本文介绍了一种利用光学显微镜分析果蝇（Drosophila）幼虫气管末端细胞的方法。该方法可快速检测整体动物中末端细胞的分支结构和管腔形态，适用于单个突变体的分析，或用于筛选影响末端细胞发育的突变。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
细胞形态对细胞功能至关重要。然而，尽管细胞形态具有重要意义，目前对于单个细胞如何产生特定形状仍知之甚少。Drosophila 气管末端细胞已成为一个强大的遗传模型，可用于鉴定并阐明在细胞形态发生过程中起关键作用的基因。末端细胞是分支状管状网络——即气管系统——的一个组成部分，该系统负责向内部组织供氧。末端细胞是研究细胞形态问题的理想模型，因为它们具有两种截然不同的细胞结构特征：第一，末端细胞具有复杂的分支形态，类似于复杂的神经元；第二，末端细胞的分支以细管形式存在，并含有由膜包被的细胞内管腔。对末端细胞分支数量、分支排列方式以及单个分支形态的定量分析，可为特定遗传机制在分支状细胞形成过程中的作用提供重要信息。对这些细胞中管腔形成过程的分析，有助于揭示在其他管状网络（如脊椎动物血管系统）中同样保守的管状结构形成机制。本文描述了可用于快速固定、成像以及分析 Drosophila 幼虫体内末端细胞分支模式和管腔形成的实验技术。这些技术可用于分析野生型与突变型个体，或遗传嵌合体中的末端细胞。由于本实验方案具有很高的效率，也特别适用于在 Drosophila 气管系统中进行遗传学、基于RNA干扰（RNAi）或药物筛选。
引言
细胞形态对于生物体内单个细胞的功能至关重要，同时也影响作为组织或器官一部分而发挥功能的细胞。我们利用Drosophila气管末端细胞——昆虫呼吸系统的一个组成部分——来研究参与调控两种保守的细胞形态类型的分子机制：分支形成和管腔形成（lumenogenesis）。末端细胞位于分支管状网络的末端，该网络负责将氧气输送至内部组织1，其具有复杂的分支形态，依赖于由靶组织局部氧浓度调控的FGF信号通路2。末端细胞的分支为细长的管状结构，每条分支内均含有一个充满气体的亚细胞管腔。由于末端细胞独特的细胞结构，以及在Drosophila中易于进行遗传学分析，这些细胞成为研究细胞突起、分支及细胞内管腔形成机制的理想模型。末端细胞已被证明是理解某些导致细胞分支分化、突起和成熟过程中的信号通路的有用模型2-4。利用该系统已开展无偏倚的正向遗传筛选，以寻找影响细胞形态发生的突变体，从而揭示了调控细胞形态的机制5,6。例如，这些筛选发现，特定的RabGAP蛋白对于管腔形成与定位过程中的细胞骨架极性和囊泡运输是必需的7；整合素介导的黏附作用对分支稳定性至关重要8；上皮细胞PAR极性蛋白调控了分支和管腔形成所依赖的极化膜运输过程9。其他在末端细胞中的研究还表明，肌动蛋白的不对称积累和微管的有序排列对于细胞伸长和管腔形成是必需的10。因此，多种保守的细胞生物学机制共同参与了末端细胞的形态发生过程。
本文介绍一种快速固定完整的三龄Drosophila幼虫以分析末端细胞分支和管腔形成的方法。该方案也可应用于一龄和二龄幼虫。该技术的关键在于能够通过完整幼虫的体壁直接观察由荧光蛋白表达进行遗传标记的末端细胞。由于该方法无需任何固定后的操作步骤（如抗体染色）即可观察细胞，因此特别适用于高通量分析，包括遗传筛选或药物筛选。荧光蛋白的表达可揭示细胞质填充的分支结构。通过明场显微镜可并行监测管腔的形成，识别其中充满气体的管腔结构，其与周围充满液体的组织形成明显对比。
