一种非侵入性方法 原位 雌性美洲龙虾交配成功率的测定Homarus americanus)

摘要

捕捞活动对已开发的甲壳类渔业（如美洲龙虾渔业）造成的改变，可能会影​​响其繁殖动态，导致雌性龙虾交配成功率下降。本研究旨在建立一种非侵入性方法，用于确定在生理或功能上已成熟的雌性龙虾的交配成功率。

摘要

尽管美国龙虾渔业是西北大西洋生产力最高的渔业之一，但关于其自然繁殖动态的许多方面仍不明确。近年来对已开发的甲壳类种群（如螃蟹和龙虾）的研究表明，在某些情况下，由于精子数量受限，成熟雌性可能无法实现其全部繁殖潜力。为了在不同区域的美国龙虾渔场中检验这一可能性，研究人员开发出一种可靠且非侵入性的方法，可在海上大规模采集雌性龙虾样本。该方法包括将一根钝头针插入雌性龙虾的精荚囊中，以检测是否存在精栓，并抽取样本以检查其中是否含有精子。为验证该技术的可靠性，研究人员在码头和实验室中开展了一系列对照研究。这些研究共采集了294只雌性龙虾，以确认精栓的存在是精荚囊内含有精子的可靠指标，从而反映其是否已完成交配。本文详细描述了该方法以及从全部样本中选取的一个子集所获得的结果。在来自马萨诸塞州乔治滩和科德角地区（甲壳长度范围为71–145 mm）的230只雌性龙虾样本中，90.3%的个体检测出含有精子。部分雌性龙虾未检测到精子的可能解释包括：未成熟（生理上尚未成熟）、在完成一批卵子受精后精栓已分解，以及缺乏交配行为。调查结果表明，这种用于评估雌性龙虾交配成功率的技术是一种可靠的替代指标，可在野外用于记录自然种群中的繁殖活动。

引言

美洲龙虾（Homarus americanus）是北大西洋地区产量最高的渔业资源之一（2011年产量约56,000公吨，价值超过3.9亿美元）¹。然而，目前对野生种群中该物种繁殖动态的理解仍普遍不足。获得更准确的繁殖输出估算数据，包括参与繁殖的个体数量及其体型大小，可能有助于改进资源评估过程。例如，由于精子限制而无法实现其全部繁殖潜力的雌性个体，已被确认为多种商业捕捞海洋甲壳类动物面临的潜在问题，其中包括：龙虾²、蓝蟹³、帝王蟹⁴、石蟹⁵和雪蟹⁶。本研究的总体目标是确定精子限制是否也可能成为美洲龙虾渔业某些区域中的影响因素。

在进行一项与抱卵雌性龙虾（具有明显完整、新产出的卵）无关的标记研究时，首次观察到龙虾可能存在精子限制问题的迹象。渔民的重捕报告显示，约15%的这类动物在仅1至2个月后便已脱落其卵块。初步假设认为，部分龙虾所携带的卵未受精，因而提前“脱落”⁷。后续研究的初步数据已证实，龙虾即使未成功交配也会产卵，而这些未受精的卵通常仅能携带约1个月⁸。因此，鉴于在自然种群中已观察到雌性携带未受精卵的现象，我们旨在探究精子限制在多大程度上导致了性成熟龙虾的繁殖水平低于最大潜力。为实现这一目标，我们建立了一种检测雄性在交配过程中沉积精荚的技术。

本文和视频介绍了一种用于确定雌性龙虾交配成功率的非侵入性、简便方法。该技术可在海上快速、可靠地应用，适用于科研或商业捕捞船只。本文展示了该取样方法的详细步骤以及一些代表性结果，以说明该技术的应用。

方案

第一部分A：野外采样技术

1. 雌性个体测量

1. 对于每只雌性龙虾，使用游标卡尺测量其头胸甲长度（CL）和第二腹节宽度，精确至1.0 mm。
   注意：选择测量第二腹节是因为腹部宽度（雌性龙虾携带卵的部位）是性成熟的一个指标。此外，确定蜕皮阶段可能有助于后续将这些数据与生殖阶段相对应（见步骤1.2）。
2. 剪取其中一条腹肢末端的一小部分（龙虾研究中的标准方法学操作），并将腹肢保存在洁净的海水中，以便后续在解剖显微镜下观察⁹。
   注意：此步骤还可能揭示腹肢上是否存在粘液腺，粘液腺的存在表明雌性正准备产卵¹⁰。

2. 针头插入

1. 将注射器针头（18 G，参见表1）以约45°角朝尾部方向插入精囊受体约1 cm处（图1）。
   注意：对于具有完整精栓的龙虾，插入针头时可能会遇到一定阻力，因为针头需穿过精栓才能到达精囊受体底部精子浓度最高的区域（图1）。
   注意：精栓的存在本身即是龙虾已交配的可靠指标。在某些个体中，插入时阻力可能很小，可能是因为不存在精荚、精荚体积较小、尚未硬化成栓状，或已用于使一个或多个卵团受精。

