一种定量衰老癌细胞的灵敏方法

摘要

细胞衰老是抑制还是促进肿瘤发生目前仍存在争议。由于化疗药物可诱导癌细胞发生衰老，因此研究细胞衰老对于提出新的治疗策略至关重要。然而，目前广泛使用的标准β-半乳糖苷酶检测方法存在诸多局限性。本文提出一种基于流式细胞术的快速、灵敏的检测方法，用于定量细胞衰老。

摘要

人类细胞不会无限增殖。在外界和/或内在信号的刺激下，细胞可能会死亡，或进入一种稳定的细胞周期停滞状态，称为衰老。已有研究表明，端粒缩短和促分裂原癌基因的异常表达等多种细胞机制均可导致细胞衰老。衰老不仅局限于正常细胞，癌细胞也被报道可发生衰老。

化疗药物已被证明可诱导癌细胞发生衰老。然而，细胞衰老是抑制还是促进肿瘤发生仍存在争议。由于这一效应可能最终具有患者特异性，因此迫切需要一种快速且灵敏的方法来评估癌细胞中的衰老状态。

目前使用的标准β-半乳糖苷酶检测方法存在主要缺陷：耗时且灵敏度低。本文提出一种基于流式细胞术的活细胞衰老检测方法。该方法具有快速、灵敏的优点，并可与多种细胞标志物的免疫标记相结合。

引言

自20世纪60年代初海弗利克（Hayflick）和莫尔黑德（Moorhead）发现以来，细胞衰老至今仍是一种引人关注的细胞现象 ¹人类细胞不会无限增殖，Hayflick 和 Moorhead 将这种细胞老化过程称为“衰老”。衰老是一种稳定的细胞周期阻滞状态，细胞在此状态下仍保持代谢活性，不同于细胞死亡。迄今为止，已有四种细胞机制被证实可诱导衰老：端粒缩短、DNA 损伤、染色质紊乱以及有丝分裂原癌基因的异常表达 ²这表明不仅正常细胞，癌细胞也能够发生衰老 ³事实上，经历衰老的癌细胞被证明会构成阻碍肿瘤进一步进展的屏障 ^4-5然而，已有若干报告指出，在特定情况下，细胞衰老也可能促进恶性肿瘤的发生 ^6-7研究癌细胞的衰老现象正逐渐成为癌症研究中的迫切需求，因为目前使用的化疗药物不仅可导致癌细胞衰老 体外 而且 体内 ⁸.

检测衰老细胞是否存在的主要实验方法是酸性pH条件下的β-半乳糖苷酶实验。该组织化学实验反映了大多数衰老细胞中溶酶体生物合成的增加。简言之，外源性X-gal作用于细胞后，被衰老细胞溶酶体中富集的β-半乳糖苷酶切割，产生蓝色产物 ⁹。随后可在明场显微镜下对呈蓝色的衰老细胞进行定量分析。尽管该方法应用广泛，但存在若干主要缺陷：第一，该实验需在固定细胞上进行；第二，实验耗时较长，因为需....

方案

1. C12FDG、Bafilomycin A1 和细胞培养的制备

1. 将 C₁₂FDG 粉末溶于二甲基亚砜（DMSO）中，配制成终浓度为 20 mM 的溶液。分装后于 -20 °C 保存。使用 DMSO 时应采取适当的安全防护措施。
2. 将巴佛洛霉素 A1（bafilomycin A1）粉末溶于 DMSO 中，配制成终浓度为 0.1 mM 的溶液。分装后于 -20 °C 保存。使用巴佛洛霉素时应采取适当的安全防护措施。
3. 在含有 10% 胎牛血清和 1% 抗生素的培养基中，于 37 °C、5% CO₂ 条件下培养 RPMI 8226 细胞系或其他贴壁或非贴壁细胞系。估算实验所需的细胞数量。为在流式细胞术分析中记录到足够数量的细胞事件，至少需要 5 × 10⁵ 个细胞。为测定衰老细胞的比例，需准备三个细胞样本：未标记样本、未处理并用 C₁₂FDG 染色的细胞样本、经处理并用 C₁₂FDG 染色的细胞样本。
4. 实验前 24 小时接种细胞，使细胞处于细胞增殖曲线的对数生长期。

2. 诱导衰老

1. 通过添加化疗药物诱导癌细胞衰老。药物浓度和处理时间应根据所测试的细胞类型进行调整。建议以每毫升约10⁶个细胞的密度，使用终浓度为50 nM的阿霉素处理4....

结果

多发性骨髓瘤是一种血液系统恶性肿瘤，被用于评估化疗程序诱导的细胞衰老。为此，采用一种 commercially available 的多发性骨髓瘤细胞系（RPMI 8226），用化疗药物阿霉素处理2天。随后对细胞进行巴佛洛霉素 A1 处理，并进一步与 C₁₂FDG 共孵育。通过流式细胞术分析细胞。图1 展示了实验的各个步骤，并表明使用 C₁₂FDG 可在一天内测定衰老细胞的比例。首先将未标记的细胞上机进行流式细胞术检测。如图2A所示，在前向散射光（FSC）与侧向散射光（SSC）的散点图中设定一个感兴趣区域，以排除死亡细胞和细胞碎片。将该感兴趣区域内的细胞投射到直方图上，横轴显示 C₁₂FDG 的荧光信号（FL1），纵轴显示事件数。首先分析未经处理的细胞。如图2B所示，在微弱荧光标记的细胞群之后设置一个红色光标：非衰老细胞位于区域 U，而衰老细胞则位于区域 V。随后将经处理的细胞上机检测。如图2C（左图）所示，出现一群强荧光标记的细胞，位于.......

讨论

本文介绍了一种基于流式细胞术的方法，用于定量活体癌细胞中的细胞衰老。该方法基于使用膜通透性化合物 C₁₂FDG，因此只要细胞能够摄取该化合物，便可应用于任何细胞类型以及各种处理后的细胞。细胞摄取后，C₁₂FDG 被衰老细胞溶酶体中富集的 β-半乳糖苷酶水解。经激光激发后，该化合物发出绿色荧光，从而实现对衰老细胞的定量。这种绿色荧光的定量既可通过流式细胞术完成，也可通过荧光显微镜进行。然而，在后一种情况下，需由观察者手动计数荧光阳性细胞，较为耗时。由于 C₁₂FDG 可被 β-半乳糖苷酶水解，该方法除了可用于定量衰老细胞外，还可用于测定 β-半乳糖苷酶的活性及其主要存在于溶酶体囊泡中的定位情况。尽管该方法操作简便，但需特别注意第 3 步。成功检测衰老细胞在很大程度上依赖于溶酶体的合适 pH 值。为此，我们使用巴佛洛霉素 A1（bafilomycin A1）来中和溶酶体的酸性 pH。根据所用细胞类型的差异，此步骤可能并非必需。如果预期存在细胞衰老但未检测到染色信号，建议设置巴佛洛霉素 A1 的阴性对照（即不加巴佛洛霉素），并提高巴佛洛霉素 A1 的浓度。若采取此措施，需确保浓.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
5-十二烷酰氨基荧光素二-β-D-半乳吡喃糖苷	Invitrogen	D-2893
二甲基亚砜	Sigma	D2650
巴佛洛霉素 A1	Sigma	B1793
多柔比星	Sandoz
台盼蓝	Sigma	T8154
RPMI 1640 细胞培养基	Lonza	BE12-702
胎牛血清	PAA Laboratories GmBH	A15 101
抗生素	Gibco	5290-018
Galios 流式细胞仪	Beckman Coulter	A94291