本方案包含基于MARCM系统构建遗传嵌合体的方法11，以在整体未标记的个体中产生被荧光蛋白标记的纯合突变末端细胞。这是必要的，因为末端细胞只有在发育较晚期才会形成其复杂的结构；而通过遗传嵌合体技术，可以在发育早期绕过目标基因在其他组织中的必需功能。为了产生MARCM克隆，需使用气管特异性驱动子对气管进行标记 无气（btl）12. 此处描述的是该实验方案的 果蝇 X染色体；对于其他染色体，可采用类似方法，只需使用适用于待检测染色体的遗传试剂。此处通过表达细胞质定位的GFP标记气管，但表达其他荧光蛋白（如DsRed）同样适用于该方法。
此外，我们还引入了一种定量分析末端细胞分支模式和管腔形成的方法，该方法基于用于表征神经元分支模式的技术13。此类定量数据对于明确基因在分支或管腔形成过程中的精确作用至关重要，同时也可用于不同突变体之间的直接比较9。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
1. 嵌合体生成
- 遗传杂交
w FRT19A tub:GAL80 FLP122/Y; Btl-GAL4, UAS-GFP （雄性）与 * FRT19A/Bal（雌性）杂交，其中 * 代表待检测的突变体。注意：实验前至少一天设置杂交，以确保果蝇充分交配。 - 预产卵：将杂交果蝇转移至含有少量新鲜酵母糊的培养基小瓶中。在 25 °C 下产卵 1 小时。
- 产卵：将果蝇从预产卵小瓶转移至另一含有少量新鲜酵母糊的新鲜小瓶中。在 25 °C 下继续产卵 6 小时。
- 将成虫转移回预产卵小瓶中保存，用于后续实验。立即对含有 0–6 小时龄胚胎的产卵小瓶在 38 °C 水浴中进行 45 分钟热激处理。注意：培养基表面应低于水位，以确保所有胚胎均经历充分热激。
- 将热激处理后的小瓶在 25 °C 下继续培养 4–5 天，直至三龄幼虫开始爬行。
2. 筛选嵌合体动物
- 用精细镊子轻轻夹取试管壁上的游走期三龄幼虫，放入盛有预冷100%甘油的小型塑料培养皿中。
- 使用配备荧光光学系统的高倍解剖显微镜观察幼虫，鉴定气管细胞中具有荧光标记嵌合表达的个体。通常可在10–20倍放大倍数下完成观察。
3. 热固定
- 使用精细镊子小心地从培养皿中挑选出嵌合体动物，并置于一块75×25×1 mm白色玻璃载玻片上的一滴新鲜100%甘油中。注意：可将多个动物置于同一滴甘油中（图1A).
动物也可直接置于载玻片上的甘油滴中，但在固定过程中（步骤 3.2）需格外小心，因为样品会迅速升温，可能导致过度固定。 - 将载玻片置于70 °C加热块上，直至线虫刚好停止移动，每张载玻片加热时间不超过20秒，盖玻片为10秒图1B）。动物最初会扭动，但死亡后会停止活动，身体变得僵硬且伸长。注意：过长时间的加热会导致末端分支和管腔受损，同时使GFP信号变弱且弥散。为了获得最佳效率，建议将加热块放置在与显微镜相同的房间内。
- 使用精细镊子小心地将液滴中的所有幼虫调整为同一方向，使载玻片上所有幼虫相互平行排列（图1C).
