双分子荧光互补的流式细胞术分析为研究蛋白质-蛋白质相互作用提供了一种高通量的定量方法。该方法可用于绘制蛋白质结合位点图谱，以及筛选调控蛋白质-蛋白质相互作用的因素。
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摘要
摘要
在研究细胞内蛋白质-蛋白质相互作用的方法中，双分子荧光互补（BiFC）技术相对简单且灵敏。BiFC 技术基于使用一种荧光蛋白的两个非荧光片段（此处使用黄色荧光蛋白变体 Venus）产生荧光信号。将非荧光的 Venus 片段（VN 和 VC）分别与两个相互作用的蛋白质（本例中为 AKAP-Lbc 和 PDE4D3）融合，当发生 VN-AKAP-Lbc-VC-PDE4D3 相互作用时，可在细胞内重新形成具有功能的荧光蛋白，从而产生荧光信号。
双分子荧光互补（BiFC）技术可根据荧光强度提供蛋白质复合物的亚细胞定位信息以及蛋白质相互作用强度的信息。然而，利用显微镜进行BiFC分析以量化蛋白质-蛋白质相互作用强度时，由于蛋白质表达和相互作用存在异质性，该方法耗时较长且具有一定主观性。通过将流式细胞术分析与BiFC技术相结合，可在短时间内准确测量大量细胞中的荧光BiFC蛋白质-蛋白质相互作用信号。本文展示了该方法在绘制PDE4D3中与AKAP-Lbc相互作用所必需区域中的应用。这种高通量方法可用于筛选调控蛋白质-蛋白质相互作用的因素。
引言
据估计，人类相互作用组中存在约 650,000 种蛋白质-蛋白质相互作用，在维持正常细胞功能中发挥着关键作用1,2。除了共免疫沉淀（co-IP）这一从细胞裂解液中研究蛋白质-蛋白质相互作用的金标准方法外，目前已开发出多种蛋白质片段互补检测法（PCA），以提高在细胞内检测蛋白质-蛋白质相互作用的灵敏度3。相关技术包括 Förster 共振能量转移（FRET）、生物发光共振能量转移（BRET）以及双分子荧光互补（BiFC）4,5。BiFC 技术基于两个荧光蛋白片段（本文使用 Venus，一种 YFP 变体）的促进性结合，这两个片段分别与潜在相互作用的蛋白质伴侣融合（本示例中为 AKAP-Lbc 和 PDE4D3）。当目标蛋白质在细胞内发生相互作用时，可形成具有功能的荧光蛋白复合物，从而产生可检测的荧光信号，可通过荧光显微镜在活细胞或固定细胞中进行观察6,7,8。与其他 PCA 方法相比，BiFC 具有较高的灵敏度且技术难度较低，适用于研究活细胞中蛋白质的亚细胞定位。然而，该技术的主要缺点在于，一旦荧光蛋白复合物形成便不可逆转，因此不适合用于研究动态变化的蛋白质-蛋白质相互作用。在本研究中，我们利用 BiFC 技术通过监测 Venus 的荧光强度来绘制 PDE4D3 与 AKAP-Lbc 之间的相互作用位点。与传统的荧光显微镜分析相比（若未采用自动化高通量设备，则该方法耗时且劳动强度大），流式细胞术可在短时间内对异质细胞群体中的数千个细胞进行直接的定量分析9,10。本文通过并行比较流式细胞术-BiFC 分析与传统 co-IP 方法，证明两种方法可获得可比的数据结果，但流式细胞术 BiFC 分析更节省时间且所需样本量更少，因而在目标细胞数量有限时更具优势。
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方案
1. 细胞转染
- 转染前一天接种细胞，进行免疫荧光实验时接种较少数量的细胞。
- 用于免疫荧光：在6孔板中，将盖玻片（每孔1片）用0.02%明胶在37 °C下包被至少4小时，用培养基洗涤1次，然后每孔接种1 × 105个HEK 293T细胞于2 ml完全生长培养基中[DMEM培养基（Dulbecco改良Eagle培养基）加10%胎牛血清（FBS）]。
- 用于流式细胞术和Western blot分析：在6孔板中每孔接种1.2 × 105个HEK 293T细胞于2 ml完全生长培养基中（或在24孔板中每孔接种0.3 × 105个HEK 293T细胞于0.5 ml完全生长培养基中）。
- 根据制造商说明书准备用于转染的DNA：免疫荧光实验使用Effectene（Qiagen），流式细胞术和Western blot分析使用TransIT-LT1（Mirus）。所用DNA量如下表所示。
使用Effectene进行转染（6孔板）：24孔板（ng） 6孔板（ng） CFP-载体 10 50 VNN-AKAP-Lbc 200 1000 VCN-PDE4D3-FL（全长PDE4D3） 2.5, 5, 10, 20, 40, 80 100 VCN-PDE4D3-UCR1（含UCR1结构域的PDE4D3 N端片段） 100 VCN-PDE4D3-UCR2+CAT（含UCR2和催化结构域的PDE4D3 C端片段） 100 - 将指定量的质粒DNA与4 μl增强剂加入100 μl EC缓冲液中，混匀，在室温下孵育5分钟。
- 加入5 μl Effectene，混匀，在室温下孵育10分钟，然后逐滴加入细胞中。
- 将指定量的质粒DNA加入无菌管中的250 μl（6孔板）或50 μl（24孔板）Opti-MEM I无血清培养基中。
