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利用激光照射对半完整神经组织进行光遗传学干预以调控神经活动 果蝇 运动中的幼虫

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DOI：

10.3791/50513

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2013年7月4日

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1Department of Complexity Science and Engineering, Graduate School of Frontier Sciences, The University of Tokyo, 2Department of Physics, Graduate School of Science, The University of Tokyo

本文内容

摘要

在此，我们描述了一种在半离体条件下通过光遗传学手段操控运动神经元活动，同时监测运动输出（肌肉收缩）变化的实验方案。 果蝇 利用传统共聚焦显微镜中的激光照射幼虫。该技术可实现对少数神经节段内神经活动的局部扰动，从而阐明运动神经回路的动力学机制。

摘要

Drosophila 幼虫运动是发育和生理神经科学中一个极佳的模型系统，其优势在于神经回路中基本神经元组分具有良好的遗传可操作性1-6。在幼虫神经回路中应用光遗传学技术7,8，可实现对神经元活动在空间和时间上的精确操控9-13。通常情况下，样本通过汞灯或LED进行广泛照明，而对目标神经元的特异性控制则依赖于二元基因表达系统，例如Gal4-UAS系统14,15。在本研究中，为了将空间分辨率提升至“亚遗传分辨率”水平，我们利用常规共聚焦显微镜中的激光对腹神经索中特定神经元亚群进行局部照射。在监测半离体幼虫体壁运动的同时，我们分别通过通道视紫红质16,17或卤视紫红质18-20对神经活动进行交互式激活或抑制。通过对神经组织进行时空受限的照明，我们能够在行为的特定阶段精确操控神经回路中特定神经元的活动。该方法有助于研究腹神经索中局部神经元集群的活动与运动输出时空模式之间的关系。

引言

果蝇幼虫的前向蠕动运动是通过肌肉收缩从后部向头部体节传播而实现的。这种运动由腹神经索中沿身体纵轴分布的运动神经元依次激活所介导。为了研究这种模式化传播活动背后的神经环路机制，对神经活动进行局部干扰可能是一种有效的研究手段。尽管药理学方法可以控制神经组织中特定物质（如神经递质）的作用，但由于幼虫腹神经索沿纵轴由多个结构相似的神经节重复组成，药理学药物的作用在几乎所有体节中都可能相似。另一种方法是在少数几个体节中表达光遗传学或温度敏感型探针分子。然而，构建仅在特定体节表达的gal4品系非常困难。本文介绍一种利用激光照射来操控少数体节内神经元活动的方法。借助共聚焦显微镜中空间受限的照明特性，可对局部区域的神经元活动进行干扰。结合特定神经元亚群gal4品系驱动的探针表达模式，该激光照射方法显著提高了干扰操作的空间分辨率。此外，由于该方法仅需使用常规的共聚焦显微镜，通常无需额外购置实验设备。

利用该技术，我们研究了运动神经元活动在运动输出传播过程中的作用13。通过在幼虫进行蠕动运动时阻断少数几个体节内运动神经元的活动，我们得以检验运动神经元自身的活动是否为运动输出信号传播所必需。对运动神经元进行局部且短暂的阻断后，蠕动运动的传播即被中止。当阻断解除后，传播重新出现在波形被中止的体节处。这一现象表明，在缺乏运动神经元激活的情况下，传播性波形无法沿腹神经索进一步推进，因此运动神经元的激活对于蠕动运动是必需的。我们此前已在 Inada et al. (2011) 13 中对该现象进行了详细的数据报告与讨论。本文中，我们描述了一种在实时监测离体幼虫运动的同时，交互式干扰神经活动的方法。通过使用多种 gal4 品系以及不同的时空模式来操控神经活动，研究者可借助运动环路在扰动下的响应特性，探究其神经环路的运作逻辑。

方案

1. 幼虫制备

  1. 在含有标准果蝇培养基的塑料瓶中维持 OK6-Gal4, UAS-ChR2 或 OK6-Gal4, UAS-NpHR2 果蝇品系。
  2. 在苹果汁琼脂平板上涂抹含有适当浓度全反式视黄醛（ATR）的酵母菌液（ChR2 使用 1 mM，NpHR2（简称 NpHR）使用 10 mM）。
  3. 选取2nd 或 3rd 将vial中的龄期幼虫转移至含有ATR的培养皿中。
  4. 在黑暗条件下于 25 °C 培养适当时间（ChR2 为 1 天，NpHR 为 2 天）。

2. 显微镜设置

  1. 使用C型接口（放大倍数0.35倍）将CCD相机（XCD-V60，Sony）连接至常规共聚焦显微镜（本实验中使用FV1000，Olympus）。
  2. 如果从物镜到CCD相机的光路中存在快门，并且在激光扫描期间会关闭，则应小心将其移除。由于此步骤取决于显微镜的具体配置，如有需要，请联系显微镜制造商以获取技术支持。