- 轻轻将一块18x18 mm的盖玻片置于幼虫上方（或将盖玻片倒置在载玻片上），避免产生气泡图1D）。注意：盖玻片可能无法完全平整地覆盖在幼虫上，这不会造成问题。
- 在30分钟内对幼虫进行成像。热固定的末端细胞会降解，GFP信号将变得非常弥散。
4. 在体 气管末端细胞成像
- 将玻片置于体视显微镜的载物台上。使用5倍物镜找到动物背侧表面从头端到尾端走向的两条平行背侧主干（图1F）。定位位于两条背侧主干正中间的两个背侧终末细胞，以帮助确定用于分析的合适体节。
- 确定方位后，旋转动物以观察目标终末细胞。操作时，用镊子垂直于幼虫长轴方向，轻轻推动盖玻片边缘，使幼虫在盖玻片下缓慢滚动（图1E 和 图1G）。
- 选择正确的终末细胞对于在突变体之间获得一致结果和进行可靠比较至关重要。脂肪体分支（FB）终末细胞位于背侧主干旁、中线外侧，易于识别。外侧组G终末细胞（LG）也易于定位，位于腹侧中线稍偏外侧（图1H）。注意：最前端（Tr1）和最后端（Tr10）体节的终末细胞排列与其他体节不同。我们仅分析Tr2至Tr9体节中的终末细胞。背侧终末细胞的分支模式比其他气管终末细胞更具保守性，这可能依赖于额外的非细胞自主信号，在决定是否将其纳入分析时应予以考虑。
- 确定目标终末细胞后，使用合适的放大倍数拍摄图像；通常10倍或20倍物镜效果最佳（图2A）。注意：由于分支模式存在变异，应尽量拍摄包含尽可能多分支及分支末端的图像。
- 保持载物台不动，关闭荧光光源，打开透射光，获取同一细胞在同一焦平面的明场图像（图2B）。管腔将在终末细胞内部呈现深色对比。若计划对终末细胞的分支和管腔进行定量分析，应采集每个终末细胞多个焦平面的多张图像。
5. 使用 ImageJ 分析和量化末端细胞形态
- 使用 ImageJ（http://rsb.info.nih.gov/ij/）插件 NeuronJ（http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/）打开荧光图像和明场图像。
- 使用“添加轨迹”工具，手动追踪整个终末细胞的分支和管腔结构。
- 使用“标记轨迹”工具，对每条轨迹线重新命名并着色，以赋予其特定的标识。
- 使用“设置参数”工具，将线宽调整为 6–10 像素（适用于从连接复式显微镜的数字相机获取的 512×512 图像；对于更高或更低分辨率的相机，应相应地缩放像素宽度），其余参数均采用默认设置，然后选择“确定”。接着使用“生成快照”工具获取图像，选择“绘制轨迹”以生成可与原始图像并列显示的轨迹快照。
- 选择“测量轨迹”工具，并选择要测量的轨迹类型（i.e. 根据第 5.3 步中指定的标识选择需测量的分支）。然后选择“显示轨迹测量结果”和“清除先前的测量结果”，点击“运行”。系统将生成一个包含图像中各轨迹名称、标签、长度（以像素为单位）及其他数据的电子表格。该数据可保存为 Microsoft Excel 电子表格，用于后续的统计分析。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
结果如图2所示。一个单独的侧群（LG）末端细胞表现出广泛的亚细胞分支（通过GFP可视化；A），以及贯穿各分支的充满气体的亚细胞管腔（通过明场显微镜可视化；B）。这些图像采集自一只通过第1和第2节所述MARCM系统产生的嵌合L3幼虫，并按照第3和第4节所述方法进行热固定和成像。图C和D分别展示了根据第5节所述方法，利用NeuronJ对A和B图中的分支和管腔生成的轨迹图。图E和F显示了按照第3和第4节所述方法制备用于成像的幼虫中脂肪体（FB）分支的位置。请注意，在此示例中，该个体并非嵌合体，GFP在整个气管系统中均表达。图G和H展示了一个GFP标记的末端细胞因热固定时间过长的示例。GFP呈弥散状（G），分支结构已降解，部分管腔不再充满气体，因此在明场图像中表现为断裂。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
本文所述的热固定技术是一种快速且便捷的工具，用于成像黑腹果蝇（Drosophila）幼虫气管末端细胞。在此，我们利用该技术观察野生型细胞的分支结构和管腔形态。在热固定后，可通过幼虫体壁清晰地观察到由气管特异性启动子breathless驱动表达绿色荧光蛋白（GFP）的气管细胞。利用该方法可快速观察并测量单个末端细胞特有的分支模式及其充满空气的管腔结构。该技术同样适用于一龄和二龄幼虫。然而，在固定体型较小的样本时需格外小心，因为荧光蛋白的表达容易受到破坏。
在本方法中，我们描述了对在单个气管细胞中表达GFP的嵌合动物进行分析的技术。然而，相同的技术也可应用于多种实验操作下的气管细胞分析。例如，通过分子手段改变了基因表达的动物，无论是整个气管系统还是单个细胞中通过表达RNAi转基因或修饰蛋白所引起的改变，均可利用该方法进行检测。影响末端细胞发育的非遗传处理，如药物处理或低氧条件2,14，也可通过这些方法进行表征。在后一类情况下，必须使用一种能够在整个气管系统中持续表达GFP或其他荧光蛋白的Drosophila品系...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者声明不存在竞争性财务利益。
致谢
感谢吉莉安·斯坦菲尔德（Gillian Stanfield）对本文手稿的评论。T.A.J. 由美国国立卫生研究院国家普通医学科学研究所（NIH NIGMS）资助的犹他大学遗传学培训项目 T32-GM007464 支持。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 学生杜蒙特 #5 镊子 | Fine Scientific Tools | 91150-20 | |
| Leica MZ16 解剖显微镜（或同等产品） | Leica | MZ16 | |
| AxioImager M1 复式显微镜（或同等产品） | Carl Zeiss | 配备 AxioCam MRm、A-PLAN 10X/0.25、EC PLAN-NEOFLUAR 20X/0.5 和滤光片组 38HE | |
