双分子荧光互补流式细胞仪分析:高通量的定量方法研究蛋白质 - 蛋白质相互作用

Summary

流式细胞仪分析双分子荧光互补提供了一种高通量定量研究蛋白质相互作用的方法。此方法可用于测绘的蛋白结合位点，并用于筛选调节蛋白 - 蛋白相互作用的因素。

Abstract

其中的方法来研究细胞内蛋白质相互作用，双分子荧光互补（附设）是相对简单和敏感。附设是根据生产的荧光使用两个非荧光的荧光蛋白的片段（金星，黄色荧光蛋白的变型中，这里使用的是）。非荧光金星片段的（VN和VC）的两个相互作用的蛋白质（在这种情况下，AKAP-LBC和PDE4D3）稠合，得到的荧光由于VN-AKAP-LBC-VC-的PDE4D3相互作用和形成荧光蛋白的功能细胞内。

附设提供的蛋白质复合物的亚细胞定位和蛋白质相互作用的强度，根据荧光强度的信息。但是，附设分析用显微镜量化蛋白 - 蛋白相互作用的强度是耗时且有些主观的，因为蛋白表达的异质性和相互作用。通过耦合流式细胞仪分析与附设的方法，荧光附设的蛋白 - 蛋白相互作用的信号可以精确地测量在短时间内大量的细胞。在这里，我们展示了这种方法的应用程序AKAP-LBC的互动所需要的地区PDE4D3映射。这种高的通过方法可以应用于筛选因子，调节蛋白 - 蛋白相互作用。

Introduction

650000蛋白质-蛋白质相互作用，估计存在于人类的相互作用组，发挥着重要的角色，在维持正常的细胞功能^1,2。除了 ​​免疫共沉淀（CO-IP）的黄金标准蛋白质相互作用研究从细胞裂解物，一些蛋白质片段互补分析（PCA）已发展到提高灵敏度检测细胞内的蛋白质相互作用^3。这些技术包括福斯特共振能量转移（FRET），生物发光共振能量转移（BRET），和双分子荧光互补（附设^）4,5。附设是基于荧光蛋白的两个片段（在这里我们使用金星，YFP变种），分别融合到一个潜在的相互作用的蛋白伙伴（在本示例中，我们使用AKAP - LBC和PDE4D3）促进协会。相互作用的两种蛋白质在细胞内的查询结果以功能性荧光的兴趣，它可以是由f可视化luorescence显微镜可以使用活的或固定的细胞^6,7,8。相较于其他的PCA，附设敏感的和技术上的挑战，有潜力在活细胞中的细胞定位研究。然而，这种技术的主要缺点是，一旦形成，荧光蛋白复合物不能被逆转。因此，它是不是一个很好的方法来研究动态蛋白质相互作用。在本文中，我们使用附设映射AKAP - LBC PDE4D3的相互作用位点监测的荧光强度金星。相比传统的分析，使用荧光显微镜，这是费时和劳动密集的（如果不进行使用自动化高通过机械），流式细胞术十万个单元格在一个异构的人口提供了一个简单的定量分析，在很短的时间^{9， 10。}在这里，我们开展了流式细胞附设分析和传统的合作IP并排侧比较，表明2米然而，et....

Protocol

1。细胞转染

1. 板细胞转染前一天，电镀免疫细胞较少。
   1. 的免疫:在6孔的板，涂层的玻璃盖玻片（1）用0.02％的明胶在37℃下至少4小时，洗一次的介质，并为每个反应孔，板1×10 ⁵ HEK 293T细胞在2毫升的完整的​​生长培养基[Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）中加10％FBS]。
   2. 对于流式细胞术和Western blot分析:板1.2×10 ⁵ HEK 293T细胞/孔，在2毫升完全培养基的6孔板（0.3×10 ⁵的HEK 293T细胞在0.5ml完全培养基的24孔板中，每孔）。
2. 准备用于转染的DNA，根据制造商的协议:Effectene（Qiagen公司）用于免疫荧光。中转-LT1（Mirus公司）用于流式细胞仪和Western blot分析。下面列出了所使用的DNA量。