- 将TransIT-LT1试剂加入稀释后的DNA混合物中，轻轻吹打混匀（TransIT-LT1试剂与DNA的比例为每1 μg DNA加入3 μl TransIT-LT1试剂）。
- 在室温下孵育30分钟，然后逐滴加入细胞中。
2. 流式细胞术、蛋白质印迹和免疫荧光的细胞制备
- 转染后24小时，在收集细胞前，于落射荧光显微镜下观察荧光表达情况。
- 流式细胞术分析的细胞制备：
- 用0.5 ml/2 ml预冷的PBS洗涤24孔板/6孔板中的细胞。
- 使用50 μl/250 μl 0.05%胰蛋白酶消化并解离细胞。
- 加入200 μl/1 ml DMEM培养基以中和胰蛋白酶活性。
- 将细胞悬液于500 × g离心5分钟，收集250 μl细胞（适用于24孔板和6孔板）用于流式细胞术分析，剩余细胞（1 ml）用于Western blot分析。
- 将细胞重悬于250 μl FACS缓冲液 [PBS + 0.5% (w/v) BSA + 2 mM EDTA] 中，置于冰上保存以进行流式细胞术分析。若不能立即进行流式细胞术分析，可将细胞固定于1%多聚甲醛（溶于PBS）中。
- Western blot分析的细胞制备：与流式细胞术分析的细胞制备同步进行。
- 用2 ml预冷的PBS洗涤细胞一次，加入100 μl细胞裂解液[10 mM磷酸钠缓冲液，pH 6.95，150 mM NaCl，5 mM EDTA，5 mM EGTA，1% Triton X-100]裂解细胞。
- 在4 °C条件下，以21,000 × g离心10分钟，收集细胞裂解液。
- 采用Bradford法测定蛋白浓度，按每孔等量蛋白上样进行SDS-PAGE电泳，随后转移至硝酸纤维素膜进行免疫印迹分析。
- 免疫荧光实验的细胞制备：
- 用2 ml PBS洗涤细胞3次，加入1 ml 3.7%多聚甲醛（溶于PBS）于室温固定10分钟，再用2 ml PBS洗涤5分钟，重复3次。
- 将盖玻片用封片剂封固于载玻片上。如有需要，可用指甲油密封盖玻片边缘。
- 将载玻片于4 °C保存，待后续观察。
3. 流式细胞术和免疫荧光显微镜
- 使用配备488 nm、405 nm和642 nm固态激光器的Beckman Coulter Cyan ADP进行流式细胞术。数据采集与分析采用Summit软件。
- 使用标准微球校准流式细胞仪。
- 以线性刻度绘制前向散射光（FSC）/侧向散射光（SSC），用于圈选活细胞群体。
- 绘制FSC/电压脉冲宽度，用于圈选非聚集的活细胞群体。
- 以对数刻度绘制计数/FL6（CFP荧光，405 nm），用于圈选非聚集的CFP阳性活细胞。
- 以对数刻度绘制计数/FL1（YFP荧光，488 nm），用于检测BiFC信号强度。
- 运行YFP-CFP-双阴性样本，调节FSC、SSC、FL1和FL6光电倍增管（PMT）电压，设定各信号的阈值。
- 运行单阳性（YFP+和CFP+）样本，用于后续离线补偿分析。
- 至少采集10,000个门控事件（非聚集的活CFP+细胞）用于分析。
- 免疫荧光显微镜检测使用蔡司LSM 510共聚焦显微镜进行。注意：为确保所有数据之间的准确比较，各样本之间的设置（如放大倍数、针孔大小、探测器增益、放大器偏移、帧尺寸、扫描速度、扫描平均次数和激光功率）必须保持一致。
4. 数据分析（使用 Summit 软件进行）
- 建立与采集相似的分析方案，并进行适当的设门：
在FSC/SSC点图中设门1，圈选活细胞。
在门1的FSC/脉宽图中设门2，圈选非聚集的活细胞。
在门2的计数/CFP图中设门3，圈选非聚集的CFP+活细胞。 - 使用YFP+和CFP+单阳性细胞对YFP和CFP信号进行补偿。
- 重新确定CFP/YFP阳性细胞的阈值线。
- 将CFP+细胞的YFP平均荧光强度（MFI）导出至Excel用于数据作图。
- 根据Western blot测定的AKAP-Lbc、PDE4D3及上样对照α-tubulin的表达水平，对YFP MFI进行归一化处理。
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结果
AKAP-Lbc 和 PDE4D3 构建体（图 1B）分别与 VN 和 VC 片段融合。AKAP-Lbc 与 PDE4D3 的相互作用可产生功能性 YFP 荧光（图 1A）。本文采用双分子荧光互补（BiFC）方法绘制 PDE4D3 中 AKAP-Lbc 的结合位点。上游保守区 1（UCR1）、上游保守区 2（UCR2）和催化区（CAT）在 PDE4 家族蛋白中高度保守，因此，使用全长（FL）、UCR1 以及 UCR2 加 CAT 片段筛选 PDE4D3 与 AKAP-Lbc 的结合位点。在 HEK 293T 细胞中表达 VN-AKAP-Lbc 与 VC-PDE4D3 片段可产生不同强度的荧光信号（图 1C）。BiFC 结果表明，UCR1 和 UCR2+CAT 均参与 PDE4D3 与 AKAP-Lbc 的相互作用。AKAP-Lbc 与 UCR1 相互作用产生的荧光强度高于 AKAP-Lbc 与 UCR2+CAT 的相互作用，表明 PDE-UCR1 与 AKAP-Lbc 的结合能力强于 PDE-UCR2+CAT。
