细胞衰老是抑制还是促进肿瘤发生目前仍存在争议。由于化疗药物可诱导癌细胞发生衰老，因此研究细胞衰老对于提出新的治疗策略至关重要。然而，目前广泛使用的标准β-半乳糖苷酶检测方法存在诸多局限性。本文提出一种基于流式细胞术的快速、灵敏的检测方法，用于定量细胞衰老。
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摘要
摘要
人类细胞不会无限增殖。在外界和/或内在信号的刺激下，细胞可能会死亡，或进入一种稳定的细胞周期停滞状态，称为衰老。已有研究表明，端粒缩短和促分裂原癌基因的异常表达等多种细胞机制均可导致细胞衰老。衰老不仅局限于正常细胞，癌细胞也被报道可发生衰老。
化疗药物已被证明可诱导癌细胞发生衰老。然而，细胞衰老是抑制还是促进肿瘤发生仍存在争议。由于这一效应可能最终具有患者特异性，因此迫切需要一种快速且灵敏的方法来评估癌细胞中的衰老状态。
目前使用的标准β-半乳糖苷酶检测方法存在主要缺陷：耗时且灵敏度低。本文提出一种基于流式细胞术的活细胞衰老检测方法。该方法具有快速、灵敏的优点，并可与多种细胞标志物的免疫标记相结合。
引言
自20世纪60年代初海弗利克（Hayflick）和莫尔黑德（Moorhead）发现以来，细胞衰老至今仍是一种引人关注的细胞现象 1人类细胞不会无限增殖，Hayflick 和 Moorhead 将这种细胞老化过程称为“衰老”。衰老是一种稳定的细胞周期阻滞状态，细胞在此状态下仍保持代谢活性，不同于细胞死亡。迄今为止，已有四种细胞机制被证实可诱导衰老：端粒缩短、DNA 损伤、染色质紊乱以及有丝分裂原癌基因的异常表达 2这表明不仅正常细胞，癌细胞也能够发生衰老 3事实上，经历衰老的癌细胞被证明会构成阻碍肿瘤进一步进展的屏障 4-5然而，已有若干报告指出，在特定情况下，细胞衰老也可能促进恶性肿瘤的发生 6-7研究癌细胞的衰老现象正逐渐成为癌症研究中的迫切需求，因为目前使用的化疗药物不仅可导致癌细胞衰老 体外 而且 体内 8.
检测衰老细胞是否存在的主要实验方法是酸性pH条件下的β-半乳糖苷酶实验。该组织化学实验反映了大多数衰老细胞中溶酶体生物合成的增加。简言之，外源性X-gal作用于细胞后，被衰老细胞溶酶体中富集的β-半乳糖苷酶切割，产生蓝色产物 9。随后可在明场显微镜下对呈蓝色的衰老细胞进行定量分析。尽管该方法应用广泛，但存在若干主要缺陷：第一，该实验需在固定细胞上进行；第二，实验耗时较长，因为需要在显微镜下计数大量衰老细胞以评估衰老程度；第三，该实验敏感性较低，因衰老细胞与非衰老细胞的区分完全依赖于观察者的主观判断。
本文介绍一种尚未被充分利用的、快速且灵敏的基于细胞术的检测方法，用于评估活体衰老细胞的存在。该方法基于衰老细胞中富含的β-半乳糖苷酶对一种可穿透细胞膜的分子——5-十二酰氨基荧光素二-β-D-半乳糖吡喃糖苷（C12FDG）——进行水解。水解后经激光激发，C12FDG 发出绿色荧光，因而可通过流式细胞术进行检测10, 11。通过流式细胞术检测衰老细胞具有快速且灵敏的显著优势。此外，流式细胞术对衰老细胞的检测可同时与其他细胞标志物的检测相结合。该方法可用于检测经化疗处理的癌细胞群体中的衰老细胞，并可在临床中常规应用于组织切片或细胞解离后的样本。
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方案
1. C12FDG、Bafilomycin A1 和细胞培养的制备
- 将 C12FDG 粉末溶于二甲基亚砜（DMSO）中，配制成终浓度为 20 mM 的溶液。分装后于 -20 °C 保存。使用 DMSO 时应采取适当的安全防护措施。
- 将巴佛洛霉素 A1（bafilomycin A1）粉末溶于 DMSO 中，配制成终浓度为 0.1 mM 的溶液。分装后于 -20 °C 保存。使用巴佛洛霉素时应采取适当的安全防护措施。
- 在含有 10% 胎牛血清和 1% 抗生素的培养基中，于 37 °C、5% CO2 条件下培养 RPMI 8226 细胞系或其他贴壁或非贴壁细胞系。估算实验所需的细胞数量。为在流式细胞术分析中记录到足够数量的细胞事件，至少需要 5 × 105 个细胞。为测定衰老细胞的比例，需准备三个细胞样本：未标记样本、未处理并用 C12FDG 染色的细胞样本、经处理并用 C12FDG 染色的细胞样本。