   	24孔培养板（纳克）	6孔板（纳克）
   CFP矢量	10	50
   VN N-AKAP - LBC	200	1000

Results

AKAP-LBC和PDE4D3的结构（ 图1B）的融合VN和VC片段，分别AKAP - LBC和PDE4D3结果功能YFP的荧光（ 图1A）的相互作用。在这里，我们使用地图AKAP - LBC结合位点PDE4D3附设的方法。 PDE4家族蛋白中上游保守区域1（UCR1），，上游保守区域2（UCR2）和催化区（CAT）是保守的，因此，全长度（FL），UCR1和UCR2加CAT被用于筛选结合部位的PDE4D3 AKAP-LBC。 VN-AKAP-LBC和VC-PDE4D3片段在HEK 293T细胞荧光结果的表达，用不同的强度（ 图1C）。附设表明UCR1和UCR2 + CAT向AKAP-LBC PDE4D3的相互作用。更大的荧光强度造成AKAP - LBC-UCR1互动，AKAP - LBC-UCR2 + CAT相比，表明PDE-UCR1结合AKAP-LBC优于PDE-UCR2 + CAT。

Discussion

附设一个简单而敏感的方法来研究蛋白质相互作用。然而，此方法可以不被使用，以确定新的蛋白质 - 蛋白质相互作用，它是特别方便的，以确认细胞内的蛋白 - 蛋白相互作用和学习功能性质，如细胞内的本地化的蛋白质复合物，蛋白质 - 蛋白质相互作用的网站的映射，并筛查，可以调节蛋白质相互作用的小分子/肽。 ，因为VN和VC片段的非荧光，荧光背景低，从而帮助检测灵敏度。需要时间来成熟/稳定VN-蛋白-VC-蛋白质相互作用，从而延迟可视化蛋白质相互作用，并因此可能凭经验确定最佳的时间点。还应当指出的是，VN-蛋白质-VC-蛋白质相互作用是不可逆的，因此，不幸的是，与目前的金星附设构造，该法是不适合吨Ø研究动态蛋白质 - 蛋白质相互作用动力学。

附设分析适当的控制是非常重要的。一个合适的阴性对照包括非相互作用的蛋白质，或在相关的附设矢量的非特异性肽，或者如果可能的话，会破坏的突变体蛋白 - 蛋白相互作用。空附设载体是不是一个很好的控制，因为它会导致非特异性高背景荧光。如果附设中没有观察到两个相互作用的蛋白质，表达进行分析。此外，附设信号可能取决于蛋白质 - 蛋白质相互作用位点。应当指出的是，也可能会.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
Dulbecco’s 修改后的 Eagle’s 培养基 （DMEM）	Invitrogen	11965-092
青霉素-链霉素（笔/链球菌），100x	Invitrogen	15070-063
胎牛血清 （FBS）	Invitrogen	16000-044
抗 Flag 抗体	Sigma	M2，F1804
抗 HA 抗体	Covance	16B12，MMS-101R
α-微管蛋白	Sigma	DM1A，T9026
抗 GFP 抗体	Clontech	632569
细胞培养板，6 孔组织培养处理	Thermo Fisher Scientific	130184
HEK 293T 细胞	ATCC	CRL-11268
大提质粒纯化试剂盒，高速	Qiagen	12663
Dulbecco’s 磷酸盐缓冲盐水 （DPBS），无菌 1x	Invitrogen	14190-144
胰蛋白酶-EDTA，0.05% （w/v）	Gibco	25300
用于 FACS 染色的聚苯乙烯圆底管	BD Biosciences	352052
多聚甲醛	Fisher Scientific	S74337MF
Prolong gold 抗淬灭试剂，含 DAPI	Invitrogen	P-36931
Superfrost plus 显微镜载玻片	Fisher Scientific	12-550-15
Fisherfinest 高级盖玻片	Fisher Scientific	12-548-5P
EQUIPMENT
CO2 气套培养箱	NuAIR DH 自动流动
显微镜 LSM510 META	Carl Zeiss， Inc
电泳和传输装置	Biorad
Cyan ADP 流式细胞仪	Beckman Coulter