3. 解剖

  1. 用清水冲洗ATR喂养的幼虫，以去除体表残留的食物。
  2. 将幼虫置于涂有Sylgard的培养皿中，背面向上（背面有两条沿背中线两侧纵向延伸的气管）。Sylgard涂层厚度约为5 mm。
  3. 用镊子（#5 Inox，FST by Dumont，瑞士）将一枚昆虫针（Austerlitz昆虫针，Φ0.10 mm，不锈钢）插入尾部两条气管之间的位置。该针长约10 mm，应弯折或剪短至足够长度（约2 mm），以避免触碰并损伤物镜表面。然后将第二枚昆虫针插入幼虫头部口钩附近——口钩为位于前端的黑色爪状结构。
  4. 加入无Ca2+的正常生理盐水（NaCl 140 mM，KCl 2 mM，MgCl2 6 mM，HEPES-NaOH 5 mM，蔗糖 36 mM（pH 7.1）），以保持幼虫湿润。
  5. 用显微剪刀（MB-50-7，Napox，日本）在尾部附近做一小切口。
  6. 从该切口开始，沿背中线向头部方向做纵向剪开。注意不要损伤腹神经索（VNC）及其轴突。
  7. 在头部侧面做一小切口。
  8. 在解剖后的体壁四角各插入一枚固定针。体壁应适度拉伸，以便观察体壁的节段性结构，但不可过度拉伸而妨碍蠕动运动。
  9. 除去除脑和腹神经索以外的所有内脏器官，并用无Ca2+的正常生理盐水冲洗样品。
  10. 通过调整体壁上昆虫针的位置和方向，使腹神经索保持双侧对称。为固定腹神经索的位置，将一枚针穿过脑与口钩之间的组织，插入至Sylgard基底。
  11. 将溶液更换为含2 mM Ca2+的Ringer溶液（NaCl 130 mM，KCl 5 mM，MgCl2 2 mM，CaCl2 2 mM，HEPES-NaOH 5 mM，蔗糖 36 mM（pH 7.3））。

4. 激光照明成像

  1. 在共聚焦显微镜上安装 4 倍干式物镜（UPlanSApo 4x，NA 0.16，Olympus，日本），并将幼虫样本置于载物台上。
  2. 使用红色激光（633 nm）获取解剖样本的透射图像，以在共聚焦显微镜下定位腹神经索。在此扫描过程中，务必避免使用 488 nm 或 559 nm 激光，以免分别对 ChR2 或 NpHR 产生非预期的刺激。
  3. 在透射图像上定义感兴趣区域（ROI）。使用放大模式有助于更精确地确定 ROI。
  4. 更换显微镜的滤光片组，以 488 nm 或 559 nm 光进行照明。
  5. 使用卤素灯照射样本，以观察体壁结构。可通过共聚焦显微镜附带的 CCD 相机对样本进行实时监测。
  6. 记录体壁的运动情况，并在监测运动的同时切换激光束的开启与关闭。

结果

利用ChR2对运动神经元进行局部和瞬时激活。

我们在运动神经元中表达了ChR2。从每个腹神经索（VNC）节段发出的运动神经元轴突投射至体壁的相应节段。当使用蓝激光刺激腹神经索的一个或两个节段时，相应节段的肌肉出现收缩（图1）。

使用 NpHR 对运动神经元进行局部和瞬时抑制。

我们在运动神经元中表达了NpHR。在体壁进行蠕动性肌肉收缩期间，当使用黄光激光刺激腹神经索的少数（1~2）个节段时，传播的收缩波在体壁相应节段处停止（图2）。随后，当关闭激光照射时，收缩波从停滞的节段重新启动13。

肌肉收缩示意图和显微镜图像；蓝光开关；前后方向。
图1. 使用ChR2对运动神经元进行局部激活。 A. 对去内脏标本进行局部激活的示意图。通过蓝光照射表达ChR2的腹神经索的少数几个体节，可引起相应体节的肌肉收缩（箭头所示）。B. 解剖后幼虫的透射图像。对腹神经索的局部照射（箭头所示）可诱导体壁肌肉的节段性收缩（箭头所示）。

肌肉收缩与舒张示意图，显示光对肌纤维的作用及显微镜图像。
图2. 使用NpHR对运动神经元进行局部抑制。 A. 局部抑制去皮制备标本的示意图。通过黄光照射表达NpHR的腹神经索的少数节段，可使在自发性蠕动运动过程中发生的肌肉收缩（上方箭头所示）得到舒张（下方箭头所示）。B. 解剖后幼虫的透射图像。对腹神经索的局部照射（箭头所示）使自发收缩的体壁节段（箭头所示）发生舒张。

讨论

对神经活动进行时间和空间上的精确扰动，是分析神经环路网络动态的宝贵技术。在本实验方案中，我们介绍一种利用激光进行光遗传学操控神经活动的方法。由于激光具有高度的方向性，相比使用汞灯或氙灯的宽场刺激，能够实现更局域化的光遗传刺激。尽管此前已有研究将激光照射应用于光遗传学，但大多数研究需要特殊的装置，例如玻璃光纤、显微操作器和激光光源。在本方案中，我们采用常规的共聚焦显微镜进行局域照明。由于共聚焦显微镜系统已被广泛使用，该方法将使更多实验室有机会开展高分辨率的光遗传学研究。