| 100% 甘油 | BioExpress | M152-4L | |
| 果蝇品系 | 基因型：w FRT19A tub:GAL80 FLP122; Btl-GAL4, UAS-GFP y w FRT19A | ||
| 果蝇品系 | 基因型：y w FRT19A |
参考文献
- Manning, G., Krasnow, M. A. Development of the Drosophila Tracheal System. The Development of Drosophila melanogaster. , 609-685 (1993).
- Jarecki, J., Johnson, E., Krasnow, M. A. Oxygen regulation of airway branching in Drosophila is mediated by branchless FGF. Cell. 99 (2), 211-220 (1999).
- Ghabrial, A. S., Krasnow, M. A. Social interactions among epithelial cells during tracheal branching morphogenesis. Nature. 441 (7094), 746-749 (2006).
- Ruiz, O. E., Nikolova, L. S., Metzstein, M. M. Drosophila Zpr1 (Zinc Finger Protein 1) Is Required Downstream of Both EGFR And FGFR Signaling in Tracheal Subcellular Lumen Formation. PLoS ONE. 7 (9), e45649(2012).
- Ghabrial, A. S., Levi, B. P., Krasnow, M. A. A systematic screen for tube morphogenesis and branching genes in the Drosophila tracheal system. PLoS Genetics. 7 (7), e1002087(2011).
- Baer, M. M., Bilstein, A., Leptin, M. A clonal genetic screen for mutants causing defects in larval tracheal morphogenesis in Drosophila. Genetics. 176 (4), 2279-2291 (2007).
- Schottenfeld-Roames, J., Ghabrial, A. S. Whacked and Rab35 polarize dynein-motor-complex-dependent seamless tube growth. Nat. Cell Biol. 14 (4), 386-393 (2012).
- Levi, B. P., Ghabrial, A. S., Krasnow, M. A. Drosophila talin and integrin genes are required for maintenance of tracheal terminal branches and luminal organization. Development. 133 (12), 2383-2393 (2006).
- Jones, T. A., Metzstein, M. M. A novel function for the PAR complex in subcellular morphogenesis of tracheal terminal cells in Drosophila melanogaster. Genetics. 189 (1), 153-164 (2011).
- Gervais, L., Casanova, J. In vivo coupling of cell elongation and lumen formation in a single cell. Curr. Biol. 20 (4), 359-366 (2010).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).
- Shiga, Y., Tanaka-Matakatsu, M., Hayashi, S. A nuclear GFP/ß-galactosidase fusion protein as a marker for morphogenesis in living Drosophila. Dev. Growth Differ. 38, 99-106 (1996).
- Meijering, E., Jacob, M., Sarria, J. -C. F., Steiner, P., Hirling, H., Unser, M. Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 58 (2), 167-176 (2004).
- Centanin, L., Dekanty, A., Romero, N., Irisarri, M., Gorr, T. A., Wappner, P. Cell autonomy of HIF effects in Drosophila: tracheal cells sense hypoxia and induce terminal branch sprouting. Dev. Cell. 14 (4), 547-558 (2008).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
