小鼠提睾肌微循环中周围干细胞迁移分析的活体显微镜观察

摘要

小鼠提睾肌微循环的活体显微镜观察提供了一种独特且高度标准化的方法 体内 外周骨髓干细胞迁移分析模型

摘要

在再生细胞治疗领域，随着血管内细胞应用方案的发展，干细胞向非骨髓组织迁移的潜在机制尚未完全阐明。本文介绍了将活体显微技术应用于小鼠提睾肌微循环，以分析外周骨髓干细胞迁移的方法。 体内. 提睾肌活体显微技术已广泛应用于炎症研究领域，用于直接观察白细胞与血管内皮的相互作用。由于外周干细胞与祖细胞迁移过程包含类似的初始步骤，即沿内皮表面滚动并牢固黏附于内皮层，因此可合理地将提睾肌模型应用于观察和定量分析经血管内输注的干细胞与内皮之间的相互作用。通过简单的表面灌注技术，可选择性地向靶组织施加多种化学成分，从而在活体动物骨髓外环境中建立干细胞募集所需的关键微环境条件。

引言

本文的目的是描述应用于小鼠提睾肌微循环的活体显微镜技术（IVM），以直接观察和分析外周骨髓干细胞的迁移过程。

基于干细胞的组织和器官再生当前概念涉及骨髓来源的干细胞向受损组织的归巢¹成功干细胞迁移的关键步骤包括干细胞与受损器官内局部血管内皮的相互作用，随后发生跨内皮迁移，最终实现器官定植。²活体分析这些干细胞与内皮细胞的相互作用，是量化不同病理生理条件下基于干细胞的再生反应的理想参数 体内此外，未来有可能在将特定干细胞群体推进到进一步的临床测试之前，先在标准化的微循环环境中对其迁移能力进行活体分析。

活体显微镜最初是在炎症研究领域为观察和量化白细胞与内皮细胞在体内的相互作用而开发的in vivo³。早在19世纪，Cohnheim已首次成功利用光学显微镜对青蛙的舌头和肠系膜进行活体显微观察并记录结果⁴。自首次应用以来，活体显微技术（IVM）经历了巨大的技术发展，如今进行定量IVM研究必须具备某些基本组件：（i）允许光学通路的组织制备方法，（ii）可被显微镜检测的分子探针，（iii）连接检测系统的显微镜，以及（iv）基于计算机的分析系统，用于从图像数据集中提取感兴趣的参数⁴。

已为活体显微镜研究引入了多种组织制备方法，包括小鼠....

方案

细胞分离后的整个实验方案大约需要2小时。

1. 显微外科准备

1. 根据标准化方案从供体骨髓中分离干细胞，并对分离的亚群进行荧光标记^9,12。在动物手术进行期间，使细胞处于静息状态。我们推荐使用CFDA（羧基荧光素二乙酸盐琥珀酰亚胺酯）进行荧光标记。
2. 使用氯胺酮（75 mg/kg）和赛拉嗪（2.5 mg/kg）对一只体重为20–25 g的雄性小鼠进行麻醉。在整个手术过程和实验流程中，应根据需要（通常每30–60分钟一次）通过腹腔注射补充初始剂量的10%以维持麻醉状态。
3. 轻柔地剃除右侧阴囊的前部以及右大腿和腹股沟区域的毛发。使用湿润的棉签收集所有脱落的毛发。将小鼠仰卧位固定在有机玻璃观察台上，并用弹性铺巾固定四肢。该观察台为定制装置，由基板和位于基板尾侧边缘的第二块板组成，用于抬高双侧下肢和阴囊。将观察台置于加热垫上，以维持体温在37 °C。固定于观察台后，将动物置于手术显微镜下，并在10至16倍放大倍数下执行以下操作步骤。
4. 使用眼科剪在右侧大腿处做初始切口，位置位于股血管前方，从膝部延伸至腹股沟。
5. 识别股动脉并沿其向近端游离，将动脉从周围软组织中分离出来。识别并使用电凝法切断通向左侧睾丸的一条较大分支。随后在左侧睾丸上浅层放置一根固定缝线。轻柔牵拉有助于进一步向近端游离股动脉。
6. 完成近端游离后，识别并使用电凝法切断大腿内侧走行的一条较大分....

结果

通常情况下，直接注射的干细胞或祖细胞与提睾肌微循环中血管内皮的相互作用极为罕见，且仅发生于毛细血管后微静脉（直径：30–80 μm）。由于采用了荧光标记，可在观察到的微静脉中将滚动和牢固黏附的干细胞与循环中的内源性白细胞明确区分并分别定量（图2）。

由血流速度和管壁剪切率所代表的微循环条件，在接受不同趋化因子处理的各个实验组之间通常没有显著差异（表1）。

不同趋化因子或炎症反应介质对提睾肌组织的局部处理 例如 SDF-1α（基质细胞衍生因子-1α）或 TNF-α（肿瘤坏死因子-α）能够模拟特定的微环境条件。这些条件可在不同程度上增强干细胞与内皮细胞之间的相互作用，具体程度取决于所应用的特定趋化因子/介质以及注射的干细胞群体图3)¹²清晰量化这些不同的干细胞-内皮细胞相互作用模式的可能性，使得能够在特定微环境中评估特定干细胞群体的迁移潜能 体内 在将这些人群推进到进一步的.......

讨论

活体荧光显微镜可实现对干细胞-内皮细胞相互作用的直接观察和定量分析。提睾肌模型尤为适用，因为微外科暴露技术和活体可视化方法在白细胞-内皮细胞相互作用的研究中已得到充分建立，并且可通过简单的表面灌流技术将各种化学成分选择性地施加于目标组织。由于不存在运动伪影和严重的图像噪声，与其他活体显微镜设置相比，该模型为细胞间相互作用的可视化提供了最佳条件。

该模型可用于揭示活体生物中干细胞初始募集所必需的微环境前提条件。如有需要，内源性白细胞可作为阳性对照，用于验证并证明干细胞行为的原理。

通过采用急性动物模型并利用直接动脉注射而非静脉给药，可避免慢性细胞迁移模型和/或全身性细胞递送的潜在局限性——例如因细胞在远端器官滞留而导致的细胞丢失。另一方面，急性手术造成的组织创伤本身可能诱发一定程度的组织激活。因此，必须采用无创的手术操作，并在开始实验分组前，以可重复的方式实现腹肌膜制备后稳定的微循环状态。

在对照动物活体显微成像记录开始时，后微静脉内存在大量白细胞聚集以及.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
羧基荧光素二乙酸盐琥珀酰亚胺酯（CFDA）	美国加利福尼亚州卡尔斯巴德 Invitrogen	C1157
罗丹明 6G（1%）	Sigma-Aldrich，德国慕尼黑	83697
氯胺酮（Ketanest）	辉瑞，德国柏林	暂无内容
赛拉嗪（Rompun）	拜耳，德国勒沃库森	暂无内容
杜氏磷酸盐缓冲液（PBS）	PAN Biotech，德国艾登巴赫	P04-36500