发。使用湿润的棉签收集所有脱落的毛发。将小鼠仰卧位固定在有机玻璃观察台上，并用弹性铺巾固定四肢。该观察台为定制装置，由基板和位于基板尾侧边缘的第二块板组成，用于抬高双侧下肢和阴囊。将观察台置于加热垫上，以维持体温在37 °C。固定于观察台后，将动物置于手术显微镜下，并在10至16倍放大倍数下执行以下操作步骤。
4. 使用眼科剪在右侧大腿处做初始切口，位置位于股血管前方，从膝部延伸至腹股沟。
5. 识别股动脉并沿其向近端游离，将动脉从周围软组织中分离出来。识别并使用电凝法切断通向左侧睾丸的一条较大分支。随后在左侧睾丸上浅层放置一根固定缝线。轻柔牵拉有助于进一步向近端游离股动脉。
6. 完成近端游离后，识别并使用电凝法切断大腿内侧走行的一条较大分支 。随后在右侧大腿远端结扎股动脉。轻柔牵拉结扎线有助于进一步解剖操作。
7. 再次将注意力集中于近端股动脉，尽可能靠近近端在动脉周围放置一根缝线。预先打结但暂不收紧。对缝线施加轻柔牵拉，形成动脉扭曲。
8. 在形成扭曲后，使用显微剪小心切开动脉。特别注意避免损伤股静脉。
9. 通过切口插入已准备好的微导管（内径0.28 mm）。插入前，导管须排尽空气（使用0.9%氯化钠溶液，NaCl），并与1 ml注射器连接。
10. 成功插入导管后，小心松开动脉扭曲，以便导管顺利通过。此时应立即可在导管内观察到动脉血流。轻柔推进导管，使其越过先前扭曲部位数毫米。随后收紧预先准备的结扎线以固定导管。
11. 轻柔冲洗导管（使用0.9% NaCl）并抽吸，以确认导管位置正确。使用胶带将导管进一步固定在手术台上。
12. 充分固定后，将导管暂时移开，以便进行提睾肌的后续准备工作。每5–10分钟定期冲洗并抽吸导管一次，以防止血栓形成。
13. 将注意力转向右侧阴囊，通过切开右侧阴囊腹侧上方的皮肤和筋膜做切口。操作中注意避免任何器械接触下方组织。
14. 将切口向上延伸至腹股沟皱襞，向下延伸至阴囊远端末端。
15. 小心分离提睾囊上方的软组织和结缔组织，避免接触提睾囊本身。识别提睾肌的远端末端，并在此处放置一根固定缝线以轻微拉伸肌肉。通过轻柔向尾侧和前侧牵拉肌肉，切除肌肉囊下方残留的软组织。
16. 在完全分离结缔组织后，使用剪刀在提睾囊头侧边缘某一点处切开提睾囊。从该开口处向下延伸切口至肌肉远端末端。
17. 使用电凝法封闭连接睾丸与提睾肌的小血管，随后使用剪刀切断肌肉与睾丸之间的其余连接。
18. 将睾丸移至显微镜视野之外。
19. 打开后的提睾肌现在平铺于观察台上。在组织边缘放置四根6-0 Prolene固定缝线，并用弹性铺巾固定，以充分展开提睾肌组织。此后持续使用1 ml注射器滴加磷酸盐缓冲液（PBS）以保持组织湿润（图1）。
20. 让制备完成的组织静置15分钟。随后经左侧股动脉注射0.05–0.1 ml的1%罗丹明-葡聚糖，以增强微血管的对比度。如计划应用趋化因子或炎症刺激物，此时应使用1 ml注射器将相应试剂局部滴加于肌肉表面。若为对照实验，则继续使用PBS湿润组织。