- 实验前 24 小时接种细胞，使细胞处于细胞增殖曲线的对数生长期。
2. 诱导衰老
- 通过添加化疗药物诱导癌细胞衰老。药物浓度和处理时间应根据所测试的细胞类型进行调整。建议以每毫升约106个细胞的密度，使用终浓度为50 nM的阿霉素处理48小时作为起始条件。注意设置未处理样本作为阴性对照。
3. 巴佛洛霉素 A1 处理
- 通过将细胞与台盼蓝（体积比）混合，检测细胞活力，因为前一步骤中使用的化疗药物可能导致细胞凋亡。将混合液加入马氏计数板，计数蓝色细胞（死细胞）和白色细胞（活细胞）的数量。若细胞活力百分比低于70%，可使用适当的试剂盒去除死细胞，以确保死细胞不会对后续分析造成偏差。
- 移除培养基，并更换为预热的新鲜培养基。向细胞中加入终浓度为100 nM的巴佛洛霉素A1（bafilomycin A1）。巴佛洛霉素A1用于中和溶酶体的酸性pH。在37 °C、5% CO2条件下孵育1小时。
4. C12FDG 染色
- 将 C12FDG 溶解于预热的新鲜培养基中，终浓度为 2 mM。
- 将该化合物以终浓度 33 μM 加入细胞中，在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 2 小时。若使用悬浮细胞，于 4 °C 以 300 × g 离心 5 分钟（离心速度可能需根据所用细胞类型进行调整），用 PBS 洗涤 2 次，将细胞沉淀重悬于 500 μl 冷 PBS 中。若使用贴壁细胞，吸除培养基后用 PBS 洗涤 2 次，用胰蛋白酶溶液消化收集贴壁细胞，于 4 °C 以 300 × g 离心 5 分钟（离心速度可能需根据所用细胞类型进行调整），将细胞沉淀重悬于 500 μl 冷 PBS 中。无论何种情况，细胞浓度均应约为 106 个细胞/ml。
- 进行共免疫标记，以进一步表征衰老细胞群体。
5. 流式细胞术分析
- 使用流式细胞仪制造商推荐的控制微球校准流式细胞仪。所有步骤中，至少采集 104 必须记录事件。
- 运行第一个含有未标记细胞的样本。绘制一个双参数图，显示前向散射光通道（FSC）相对于侧向散射光通道（SSC）。调节光电倍增管（PMT），并设定一个感兴趣区域，排除在样本制备过程中可能出现的死细胞和细胞碎片。将该感兴趣区域设门于一个单参数直方图中，该图在x轴的对数尺度上显示FL1，y轴显示事件数。总事件数代表被分析的细胞数量。调节PMT，使未标记细胞出现在x轴对数尺度的第一 decade 内。如有必要，测定细胞的自发荧光。
- 运行第二个含有未经处理细胞的样本。在显示FL1（C的荧光）的单参数直方图上12FDG），将光标置于标记较弱的细胞群之后。该阈值可用于区分非衰老细胞（标记较弱的细胞）与衰老细胞（标记较强的细胞）。
- 运行第三个含有经处理细胞的样本。荧光标记明显的细胞， 即 衰老细胞的数量超过前一步骤中确定的阈值。通过将明亮事件数除以总事件数来计算衰老细胞所占的百分比。如有需要，也可利用平均荧光强度来估算β-半乳糖苷酶的活性。
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结果
多发性骨髓瘤是一种血液系统恶性肿瘤，被用于评估化疗程序诱导的细胞衰老。为此，采用一种 commercially available 的多发性骨髓瘤细胞系（RPMI 8226），用化疗药物阿霉素处理2天。随后对细胞进行巴佛洛霉素 A1 处理，并进一步与 C12FDG 共孵育。通过流式细胞术分析细胞。图1 展示了实验的各个步骤，并表明使用 C12FDG 可在一天内测定衰老细胞的比例。首先将未标记的细胞上机进行流式细胞术检测。如图2A所示，在前向散射光（FSC）与侧向散射光（SSC）的散点图中设定一个感兴趣区域，以排除死亡细胞和细胞碎片。将该感兴趣区域内的细胞投射到直方图上，横轴显示 C12FDG 的荧光信号（FL1），纵轴显示事件数。首先分析未经处理的细胞。如图2B所示，在微弱荧光标记的细胞群之后设置一个红色光标：非衰老细胞位于区域 U，而衰老细胞则位于区域 V。随后将经处理的细胞上机检测。如图2C（左图）所示，出现一群强荧光标记的细胞，位于...