该实验方案有两个关键点：幼虫解剖和激光功率。首先，如果在解剖过程中脑、腹神经索或运动神经受到损伤，幼虫将表现出减弱甚至完全缺失的自发性蠕动运动。因此操作必须精确，尤其是在使用弹簧剪刀在背侧做切口以及用镊子去除内脏器官时。有关解剖的详细步骤此前已有报道21。其次，为了实现充分的刺激，ChR2所需的激光功率约为0.1~1 mW/mm2，而NpHR则需要1~10 mW/mm2。我们通过物镜下方的总光功率除以估计的照射面积来评估激光功率。使用功率计（mobiken，Sanwa M.I. Technos，日本）测量总光功率。照射面积的估算基于圆周常数乘以激光波长的平方，该计算大致给出衍射极限下的照明区域。样品上的有效照明功率不仅可通过调节激光输出功率进行调整，还可通过改变扫描速度和重复次数来控制。我们以20-100 μsec/像素的速度扫描63次。此外，光遗传学蛋白的表达水平以及全反式视黄醛（ATR）的用量也对刺激效率至关重要。因此，若幼虫未表现出光遗传学反应，应检查并纠正以下几点：1）激光功率（通过优化显微镜系统），2）光遗传学蛋白的表达水平（通过核对基因型和培养温度），3）ATR的用量（通过调整ATR浓度和饲喂时间）。目前尚不清楚为何NpHR所需的ATR浓度高于ChR213。在含有较低浓度ATR（例如 0.1 mM）的培养基中培养的幼虫，ChR2仍能良好发挥作用，低于本文所述浓度（1 mM）。由于将幼虫饲喂至1 mM ATR已足以使ChR2具备光反应性，我们建议在首次进行ChR2实验时采用此浓度。后续可从1 mM开始逐步降低ATR浓度进行滴定。关于ATR的暴露时间，我们推荐采用本文所述的时间以确保稳定的光遗传学控制。当ATR饲喂时间较短时，我们常无法观察到光遗传学反应。

在本实验方案中，激光照射和图像采集由一台独立的计算机控制。因此，CCD相机对激光照射时空模式的清晰检测对于数据分析至关重要。如果CCD图像上的激光光斑或光线条纹较暗，应优化卤素灯的功率和CCD相机的增益值，以在保持体壁可见的同时清晰显示激光照射。

本方案中所示的空间-时间光照可提供有关幼虫运动神经环路的信息；然而，该方法也存在一些局限性。在“空间”方面，光照位置是通过用于录制体壁运动的低倍率CCD图像记录的。因此，光照区域只能定位到体节水平，而无法达到细胞水平。在“时间”方面，共聚焦显微镜启动激光扫描与实际激光光照之间的时间延迟取决于共聚焦显微镜系统及扫描条件。因此，需要通过反复试验来调整光照时机。由于可以使用ImageJ等适当的软件在CCD图像视频中确定光照时间，时间分辨率的关键因素在于CCD相机成像的帧率。我们通常将帧率设置为每秒7.5至15帧。

光遗传学工具的进步为我们改进该方案提供了机会。我们使用了3rd 具有 OK6-Gal4 和 UAS-ChR2[H134R] 或 UAS-NpHR2 的龄期幼虫。其他光遗传学工具（如 ChR2[T159C/E123T]、NpHR3 或 Arch）可替代 ChR2[H134R] 或 NpHR2，以提高活动控制的效率22此外，使用其他gal4品系或在其他发育阶段进行分析，可以提供更多关于运动神经环路的信息。

在此方案中，通过CCD相机采集体壁收缩的透射图像来监测运动活性。利用钙敏感型荧光分子监测运动神经元的活性（例如 GCaMP）也可以在使用 ChR2 或 NpHR 操控神经活动的同时进行直接监测。在此情况下，需对大范围区域施加蓝光照射，并使用高灵敏度的 CCD 相机（例如 EMCCD相机）来替代卤素灯和前文所述的普通CCD相机。为了在监测体壁运动的同时提高刺激的空间分辨率，可采用额外的物镜作为更先进的方法：通过高倍率物镜对腹神经索进行照明例如 40倍）从样品上方观察，并通过低倍物镜监测体壁例如 样本下方4倍。这种双透镜系统可能使我们能够以更高的空间分辨率刺激神经系统。

此处展示的方案可应用于其他神经回路，前提是能够在神经系统中表达光遗传学工具，并建立能够将足够光照递送至神经组织的实验准备条件。

披露

未声明任何利益冲突。

致谢

本研究由日本文部科学省创新领域科学研究中心项目“介观神经环路”（编号：22115002）和“综合脑科学网络”（编号：221S0003）向 A.N. 提供的科研经费，以及日本学术振兴会（JSPS）青年科学家B类研究资助（编号：21700344）向 H.K. 提供的科研经费支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
BX61WI 显微镜Olympus CorporationBX61WI
Fluoview FV1000 共聚焦系统Olympus CorporationFV1000
CCD 相机SonyXCD-V60
all-trans 视黄醛SigmaR2500-500MG溶于 95% EtOH 的 200 mM 储存液
Silpot184Dow Corning Toray3255981

参考文献

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