2. 活体显微成像

1. 将小鼠固定在操作台上，移至经过改造用于落射照明的荧光显微镜下，并连接电荷耦合器件（CCD）视频相机。操作时需特别注意避免移位股动脉导管。
2. 使用水浸物镜进行实验。
3. 在调整物镜以充分观察 cremaster 微循环并在细胞注射前，随机选择六条后微静脉，用于后续分析干细胞的牢固黏附。
4. 将溶解于200 μl PBS中的荧光标记干细胞以0.4 x 10⁶细胞/只进行给药⁶ 每次注射的细胞数量，共进行五次连续注射，通过股动脉导管和1 ml注射器完成。首次注射前需轻轻摇匀细胞样品。
5. 在细胞注射后立即记录干细胞的滚动行为，从而定义 "滚动" 细胞沿内皮层移动速度降低超过50%，并伴有典型细胞形态变化 "粘附与释放" 运动。每次注射后，在1分钟的观察期内，计数沿定义的微静脉距离滚动的所有干细胞以及经过的全部干细胞。干细胞滚动数量以经过细胞总数的百分比表示。出现随机短暂黏附现象的细胞不得计入滚动细胞。
6. 在最后一次细胞注射后，通过计数确定牢固黏附的干细胞数量，并将结果表示为每平方毫米预设的六条微静脉内皮表面积（直径 × 长度 × π）上的黏附细胞数。² 牢固黏附的判定标准为在30秒内未观察到细胞移动。
7. 完成活体显微镜观察后，小心取出提睾肌并妥善保存，以备后续分析（免疫组织化学或分子生物学）。通过颈椎脱臼法处死实验动物。对活体显微镜录像进行分析，以定量评估干细胞滚动、牢固的内皮细胞黏附以及微血管血流动力学参数。 例如红细胞流速（mm/sec）、血管长度（μm）、血管直径（μm）、管壁剪切率（sec^-1）；应由不了解实验组织处理情况的研究人员，使用图像处理软件离线完成。

结果

通常情况下，直接注射的干细胞或祖细胞与 cremaster 肌肉微循环中血管内皮的相互作用极为罕见，且仅发生在毛细血管后微静脉（直径：30–80 μm）中。由于采用了荧光标记，可在观察到的微静脉中将滚动和牢固黏附的干细胞与循环中的内源性白细胞明确区分开来并进行定量分析（图2）。

由血流速度和管壁剪切率所代表的微循环条件，在接受不同趋化因子处理的各个实验组之间通常没有显著差异（表1）。

不同趋化因子或炎症反应介质对提睾肌组织的局部处理 例如 SDF-1α（基质细胞衍生因子-1α）或 TNF-α（肿瘤坏死因子-α）能够模拟特定的微环境条件。这些条件可不同程度地增强干细胞与内皮细胞之间的相互作用，具体增强程度取决于所应用的特定趋化因子/介质以及注射的干细胞群体图3)¹²清晰量化这些不同的干细胞-内皮细胞相互作用模式的可能性，使得能够在特定微环境中评估特定干细胞群体的迁移潜能 体内

讨论

活体荧光显微镜可实现对干细胞-内皮细胞相互作用的直接观察和定量分析。提睾肌模型尤为适用，因为微外科暴露技术和活体可视化方法在白细胞-内皮细胞相互作用的研究中已得到充分建立，并且可通过简单的表面灌流技术将各种化学成分选择性地施加于目标组织。由于不存在运动伪影和严重的图像噪声，与其他活体显微镜设置相比，该模型为细胞间相互作用的可视化提供了最佳条件。

该模型可用于揭示活体生物中干细胞初始募集所必需的微环境前提条件。如有需要，内源性白细胞可作为阳性对照，用于验证并证明干细胞行为的原理。

通过采用急性动物模型并利用直接动脉注射而非静脉给药，可避免慢性细胞迁移模型和/或全身性细胞递送的潜在局限性——例如因细胞在远端器官滞留而导致的细胞丢失。另一方面，急性手术造成的组织创伤本身可能诱发一定程度的组织激活。因此，必须采用无创的手术操作，并在开始实验分组前，以可重复的方式实现腹肌膜制备后稳定的微循环状态。

在对照动物活体显微成像记录开始时，后微静脉内存在大量白细胞聚集以及...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
羧基荧光素二乙酸盐琥珀酰亚胺酯（CFDA）	美国加利福尼亚州卡尔斯巴德 Invitrogen	C1157
罗丹明 6G（1%）	Sigma-Aldrich，德国慕尼黑	83697
氯胺酮（Ketanest）	辉瑞，德国柏林	暂无内容
赛拉嗪（Rompun）	拜耳，德国勒沃库森	暂无内容
杜氏磷酸盐缓冲液（PBS）	PAN Biotech，德国艾登巴赫	P04-36500