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讨论
本文介绍了一种基于流式细胞术的方法，用于定量活体癌细胞中的细胞衰老。该方法基于使用膜通透性化合物 C12FDG，因此只要细胞能够摄取该化合物，便可应用于任何细胞类型以及各种处理后的细胞。细胞摄取后，C12FDG 被衰老细胞溶酶体中富集的 β-半乳糖苷酶水解。经激光激发后，该化合物发出绿色荧光，从而实现对衰老细胞的定量。这种绿色荧光的定量既可通过流式细胞术完成，也可通过荧光显微镜进行。然而，在后一种情况下，需由观察者手动计数荧光阳性细胞，较为耗时。由于 C12FDG 可被 β-半乳糖苷酶水解，该方法除了可用于定量衰老细胞外，还可用于测定 β-半乳糖苷酶的活性及其主要存在于溶酶体囊泡中的定位情况。尽管该方法操作简便，但需特别注意第 3 步。成功检测衰老细胞在很大程度上依赖于溶酶体的合适 pH 值。为此，我们使用巴佛洛霉素 A1（bafilomycin A1）来中和溶酶体的酸性 pH。根据所用细胞类型的差异，此步骤可能并非必需。如果预期存在细胞衰老但未检测到染色信号，建议设置巴佛洛霉素 A1 的阴性对照（即不加巴佛洛霉素），并提高巴佛洛霉素 A1 的浓度。若采取此措施，需确保浓...
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
我们感谢法国卡昂大学SF 4206 ICORE提供的流式细胞术实验平台。J.C.获得了法国电力公司辐射防护委员会和下诺曼底大区议会的博士后奖学金。这些数据属于法国国家抗癌联盟（Orne省和Calvados省委员会）资助项目的部分内容。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 5-十二烷酰氨基荧光素二-β-D-半乳吡喃糖苷 | Invitrogen | D-2893 | |
| 二甲基亚砜 | Sigma | D2650 | |
| 巴佛洛霉素 A1 | Sigma | B1793 | |
| 多柔比星 | Sandoz | ||
| 台盼蓝 | Sigma | T8154 | |
| RPMI 1640 细胞培养基 | Lonza | BE12-702 | |
| 胎牛血清 | PAA Laboratories GmBH | A15 101 | |
| 抗生素 | Gibco | 5290-018 | |
| Galios 流式细胞仪 | Beckman Coulter | A94291 |
参考文献
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- Campisi, J., d'Adda di Fagagna, F. Cellular senescence: when bad things happen to good cells. Nature Review Molecular Cell Biology. 8 (9), 729-740 (2007).
- Shay, J. W., Roninson, I. B. Hallmarks of senescence in carcinogenesis and cancer therapy. Oncogene. 23 (16), 2919-2933 (2004).
- Bartkova, J., Rezaei, N. Oncogene-induced senescence is part of the tumorigenesis barrier imposed by DNA damage checkpoints. Nature. 444 (7119), 633-637 (2006).
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重印与许可