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讨论
BiFC 是一种简单且灵敏的蛋白质-蛋白质相互作用研究方法。该方法不能用于发现新的蛋白质-蛋白质相互作用，但特别适用于在细胞内确认蛋白质-蛋白质相互作用并研究其功能特性，例如蛋白质复合物的亚细胞定位、蛋白质-蛋白质相互作用位点的定位，以及筛选能够调节蛋白质-蛋白质相互作用的小分子/多肽。由于 VN 和 VC 片段本身不具荧光，背景荧光较低，从而提高了该检测方法的灵敏度。VN-蛋白质-VC-蛋白质相互作用需要一定时间成熟/稳定，因此观察蛋白质-蛋白质相互作用存在延迟，最佳观察时间点可能需要通过实验经验确定。还应注意的是，VN-蛋白质-VC-蛋白质相互作用不可逆，因此遗憾的是，使用当前的 Venus BiFC 构建体时，该方法不适用于研究蛋白质-蛋白质相互作用的动态动力学过程。
适当的对照对于BiFC分析至关重要。合适的阴性对照包括在相应的BiFC载体中表达不相互作用的蛋白质或非特异性肽段，或者如果可能，使用破坏蛋白-蛋白相互作用的突变体。空的BiFC载体不是良好的对照，因其会导致非特异性的高背景荧光。如果在两种相互作用蛋白之间未观察到BiFC信号，应分析其表达情况。此外，BiFC信号...
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
感谢伊利诺伊大学芝加哥分校（UIC）O'Bryan 实验室对本研究的实验评估与深入讨论。本研究由美国心脏协会资助项目11SDG5230003（资助对象：GKC）以及美国国立卫生研究院国家转化科学促进中心—UIC临床与转化科学中心资助项目UL1TR000050支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 试剂 | |||
| Dulbecco’s 改良 Eagle’s 培养基（DMEM） | Invitrogen | 11965-092 | |
| 青霉素-链霉素（青/链），100 倍浓度 | Invitrogen | 15070-063 | |
| 胎牛血清（FBS） | Invitrogen | 16000-044 | |
| 抗 Flag 抗体 | Sigma | M2, F1804 | |
| 抗 HA 抗体 | Covance | 16B12, MMS-101R | |
| α-微管蛋白 | Sigma | DM1A, T9026 | |
| 抗 GFP 抗体 | Clontech | 632569 | |
| 细胞培养板，6 孔，组织培养处理 | Thermo Fisher Scientific | 130184 | |
| HEK 293T 细胞 | ATCC | CRL-11268 | |
| 质粒大量提取试剂盒，高速型 | Qiagen | 12663 | |
| Dulbecco’s 磷酸盐缓冲液（DPBS），无菌 1× | Invitrogen | 14190-144 | |
| 胰蛋白酶-EDTA，0.05%（w/v） | Gibco | 25300 | |
| 用于流式细胞术染色的聚苯乙烯圆底管 | BD Biosciences | 352052 | |
| 多聚甲醛 | Fisher Scientific | S74337MF | |
| 含 DAPI 的 Prolong Gold 抗荧光淬灭封片剂 | Invitrogen | P-36931 | |
| Superfrost Plus 显微镜载玻片 | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Fisherfinest Premium 盖玻片 | Fisher Scientific | 12-548-5P | |
| 设备 | |||
| CO2 气套式培养箱 | NuAIR DH autoflow | ||
| 共聚焦显微镜 LSM510 META | Carl Zeiss, Inc | ||
| 电泳及转膜装置 | Biorad | ||
| Cyan ADP 流式细胞仪 | Beckman Coulter |
参考文献
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- Stumpf, M. P., et al. Estimating the size of the human interactome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 6959-6964 (2008).
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重印与许可