图1. 针头插入及龙虾精囊的观察。 将钝头针插入龙虾的精囊以采集精液样本。针头的角度和深度对于获得一致的样本均至关重要。右图：已解剖并沿垂直方向切开的精囊视图。精栓位于精囊的上部或最外层部分，而精子则位于精囊底部（最深处）。需要注意的是，采样深度若超过此位置，可能会刺穿精囊，导致样本被血液污染。 点击此处查看大图。

3. 穿透精液栓

1. 初次插入后，将针头角度调至接近垂直（与身体纵轴垂直），并非常缓慢地向下推进至接收器中。
2. 保持针头倾斜，使针尖略微朝向尾部方向。此时针尖会压迫塞子顶部，直至最终穿透进入基质。
3. 继续缓慢向下推动针头，直到再次感受到阻力——即为接收器底部，此处即为取样位置。

4. 精子去除

1. 从纳精囊底部取出样品（通常为固体栓状物、液体精子及其他液体），并将样品放入已标记的 2.0 ml 塑料管中。
2. 用约 0.1–0.5 ml 冷海水冲洗纳精囊。
3. 吸取约 0.3 ml 液体，加入同一根试管中。
4. 将精子样品置于冰上保存，直至可在实验室进行观察。
   第二部分：实验室中精子样品的观察
   注意：应检查从个体龙虾纳精囊中取出的样品，以确定是否存在精子细胞。
5. 从每根塑料管中取出约 50 µl 液体，置于载玻片上并加盖盖玻片，在复式显微镜下以 100 倍放大倍数进行观察。
6. 将样品评分分为：精子稀少、丰富或缺失（本研究未对精子实际数量进行定量，图 2）。

图 2. 龙虾精子样本图像。 从雌性龙虾精囊中提取的精子样本在光学显微镜下以 40 倍放大倍数观察所得图像。左侧图像显示含有大量精子的样本，而右侧图像则显示精子稀疏的样本（比例尺 = 10 μm）。点击此处查看高分辨率图像。

结果

本文报告的数据来自一组雌性龙虾，这些龙虾分别采自近岸和远岸海域。近岸组包括44只龙虾，采自马萨诸塞州科德角附近沿海水域，用冷藏箱运送到实验室进行检测。远岸组共186只龙虾，采自乔治海岸外大陆架，在新罕布什尔州的一处商业暂养设施中进行取样。

所有动物的精子样本均被采集，并立即根据上述方法检测精包中是否存在精子。该亚组中，共有90.3%的雌性个体在储精囊中发现有精子。令人意外的是，未检测到精子的个体并不一定处于体型范围的较小端（图 3）。

讨论

本视频和论文概述并演示了一种用于判断雌性龙虾是否成功交配的方法。该方法操作简便，可供不同用户在海上对龙虾进行大规模取样。该方法基于检测精囊受体中是否存在交配过程中由雄性传递给雌性龙虾的精荚。这些精荚在进入受体后不久会部分硬化形成精栓，因此精栓的存在也可作为成功交配的指标。在本研究以及随后的一项更大规模的研究中，发现大多数精栓均伴有精子¹¹。然而，尽管精栓的存在是交配行为的可靠指标，但其缺失并不能说明未发生交配。

尽管我们无法完全确定这种取样方法是否会对雌性龙虾产卵及成功受精卵块的能力产生负面影响，但该精子取样方案的某些方面表明，对精荚或纳精囊造成的损伤可能极小。已有数据（来自正在进行的实验室研究）显示，部分龙虾在精子取样后仍能排出已受精的卵块（n=3），并能够利用同一精荚使多个卵块受精。这些卵的发育和孵化情况与未取样的龙虾相似。此外，该取样技术仅采集总精子中的一小部分，其目的并非定量获取纳精囊的全部内容物。由于纳精囊具有复杂的物理结构^12,13，若要获得此类结果，需采用其他技术（例如 解剖法）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
游标卡尺	Mitutoyo Digimatic	500-196-20	http://www.globalindustrial.com
3 ml 鲁尔锁注射器	Beckton-Dickinson	309585	www.bd.com
Monject 铝制针座钝头针，18 G × 1	Webster Veterinary	8881202348	www.mywebstervet.com
2.0 ml 塑料储存管	Eppendorf	wu-06333-72	http://www.coleparmer.com
带冰的聚苯乙烯泡沫保温箱
复合光学显微镜	Olympus	BH System	http://www.olympusamerica.com
带盖玻片的载玻片			75 mm × 25 mm，厚度约 1 mm
带一次性吸头的移液器